哮喘痰熱郁肺證大鼠模型初建及評價

王浩，張露，王禹清，張慶祥

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250355）

哮喘是由多種炎癥細胞及細胞組分介導(dǎo)的氣道慢性炎癥性疾病，以喘促、胸悶和（或）咳嗽為主要臨床表現(xiàn)［1］。哮喘屬“哮病”“喘證”的范疇［2］，其病機為痰阻氣滯，肺失宣降。據(jù)統(tǒng)計［3］，我國有近3 000 萬支氣管哮喘患者，病死率為36.7/10 萬，且兒童患哮喘人數(shù)逐年上升，急性發(fā)作時若得不到有效控制，往往會加重病情［4］。中醫(yī)藥治療哮喘病具有明顯優(yōu)勢，在急性發(fā)作期［5］、慢性持續(xù)期［6］及臨床緩解期［7］均有較好的治療作用，可以減輕發(fā)病癥狀，減少發(fā)病次數(shù)，提高生活質(zhì)量。

隨著社會發(fā)展，人們的飲食、生活習(xí)慣等方面發(fā)生變化，如喜食肥膩、多坐少動等，哮喘痰熱郁肺證患者越來越多，但由于缺乏對應(yīng)的動物模型，其相關(guān)機制尚未被完全闡明。中醫(yī)證候模型研究起步晚、發(fā)展快，經(jīng)歷了從模仿西醫(yī)構(gòu)建病理模型，到根據(jù)中醫(yī)理論構(gòu)建中醫(yī)病因模型，再到多因素復(fù)合制作病證結(jié)合動物模型的過程［8］。復(fù)合多因素制作病證結(jié)合動物模型是中醫(yī)藥理論指導(dǎo)結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論與實驗動物科學(xué)知識，以傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)病因復(fù)制證候動物模型，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病因復(fù)制疾病動物模型，使模型動物同時具有疾病與證候特征［9］，是目前應(yīng)用最多的造模方式。

本研究在哮喘大鼠模型構(gòu)建［10］的基礎(chǔ)上，依據(jù)“脾為生痰之源”“肥者令人內(nèi)熱”“肺與大腸相表里”等中醫(yī)理論，分別施加誘導(dǎo)痰與熱的因素，復(fù)合多因素建立哮喘痰熱郁肺證大鼠模型，為進一步闡明哮喘的發(fā)病及中醫(yī)藥干預(yù)機制提供模型基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級雄性Wistar大鼠36只，體質(zhì)量（150±20）g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。實驗動物使用許可證號：北京SCXK（京）2021－0011。實驗大鼠飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，動物房晝夜12 h光暗變替，相對濕度40%～60%，溫度（23±2）℃，食水自由攝取。實驗動物的使用與操作均符合山東中醫(yī)藥大學(xué)動物保護委員會（編號：SDUTCM20201204001）關(guān)于實驗動物操作與動物福利的要求。

1.1.2 實驗試劑、藥品與儀器

4%多聚甲醛溶液；1%戊巴比妥鈉溶液；卵清白蛋白（美國Sigma 公司，批號：A8040）；氫氧化鋁（上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20200226）；復(fù)方地芬諾酯片（常州康普藥業(yè)有限公司，批號：1701023）；氯化乙酰膽堿（美國Solarbio 公司，批號：G8320）；電子體溫計（OMRON，型號：MC－347）；壓縮空氣霧化器（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司，型號：403K）；動物無創(chuàng)肺功能檢測儀（美國Buxco，型號：FinePointe NAM）。

1.2 造模方法

將36只SPF級Wistar雄性大鼠按照隨機數(shù)字表隨機分為空白組、模型組、定喘湯組，每組各12只。各組大鼠造模前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2.1 哮喘病模型制備

模型組、定喘湯組大鼠分別于造模第1、8、15 天給予腹腔內(nèi)注射抗原液1 mL 致敏，其中每毫升抗原液含卵清白蛋白100 mg及氫氧化鋁100 mg；第21天開始用1%卵清白蛋白霧化激發(fā)，30 min/次，2 次/d，連續(xù)14 d?？瞻捉M大鼠以等量生理鹽水代替抗原液進行腹腔注射和霧化激發(fā)。

