基于HMGB1/Beclin-1信號通路探討溫陽利水通絡(luò)法對腎病綜合征模型小鼠TNF-α、IL-4、IL-8的作用機(jī)制①

吳鵬公 敏黃琳 曾冬梅 吳洪皓 邱家廷（江西省贛州市中醫(yī)院，贛州 341000）

腎病綜合征是由感染、遺傳、免疫等多種病因引起的臨床腎臟疾病綜合征，其主要臨床癥狀表現(xiàn)為大量蛋白尿、低蛋白血癥、水腫和高脂血癥等［1-3］。腎病綜合征往往伴有腎小球?yàn)V過膜損傷、腎小球基膜通透性增加等病理生理狀態(tài)，其病因復(fù)雜多變，患病率和發(fā)病率也呈逐年增長趨勢［4-5］。micro RNAs是一種小型非蛋白質(zhì)編碼的單鏈RNA，在組織中轉(zhuǎn)錄調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)。相關(guān)資料記錄到，microRNA參與了包括細(xì)胞發(fā)育、凋亡和自噬在內(nèi)的一系列過程［6-7］?，F(xiàn)有研究表明，miR-141與HMGB1/Beclin-1間的平衡是影響腎病綜合征發(fā)生發(fā)展的重要原因［8］。腎病綜合征的治療以糖皮質(zhì)激素、烷基化劑及環(huán)孢霉素等免疫抑制劑預(yù)防、延緩腎功能進(jìn)行性惡化為主，這些療法雖能緩解臨床癥狀、預(yù)防并發(fā)癥，但均出現(xiàn)不良反應(yīng)［9］。目前，中醫(yī)藥在治療腎病綜合征上具有一定的優(yōu)勢。溫陽利水通絡(luò)法是中醫(yī)藥方，具有溫陽利水的功效，本文旨在研究溫陽利水通絡(luò)法調(diào)控HMGB1/Beclin-1信號通路對腎病綜合征的治療效果及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物30只小鼠［許可證號：SCXK（京）2016-0006；倫理號：IACUC-DWZX-2020-627］，雄性，SPF級，體質(zhì)量（30±2）g，購于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物基地，集體飼養(yǎng)，鼠籠安靜整潔，室內(nèi)溫度保持在15~25℃，空氣流通干燥。

1.1.2 藥品及試劑茯苓30 g、黃芪30 g、銀杏葉20 g、附子15 g、白術(shù)15 g、赤芍15 g、紅參10 g、豬苓10 g、川芎10 g、干姜10 g、甘草6 g，置于涼水中浸泡1 h，煎煮30 min后濃縮為2 g/ml。鹽酸阿霉素（25316-40-9，深圳萬樂藥業(yè)有限公司），兔抗小鼠HMGB1抗體，山羊抗小鼠Beclin-1抗體，兔抗小鼠LC3（英國Abcam公司）；TNF-α、IL-4、IL-8 ELISA Kits（北京百智生物科技公司）。

1.1.3 儀器全自動生化分析儀（BK-200，江蘇英諾華醫(yī)療技術(shù)有限公司）；裂解液（NONE6960，上海申友生物公司）；染色試劑盒（G1120-100，北京索萊寶科技有限公司）；光學(xué)顯微鏡（XTL，美國Nikon公司）；包埋機(jī)（BK-TEⅠ，LEICA公司）；烤片機(jī)（E0991，Leica公司）；切片機(jī)（E0974，Leica公司）；酶標(biāo)儀（BIOBASE-EL10A，上海閃譜生物科技公司）；蛋白電泳儀（112-0830，美國Bio-Rad公司）；轉(zhuǎn)膜儀（TY-20101，上海天能科技有限公司）；高速離心機(jī)（TG-16W-Ⅰ，Eppendorf公司）；凝膠成像儀（LGDL-96，美國Life Technology公司）

