重樓皂苷Ⅰ對脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷的保護作用研究

曹銀利 孫亞洲 崔清洋 何曉敬 唐成和（新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院新生兒科，新鄉(xiāng) 453000）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）及其并發(fā)癥急性呼吸窘迫綜合征是臨床常見的急危重癥，具有高發(fā)病率和病死率［1-2］。目前除了保護性機械通氣外暫無更好的藥物治療，因此研發(fā)安全有效的治療藥物具有重要意義［3］。越來越多的證據表明，氧化應激是影響ALI嚴重程度的關鍵途徑［4］。此外，氣道炎癥也在ALI的發(fā)病機制中起重要作用［5］。因此，抑制炎癥和/或氧化應激可能是預防和治療ALI的潛在策略。重樓皂苷Ⅰ（polyphyllinⅠ，PPⅠ）是重樓中的重要活性和抗腫瘤成分。之前的報道顯示，PPⅠ通過抑制腫瘤的增殖和生長，在多種癌癥中具有抗癌作用［6-8］。最近研究表明，PPⅠ還可以防止心肌缺血再灌注損傷，顯著抑制炎癥細胞因子的分泌并抑制P65的易位［9-10］。但PPⅠ對脂多糖（lipo?polysaccharide，LPS）誘導的ALI的影響尚未見報道。本研究主要觀察PPⅠ對LPS誘導的ALI小鼠肺組織病理損傷、炎癥反應和氧化應激的調節(jié)作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與試劑48只SPF級C57BL/6雄性小鼠，6~8周齡，體質量20~25 g，購自河南省實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（豫）2017-0001。PPⅠ（B21668，HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；地塞米松（DEX，D1756）、LPS（貨號：L2630）（美國Sigma公司）；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（貨號：C0105）、比辛酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（貨號：P0012）、ECL發(fā)光液（貨號：P0018S）和RIPA裂解緩沖液（貨號：P0013B）（碧云天生物公司）；p38（#8690）、p-p38（#4511）、NLRP3（#15101）、caspase-1（#24232）、AMPK（#5831）、p-AMPK（#2535）、Nrf2（#12721）、KEAP1（#8047）、GAPDH（#5174）和辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG（#7074）（美國CST公司）；一氧化氮（nitric oxide，NO）測定試劑盒（貨號A013-2-1）、超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）試劑盒（貨號：A001-3-2）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（貨號：A003-1-2）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒（貨號：A044-1-1）、TNF-α（H052-1）、IL-1β（H002）和IL-6（H007）ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.1.2 儀器 凝膠成像系統(tǒng)（型號Gel Doc XR+，美國Bio-Rad公司）；光學顯微鏡（型號RX51，日本奧林巴斯公司）；多功能紫外酶標儀（型號EPOCH2，上海玉博生物科技有限公司）；高速離心機（型號5424R，德國Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、建模及給藥C57BL/6小鼠在25℃、50%濕度，光照12 h/12 h光/暗環(huán)境下適應性喂養(yǎng)1周。將小鼠隨機分為6組（n=8）：對照組、LPS組、PPⅠ5 mg/kg組、PPⅠ10 mg/kg組、PPⅠ20 mg/kg組和地塞米松（DEX）組。PPⅠ治療組小鼠造模前7 d每天灌胃相應劑量的PPⅠ，對照組和LPS組給予同體積的生理鹽水，DEX組灌胃2 mg/kg DEX。末次給藥1 h后LPS組和PPⅠ組鼻腔滴入LPS（5 mg/kg），對照組腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2 樣品采集與處理滴鼻建模24 h后，用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）灌洗肺收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），4℃、3 000 r/min離心10 min，收集上清液，用BCA法定量測定其中總蛋白濃度。用100μl PBS重懸沉淀，滴于載玻片上，并用瑞氏-姬姆薩復合染色液染色5 min，使用血細胞計數儀確定總白細胞計數和巨噬細胞數。然后處死小鼠，取肺部組織進行檢測。將小鼠肺右上葉浸入4%多聚甲醛中，固定24 h，石蠟包埋，脫水，切成5μm切片；手術切取小鼠右下葉，保存于液氮中。