1.2.2 痰熱郁肺證模型制備

從第1 天開始，每天予以高脂高糖低纖維飼料（北京科澳協(xié)力飼料有限公司，SCXK（京）2019－0003）喂養(yǎng)，并將自制脂肪乳（每500 mL 含豬油20 g，膽固醇10 g，豬膽鹽2 g，吐溫80 20 mL及1，2丙二醛20 mL）按照5 mL/kg加入造模大鼠日常飲水中。

從第16 天開始，使用復(fù)方地芬諾酯混懸液（15 mg/kg）灌胃，1 次/d，持續(xù)用藥20 d 至實驗結(jié)束；放入恒溫鼓風(fēng)箱［溫度（37±2）℃，濕度35%～45%］施加風(fēng)熱刺激，30 min/次，每天2 次，持續(xù)干預(yù)20 d 至實驗結(jié)束。

1.2.3 藥物干預(yù)

從第22 天開始，定喘湯組予以定喘湯（2.0 g/kg）灌胃，持續(xù)用藥14 d至實驗結(jié)束。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 一般狀態(tài)觀察

觀察3 組大鼠的精神狀態(tài)、活動情況、呼吸狀態(tài)、皮毛狀態(tài)、二便情況；監(jiān)測并記錄體質(zhì)量、體溫、飲食量、飲水量情況。

1.3.2 大鼠肺功能測定

首先對動物無創(chuàng)肺功能檢測儀進行密封校準，然后將清醒狀態(tài)的大鼠放置于大鼠專用腔體內(nèi)固定。通過橡膠膜分隔鼻部氣流與胸部氣流，打開通氣避免大鼠窒息死亡。通過電腦操作，依次向霧化頭內(nèi)滴加PBS緩沖液以及12.5、25、50、100 mg/mL濃度的乙酰膽堿，觀察并記錄各項數(shù)據(jù)。

1.3.3 大鼠肺組織病理標本的制作

取4%多聚甲醛固定好的左肺上葉，進行常規(guī)HE染色切片，光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)改變。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)觀察

空白組大鼠毛發(fā)柔順，精神狀態(tài)良好，體質(zhì)量呈穩(wěn)定增長趨勢，呼吸節(jié)律均勻平穩(wěn)，體溫平穩(wěn)，大小便正常；模型組大鼠毛發(fā)枯燥無光凌亂，精神狀態(tài)差，喜臥少動，抓撓口、鼻頻率高，呼吸聲大，節(jié)律快，部分大鼠甚至可聞及哮鳴音，體溫較高，口鼻處見黏性分泌物，二便量少，小便色黃；定喘湯組大鼠精神狀態(tài)改善，活動較多，呼吸節(jié)律呈現(xiàn)平穩(wěn)狀態(tài)，體溫降低，口、鼻處黏性分泌物減少，二便增多，小便淡黃。

2.2 各組大鼠體溫變化情況比較

造模開始后，模型組和定喘湯組大鼠體溫出現(xiàn)不同程度的升高，表明注射抗原液致敏效果良好，出現(xiàn)炎性發(fā)熱現(xiàn)象。前3 周（第1～22 天）模型組和定喘湯組造模干預(yù)相同，故體溫比較差異不大。自第22 天開始用藥治療后，與模型組比較，定喘湯組大鼠體溫出現(xiàn)明顯降低（P<0.05），表明定喘湯對于造模大鼠體溫變化起到了調(diào)節(jié)作用。結(jié)果見表1和圖1。