1.2 方法

1.2.1 動物造模模型組和溫陽利水通絡(luò)法組小鼠采用尾靜脈注射6.5 mg/kg鹽酸阿霉素建立腎病綜合征模型，小鼠24 h尿蛋白明顯增加即為建模成功，對照組小鼠注射等劑量生理鹽水。造模結(jié)束后第5天開始用藥，溫陽利水通絡(luò)法組小鼠20 g/（kg·d）灌胃（溫陽利水通絡(luò)法共煎制200 g）。根據(jù)臨床實(shí)際，選擇小鼠與人的等效劑量的倍數(shù)為5.98。處方總劑量200 g，如果給體質(zhì)量60 kg的成人每日服用1劑，即成人劑量3.33 g/（kg·d），則小鼠等效劑量為19.93 g/（kg·d），約為20 g/（kg·d），對照組、模型組小鼠采用同劑量蒸餾水灌胃，1次/d，連續(xù)3周。

1.2.2 檢測小鼠腎功能指標(biāo)取小鼠血、尿樣，檢測肌酐（creatinine，CRE）、尿素氮（blood urea nitro?gen，BUN）及24 h尿蛋白量。

1.2.3 HE染色觀察小鼠腎組織病理變化給藥停止24 h后，小鼠腹腔注射戊巴比妥斷頭處死，取其腎組織，在10%福爾馬林中固定48 h，經(jīng)過脫蠟、包埋、切片，切片水化后制成玻片標(biāo)本，加入Mayer's蘇木精在室溫下孵育10 min，加入0.5%曙紅溶液室溫下孵育3 min，鏡下觀察。

1.2.4 腎組織病理評分0分：腎組織各部分正常，沒有腫大及炎癥；1分：腎組織各部分不清晰，出現(xiàn)輕微腫大及炎癥情況；2分：腎組織出現(xiàn)嚴(yán)重腫大，炎癥反應(yīng)明顯；3分：腎組織損傷明顯，邊界不明，炎癥加劇。

1.2.5 小鼠TNF-α、IL-4、IL-8表達(dá)血樣離心取上清液，檢測TNF-α、IL-4、IL-8水平。

1.2.6 Western blot檢測小鼠腎組織相關(guān)蛋白表達(dá)水平腎組織裂解緩沖，測定總蛋白。電泳分離等量蛋白質(zhì)，4℃下添加一抗孵育過夜，洗滌后添加二抗，顯影后分析蛋白水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS21.0分析數(shù)據(jù)，以±s記錄，采用t或F檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎功能指標(biāo)模型組小鼠CRE、BUN、24 h尿蛋白量高于對照組；溫陽利水通絡(luò)法組CRE、BUN、24 h尿蛋白量低于模型組，見表1。

表1 腎功能指標(biāo)水平（±s，n=10）Tab.1 Renal function index level（±s，n=10）

表1 腎功能指標(biāo)水平（±s，n=10）Tab.1 Renal function index level（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Groups Control Model Wen Yang Li Shui Draining F P CRE/（mg·dl-1）0.53±0.06 1.49±0.201）0.72±0.092）150.614 0.000 BUN/（mg·dl-1）18.02±2.31 47.06±4.631）24.93±4.022）160.617 0.000 24 h urine protein level/（mg·dl-1）24.02±3.03 79.35±4.711）35.85±3.632）571.416 0.000

2.2 腎組織病理對照組小鼠腎小球，腎小囊清晰可見，無異常（圖1A）；模型組小鼠腎小球形態(tài)異常腫大，腎小囊皺縮，基底膜加厚伴系膜基質(zhì)變多，邊界模糊（圖1B）；溫陽利水通絡(luò)法組小鼠腎小球形態(tài)改善，腫大減小，腎小囊皺縮緩解（圖1C）。

圖1 腎組織病理變化（×200）Fig.1 Pathological changes of kidney tissue（×200）

2.3 腎組織病理評分模型組小鼠腎組織病理評分增加高于對照組；溫陽利水通絡(luò)法組腎組織病理評分低于模型組，見表2。

表2 腎組織病理評分（±s，n=10）Tab.2 Renal histopathological score（±s，n=10）

表2 腎組織病理評分（±s，n=10）Tab.2 Renal histopathological score（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Groups Control Model Wen Yang Li Shui Draining F P Renal histopathological score 0.19±0.08 2.66±0.321）0.87±0.212）321.654 0.000