1.2.3 肺濕/干重（W/D）值測定分離小鼠左肺，稱重得肺濕重（W），將左肺置于80℃的烘箱中，干燥48 h后，稱重得肺干重（D），計算肺W/D值。

1.2.4 HE染色觀察肺組織病理變化將石蠟切片用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，然后用蘇木精染色5 min，伊紅染色2 min，封片并在光學顯微鏡下觀察肺組織病理學變化?；趪乐爻潭龋ㄕ?0分，微小變化=1分，輕度變化=2分，中度變化=3分，重度變化=4分）記錄肺損傷評分。評估依據包括中性粒細胞浸潤、肺部間質水腫和肺泡出血［11］。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達RIPA裂解液提取保存于液氮中的大鼠肺組織總蛋白，BCA測定總蛋白濃度。每孔上樣量40μg，用SDS-PAGE分離并電轉至PVDF膜，室溫下用5%脫脂奶粉液封閉膜2 h，加入一抗GAPDH（1∶1 000）、p38（1∶1 000）、p-p38（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）、caspase-1（1∶1 000）、AMPK（1∶1 000）、p-AMPK（1∶1 000）、Nrf2（1∶1 000）和KEAP1（1∶1 000）抗體，4℃孵育過夜，加HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶3 000），室溫孵育2 h，洗膜，ECL發(fā)光顯色，拍照。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.6檢測肺組織BALF中炎癥因子水平按照試劑盒的說明使用ELISA法測定BALF樣品上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。

1.2.7 檢測肺組織BALF中SOD和MDA含量根據試劑盒說明，使用NO、MPO、SOD、MDA測定試劑盒分別在酶標儀550 nm、460 nm、450 nm、532 nm處測量吸光度值，以計算NO、MPO、SOD和MDA含量。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數據以±s表示。采用單因素方差分析（ANOVA）對多組間結果進行比較，用t檢驗確定實驗組間差異的意義。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PPⅠ對LPS誘導肺組織病理學變化的影響對照組小鼠肺組織結構正常，LPS組肺組織出現顯著的病理變化，如炎癥細胞浸潤、肺間質出現水腫，PPⅠ（10 mg/kg和20 mg/kg）或DEX處理明顯改善了LPS誘導的病理損傷，炎癥細胞浸潤減少，見圖1A。與對照組比較，LPS組小鼠肺損傷評分提高（P<0.01），與LPS組比較，PPⅠ（10 mg/kg和20 mg/kg）組和DEX組肺損傷評分降低（P<0.05，P<0.01），見圖1B。

圖1 PP Ⅰ對LPS誘導的肺組織病理學變化的影響Fig.1 Effect of PP Ⅰon LPS-induced lung histopathologi?cal changes

2.2 PPⅠ對LPS誘導的肺水腫和BALF中蛋白含量的影響與對照組比較，LPS刺激后小鼠肺W/D值升高（P<0.01），PPⅠ（10 mg/kg和20 mg/kg）或DEX治療顯著降 低LPS誘導的 肺W/D值（P<0.05），見圖2A。如圖2B~D所示，與對照組相比，LPS組總蛋白含量、白細胞和巨噬細胞數量均顯著增加（P<0.01），PPⅠ（10 mg/kg和20 mg/kg）或DEX治療顯著減少總蛋白含量、白細胞和巨噬細胞數量（P<0.05，P<0.01）。

圖2 PP Ⅰ對LPS誘導的肺損傷的影響Fig.2 Effect of PP Ⅰon LPS-induced lung injury

2.3 PPⅠ對LPS誘導的肺部氧化損傷的影響與對照組相比，LPS顯著誘導BALF中的NO、MPO和MDA產生，降低SOD的含量（P<0.01）。與LPS組比較，PPⅠ（10 mg/kg和20 mg/kg）或DEX處理顯著減少NO、MPO和MDA的含量，并增加SOD的產生（P<0.05，P<0.01），見圖3。

圖3 PP Ⅰ對LPS誘導的肺部氧化損傷的影響Fig.3 Effect of PP Ⅰon LPS-induced lung oxidative injury

2.4 PPⅠ抑制LPS誘導的BALF中促炎癥因子的分泌與對照組比較，LPS誘導后小鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高（P<0.01），與LPS組比較，PPⅠ（10 mg/kg和20 mg/kg）組和DEX組TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低（P<0.05，P<0.01），見圖4。

圖4 PP Ⅰ對LPS誘導的BALF中促炎因子分泌的影響Fig.4 Effect of PP Ⅰon LPS-induced secretion of proinflammatory cytokines in BALF

2.5 PPⅠ抑制p38-NLRP3/caspase-1信號通路的激活與對照組相比，p38磷酸化水平和NLRP3、cas?pase-1的表達在LPS刺激后顯著增加（P<0.01）?？俻38的表達水平在LPS刺激后未改變。相反，PPⅠ（10 mg/kg和20 mg/kg）或DEX處理后可以顯著抑制LPS誘導的p38-NLRP3/caspase-1信號傳導途徑的磷酸化（P<0.05，P<0.01），見圖5。