圖1 各組大鼠不同時間點體溫變化情況

表1 各組大鼠不同時間點體溫變化情況比較（，℃）

表1 各組大鼠不同時間點體溫變化情況比較（，℃）

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與模型組比較，#P<0.05。

2.3 各組大鼠肺功能情況比較

各組大鼠分別于取材前進行肺功能檢測發(fā)現(xiàn)，大鼠特殊氣道阻力隨激發(fā)藥物濃度升高而增大，其中模型組特殊氣道阻力顯著高于空白組，表明注射抗原液、霧化激發(fā)、風(fēng)熱環(huán)境等干預(yù)因素對肺組織造成了損傷，導(dǎo)致肺功能下降，特殊氣道阻力增大。而定喘湯組特殊氣道阻力低于模型組（P<0.05），表明使用定喘湯治療后，大鼠肺功能有所恢復(fù)，特殊氣道阻力下降。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠特殊氣道阻力變化情況比較［，cm H2O/（L·s）］

表2 各組大鼠特殊氣道阻力變化情況比較［，cm H2O/（L·s）］

注：與空白組比較，***P<0.001；與模型組比較，#P<0.05，###P<0.001。

2.4 各組大鼠肺組織HE染色情況比較

通過大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)顯示，正常組大鼠肺組織支氣管上皮細胞排列緊密，可見少量細支氣管上皮細胞脫落；纖毛排列較為整齊，未發(fā)現(xiàn)增生、腫脹、壞死和脫落等形態(tài)學(xué)改變；支氣管周圍未見明顯的炎性細胞浸潤。模型組大鼠肺組織可見大面積肺泡壁增厚，肺泡腔受擠壓而塌陷，少量肺泡腔融合擴張，伴有淋巴細胞、粒細胞浸潤；少量細支氣管上皮細胞脫落，腔內(nèi)可見嗜酸性物質(zhì)，這一結(jié)果與哮喘病理形態(tài)學(xué)特點相符合。定喘湯組見肺泡壁增厚面積較少，有少量的淋巴細胞、粒細胞，見細支氣管上皮細胞脫落，病理損傷程度較模型組減輕。結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織HE染色圖（×200）

3 討論

3.1 模型評價

哮喘的主要特征包括氣道炎癥、氣道重塑、可逆性氣道阻塞和氣道高反應(yīng)性［11］。本研究通過病理切片觀察肺組織病變情況，可見模型組大鼠出現(xiàn)大面積肺泡壁增厚，肺泡腔受擠壓而塌陷，少量肺泡腔融合擴張，伴有淋巴細胞、粒細胞浸潤；還有少量細支氣管上皮細胞脫落，腔內(nèi)可見嗜酸性物質(zhì)；通過測定大鼠肺功能，可見模型組大鼠特殊氣道阻力明顯升高。結(jié)果表明，模型組大鼠肺功能情況和肺組織病理改變情況符合哮喘的主要特征。

哮喘痰熱郁肺證是由外邪侵襲，郁而化熱，與痰相互搏結(jié)，壅阻于肺所形成，因此常見咳嗽氣喘、胸悶氣短，痰液黏稠，咯吐黃痰甚或痰中帶血，時有心煩、身熱、汗出，舌紅苔黃或黃膩，脈滑數(shù)，小便短澀［12］。本研究模型組大鼠出現(xiàn)體溫升高，喜臥少動，毛發(fā)枯燥凌亂，呼吸加快及節(jié)律性收腹喘促，部分大鼠可聞及哮鳴音，舌紅，口鼻處見黏性分泌物，二便量少，小便色黃，與臨床痰熱郁肺證表現(xiàn)相一致。

定喘湯出自明代張時徹的《攝生眾妙方》，能宣降肺氣、清熱化痰平喘，是治療哮喘常用方［13］。以定喘湯治療造模大鼠，結(jié)果大鼠體溫降低，舌淡紅，口鼻處黏性分泌物減少，小便色淡黃；肺功能改善，特殊氣道阻力降低；肺部病理改變好轉(zhuǎn)，肺泡壁增厚面積減小，炎細胞浸潤情況減輕。表明定喘湯在減輕發(fā)熱，修復(fù)大鼠肺損傷，改善氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性方面發(fā)揮重要作用。