2.4 TNF-α、IL-4、IL-8水平模型組小鼠TNF-α、IL-4、IL-8表達(dá)高于對照組；溫陽利水通絡(luò)法組TNF-α、IL-4、IL-8表達(dá)低于模型組，見表3。

表3 TNF-α、IL-4、IL-8水平（±s，n=10）Tab.3 Levels of TNF-α，IL-4 and IL-8（±s，n=10）

表3 TNF-α、IL-4、IL-8水平（±s，n=10）Tab.3 Levels of TNF-α，IL-4 and IL-8（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Groups Control Model Wen Yang Li Shui Draining F P TNF-α/（ng·ml-1）0.21±0.14 1.35±0.181）0.51±0.122）161.758 0.000 IL-4/（ng·ml-1）0.19±0.08 1.12±0.361）0.38±0.132）48.231 0.000 IL-8/（ng·ml-1）0.32±0.17 1.55±0.311）0.56±0.212）73.779 0.000

2.5 腎組織相關(guān)蛋白表達(dá)模型組小鼠HMGB1、LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)高于對照組；溫陽利水通絡(luò)法組HMGB1、LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)低于模型組，見表4、圖2。

圖2 相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of related proteins

表4 相關(guān)蛋白表達(dá)（±s，n=10）Tab.4 Related protein expression（±s，n=10）

表4 相關(guān)蛋白表達(dá)（±s，n=10）Tab.4 Related protein expression（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Groups Control Model Wen Yang Li Shui Draining F P HMGB1 0.11±0.05 0.71±0.151）0.34±0.112）75.436 0.000 LC3 0.19±0.11 0.82±0.281）0.40±0.132）28.288 0.000 Beclin-1 0.20±0.09 0.95±0.101）0.47±0.232）60.979 0.000

3 討論

腎病綜合征是表現(xiàn)為蛋白尿、低蛋白血癥、水腫、高脂血癥的腎臟疾病的臨床綜合征，該病的發(fā)病原因多種多樣，發(fā)病機(jī)制也不盡相同，涉及炎癥反應(yīng)、微循環(huán)障礙、代謝異常等多個方面［10-12］?，F(xiàn)今的臨床治療以激素類藥物為主，多數(shù)患者療效不佳，并且一部分患者長期服用激素類藥物還會產(chǎn)生較大的依賴性，一旦停止服藥，病情就會加劇反彈［13］。腎臟相關(guān)的疾病大多與腎間質(zhì)的損傷密切相關(guān)，其中腎臟損害、腎功能減退的主要表現(xiàn)是尿蛋白，同時也是腎病綜合征的顯著表現(xiàn)，并會導(dǎo)致腎小管間質(zhì)損傷［14］。中醫(yī)學(xué)將腎病綜合癥歸屬于“水腫”“虛勞”等范疇，其發(fā)病機(jī)制主要是肺、脾及腎臟功能失調(diào)，其本質(zhì)是腎元虧虛，治療原則當(dāng)屬疏風(fēng)行水、運(yùn)脾化濕、活血化瘀、利濕解毒等［15］。人體的水液代謝與腎、脾、肺的氣化調(diào)節(jié)密不可分，氣為陽，腎主水，水液代謝與腎陽的盛衰緊密相關(guān)，溫陽利水通絡(luò)法能夠治療脾腎陽虛型水腫，其臨床療效得到廣泛肯定。研究表明，miR-141與HMGB1/Beclin-1間的平衡是影響腎病綜合征發(fā)生發(fā)展的重要原因［8］。本文旨在研究溫陽利水通絡(luò)法調(diào)控HMGB1/Beclin-1信號通路對腎病綜合征的治療效果及作用機(jī)制。