圖5 PP Ⅰ對p38-NLRP3/caspase-1信號通路的影響Fig.5 Effect of PP Ⅰon p38-NLRP3/caspase-1 signaling pathway

2.6 PPⅠ對AMPK-Nrf2/KEAP1信號通路的影響與對照組相比，LPS刺激后p-AMPK和Nrf2的表達顯著下調（P<0.01），KEAP1的表達顯著上調（P<0.01）。PPⅠ（10 mg/kg和20 mg/kg）或DEX的治療顯著增加了AMPK的磷酸化和Nrf2的表達，并減少了KEAP1的表達（P<0.05，P<0.01），見圖6。

圖6 PP Ⅰ對AMPK-Nrf2/KEAP1信號通路的影響Fig.6 Effect of PP Ⅰon AMPK-Nrf2/KEAP1 signaling pathway

3 討論

ALI是肺泡上皮細胞和由各種直接或間接損傷因子引起的血管內皮細胞損傷，其特征在于肺部間質和肺泡水腫及炎癥細胞浸潤［12］。LPS是革蘭氏陰性菌的主要成分，會導致膿毒癥綜合征，并伴有ALI的重要特征，包括過度的炎癥反應［13］。因此，LPS常用作誘導ALI損傷模型。在本研究中，LPS誘導肺W/D值和總蛋白含量的增加，這是肺水腫的基本標志，PPⅠ可顯著降低肺W/D值和BALF中的蛋白含量［14］。LPS刺激產生的促炎細胞因子可以激活內皮細胞產生更多的黏附分子。因此，肺泡嗜中性粒細胞、白細胞和巨噬細胞被募集到肺部，導致急性肺炎的發(fā)生［15］。本研究中，PPⅠ顯著減輕LPS誘導的肺泡結構破壞、肺泡腔出血和炎癥細胞浸潤，降低BALF中的白細胞和巨噬細胞數。因此，PPⅠ能夠治療LPS誘導的ALI。

SOD可有效清除有害自由基，防止氧化應激。相反，中性粒細胞和脂質過氧化的過度積累分別產生MPO和MDA，導致氧化應激反應［16］。同時，NO的過量產生可能導致過氧亞硝酸鹽形成，進而引起肺微血管通透性增加，產生細胞毒性作用。因此，抑制NO的產生可以減弱LPS刺激的ALI［17］。LPS誘導的ALI的關鍵特征是炎癥介質的釋放，例如TNF-α和IL-β，其可以激活初始炎癥級聯(lián)并增強肺損傷［18］。HUANG等［19］研究表明PPⅠ通過增加SOD、GSH和IL-10的水平，降低ROS、MDA、TNF-α和IL-6水平緩解心肌缺血再灌注損傷。本研究結果表明，PPⅠ治療可以顯著抑制BALF中NO、MPO和MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6的產生，促進SOD的產生。因此，PPⅠ能夠抑制LPS誘導的小鼠肺組織炎癥反應和氧化應激損傷。

p38途徑參與了LPS的內毒性作用，介導TNF-α和IL-1β等細胞因子的產生，抑制p38的磷酸化對肺泡毛細血管屏障滲透具有保護作用［20］。NLRP3炎癥小體是一種主要的細胞內炎癥途徑，并且當它被激活時，IL-1β的分泌和caspase-1的表達增加［21］。本研究結果表明，p38-NLRP3/caspase-1信號傳導途徑在LPS誘導的ALI中被激活。然而，PPⅠ可顯著下調p-p38、NLRP3和caspase-1的表達。AMPK可通過磷酸化導致Nrf2核轉錄的積累，減輕LPS誘導的ALI［22］。在無壓力條件下，Nrf2與KEAP1結合；在暴露于應激源時，Nrf2從KEAP1中釋放并易位到細胞核中，誘導抗氧化酶的表達［23-24］。本研究結果顯示PPⅠ明顯下調KEAP1的表達，上調p-AMPK和Nrf2的表達。因此PPⅠ可能通過抑制p38-NLRP3/caspase-1途徑抑制炎癥因子的分泌，通過激活AMPK/Nrf2途徑誘導抗氧化酶的表達，從而減輕氧化應激反應。

綜上所述，本研究結果證明了PPⅠ可有效地保護LPS誘導的ALI，抗氧化應激和炎癥損傷，這主要取決于p38-NLRP3/caspase-1信號通路的抑制和AMPK/Nrf2途徑的激活。本研究數據證明了PPⅠ作為治療LPS誘導的ALI潛在的可能性。