綜上，本研究通過復(fù)合多因素病證結(jié)合造模的方法，建立了符合臨床病證特點的哮喘病痰熱郁肺證大鼠模型，并從大鼠一般行為情況、微觀指標、藥物反證進行評價，表明模型構(gòu)建成功，可為哮喘痰熱郁肺證的深入研究提供依據(jù)。

3.2 痰熱郁肺證造模思考

痰熱證即痰與熱邪相兼為病，臨床上痰熱郁肺證生成的常見內(nèi)因是飲食不節(jié)或過食生冷、肥甘之物，傷及脾臟進而水谷精微不能正常運化，聚液成痰，痰郁日久化熱；外因是機體感受風(fēng)熱之邪氣，蘊于肺中蒸液成痰，痰郁于肺中而成痰熱［14?15］。因此痰與熱邪的誘導(dǎo)是建立模型的重要角度。

哮喘之夙根為體內(nèi)之伏痰［16］，而如何誘導(dǎo)生痰便是動物造模的關(guān)鍵。根據(jù)《素問·奇病論》中“肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿”的論述，肥膩食物可使人陽氣內(nèi)郁而生熱，甘味食物令人中氣不行而脹滿。若長期高脂高糖飲食可導(dǎo)致脾臟過勞而氣虛，不能運化水谷、轉(zhuǎn)輸水液，聚濕成痰，即“脾為生痰之源”。故本實驗以高脂高糖飼料和脂肪乳喂食大鼠，作為誘導(dǎo)痰、熱生成的內(nèi)因。同時，“肺為嬌臟”清虛嬌嫩，易受外邪侵襲，具有“易損”的特點［17］，過冷過熱皆會使其受病。葉天士在《臨證指南醫(yī)案·肺痹》中指出：肺“凡六淫之氣，一有所著，即能致病，其性惡寒惡熱、惡燥惡濕，最畏火風(fēng)。”故本實驗中采用恒溫鼓風(fēng)箱給大鼠施加風(fēng)熱刺激，與飲食因素內(nèi)外相合誘導(dǎo)證候，構(gòu)建痰熱郁肺證。同時飲食刺激所生之痰受熱邪引動而發(fā)病，也會加重哮喘的癥狀，使動物模型病證表現(xiàn)更明顯。

從傳變方面，肺與大腸為相表里之臟腑，二者不僅在生理上互相聯(lián)系，在病理上也會互相影響。《素問·咳論》曰：“肺咳不已，則大腸受之”闡述了肺病及腸的情況。有研究發(fā)現(xiàn)，慢性支氣管炎的肺病動物模型，有胃內(nèi)殘留率升高，小腸推進率以及糞便含水率下降的情況［18］。同樣，腸病也會影響到肺?！饵S帝內(nèi)經(jīng)太素》曰：“邪客大腸及手陽明脈，大腸中熱，大便難，肺氣喘爭”。有研究發(fā)現(xiàn)，腹膜炎大鼠出現(xiàn)了肺間質(zhì)水腫、出血，部分肺泡塌陷、融合的情況［19］?；诖?，本研究從相表里之臟腑在病理上會互相影響的角度入手，用復(fù)方地芬諾酯使大鼠出現(xiàn)“腸熱腑實”的癥狀，進而影響肺，誘導(dǎo)肺內(nèi)郁熱之證候。

3.3 中醫(yī)證候造模思考

中醫(yī)證候模型構(gòu)建從造模因素來看，可分為單因素造模和復(fù)合因素造模；從造模病因特點來看，可以分為西醫(yī)疾病動物模型、證候動物模型以及病證結(jié)合動物模型［20］。本研究采用的是復(fù)合多因素［9］構(gòu)建病證結(jié)合模型的方法，以藥物誘導(dǎo)［21］出現(xiàn)明確、特異的病理效應(yīng)，以多種病因因素誘導(dǎo)出中醫(yī)證候表現(xiàn)。其中，證候造模時應(yīng)以中醫(yī)理論為依據(jù)，注重“證”與“病”相結(jié)合。另外，此模型構(gòu)建過程中增加了相表里之臟腑病理上互相傳變的角度，或可為中醫(yī)證候模型的構(gòu)建提供新思路。