自噬這一過程在機(jī)體內(nèi)廣泛進(jìn)行，自體細(xì)胞或細(xì)胞部分被吞噬后被攜裹至囊泡中，溶酶體與其結(jié)合為自噬溶酶體，滿足細(xì)胞自體代謝及更新，保證內(nèi)環(huán)境與細(xì)胞代謝互相制衡［16］。相關(guān)資料記載，miR-141能夠與HMGB1結(jié)合，通過靶向抑制HMGB1的表達(dá)截斷HMGB1/Beclin-1信號通路，減輕急性腎損傷誘導(dǎo)產(chǎn)生的腎病綜合征，生理情況下的自噬并不會誘導(dǎo)腎病綜合征的發(fā)生發(fā)展［15］。但患者體內(nèi)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時，外周血中各種類型白細(xì)胞的比值會產(chǎn)生變化，嚴(yán)重時會導(dǎo)致免疫失衡［17］。相關(guān)資料表明，在TNF-α、IL-4、IL-8的調(diào)節(jié)控制下多個信號通路對炎癥反應(yīng)起作用［18-19］。本文通過實(shí)驗(yàn)對溫陽利水通絡(luò)法、腎病綜合征及HMGB1/Beclin-1信號通路、TNF-α、IL-4、IL-8進(jìn)行探索。留取小鼠靜脈血以及尿液來檢測小鼠腎功能指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠CRE、BUN、24 h尿蛋白量水平明顯高于對照組，證明造模后小鼠腎功能損傷，通過檢測發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠TNF-α、IL-4、IL-8水平升高，病理圖也證實(shí)模型組小鼠腎組織出現(xiàn)損傷，腎小球腫大，腎小囊皺縮，邊界不清晰，是明顯的炎癥反應(yīng)，腎組織病理評分也出現(xiàn)異常升高，這提示小鼠模型建立成功，經(jīng)過溫陽利水通絡(luò)法治療后，小鼠腎功能指標(biāo)水平下降，腎組織炎癥反應(yīng)得以緩解，腎小球腫脹縮小，腎小囊皺縮減弱，腎組織病理評分下降，TNF-α、IL-4、IL-8也下降，提示溫陽利水通絡(luò)法能夠改善小鼠腎功能異常情況，緩解腎組織炎癥反應(yīng)，可通過調(diào)控腎病綜合征大鼠的機(jī)體免疫改變，發(fā)揮抗炎作用。

Beclin-1是自噬基因［20］。HMGB1與細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、重組和基因組穩(wěn)定性等密切相關(guān)，對于炎癥、免疫反應(yīng)、自噬及癌癥也有調(diào)節(jié)控制作用［21］。相關(guān)研究指出，HMGB1可以誘導(dǎo)Beclin-1于Beclin-2中分離，并促進(jìn)Beclin-1與Ⅲ型磷酸肌醇3激酶結(jié)合，激活自噬［22］。miR-141能夠在HMGB1 mRNA的啟動子上結(jié)合HMGB1受體從而阻斷其表達(dá)，進(jìn)而抑制HMGB1/Beclin-1通路阻斷激發(fā)自噬體過程，但其在腎病綜合征中是否也存在尚不可知［23］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腎病綜合征小鼠造模完成后，小鼠腎組織出現(xiàn)明顯炎癥變化，且蛋白表達(dá)上升，表明HMGB1/Beclin-1信號通路與腎病綜合征密切相關(guān)，而經(jīng)過溫陽利水通絡(luò)法治療后，小鼠腎組織中HMGB1、LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)下降，證明溫陽利水通絡(luò)法能夠調(diào)控HMGB1/Beclin-1信號通路，對于腎病綜合征中腎臟的損傷、炎癥情況及臨床癥狀都具有重要意義。

綜上所述，溫陽利水通絡(luò)法能夠調(diào)節(jié)控制HMGB1/Beclin-1信號通路作用于TNF-α、IL-4、IL-8水平，對于腎臟功能、腎臟損傷、炎癥反應(yīng)等也具備調(diào)節(jié)控制作用，同時指出miR-141可能與腎病綜合征關(guān)系密切，需進(jìn)一步深入討論。