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    指紋圖譜技術(shù)在重樓質(zhì)量控制中的應(yīng)用

    2023-01-24 02:30:28柯昌虎馮協(xié)和潘長(zhǎng)江李志浩
    黑龍江科學(xué) 2022年24期
    關(guān)鍵詞:重樓皂苷指紋

    柯昌虎,馮協(xié)和,潘長(zhǎng)江,李志浩

    (1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院,湖北 十堰 442008; 2.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院,湖北 十堰 442000)

    0 引 言

    重樓(Paridis Rhizoma)為百合科植物云南重樓或七葉一枝花的干燥根莖[1],是我國(guó)重要的藥用資源,是云南白藥系列藥等200余種中成藥的主要成分之一[2],含有甾體皂苷、三萜、黃酮等成分[3-6],具有抗腫瘤[4]、抗氧化[7]、抗菌[8]、抗炎[9]、抗衰老[10]等多重藥理作用,對(duì)多種疾病均有療效。重樓為多年生草本植物,資源再生緩慢,人工種植尚不能滿足市場(chǎng)需求。大量非藥典規(guī)定的重樓植物基源品種的產(chǎn)品充斥商品市場(chǎng),不同產(chǎn)地、不同采收期的重樓品質(zhì)差異大[11],質(zhì)量參差不齊,常規(guī)的鑒別手段難以將其區(qū)分出來。

    指紋圖譜是一種可以鑒別中藥材真?zhèn)?、評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量?jī)?yōu)劣、區(qū)分物種屬性和確保其一致性和穩(wěn)定性的綜合性分析技術(shù)[12],具備專屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性高等指紋特性,可以描述出中藥復(fù)雜體系的整體特征,反映出復(fù)雜組分之間的相互作用,體現(xiàn)出不同產(chǎn)地、不同采收時(shí)期、不同批次中藥的共同特點(diǎn)和特異性,量化分析出中藥多層次的宏觀質(zhì)量信息,在多組分定量、質(zhì)量控制、活性成分篩選、指紋功效關(guān)系研究等方面的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)明顯[13-14],可為中藥材、中成藥、中藥制劑等提供一種綜合性和可量化的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法,并收錄于2020版《中國(guó)藥典》一部中。本研究就指紋圖譜在重樓中的研究成果進(jìn)行綜述。

    1 色譜指紋圖譜

    1.1 高效液相色譜

    高效液相色譜(HPLC)兼有定性和定量作用,廣泛應(yīng)用于中藥材質(zhì)量分析及控制中,選擇性好,重現(xiàn)性和靈敏度高,應(yīng)用覆蓋廣,且色譜柱能夠反復(fù)多次利用,已成為指紋圖譜中使用較多的方法之一[15]。中藥HPLC可根據(jù)不同藥物成分的特點(diǎn)選擇色譜條件,搭配不同的色譜柱和檢測(cè)器,實(shí)現(xiàn)藥材產(chǎn)地、優(yōu)劣、真?zhèn)蔚膮^(qū)分與鑒別。

    羅廷順等[16]采用Thermo BDS Hypersil C18色譜柱,以乙腈-水為流動(dòng)相,對(duì)10個(gè)來自云南各州市縣重樓藥材進(jìn)行HPLC法分析。指紋圖譜中標(biāo)定出13個(gè)共有峰,指認(rèn)出8、9、10和S號(hào)峰分別為重樓皂苷VII、VI、II、I,圖譜相似度為0.851~0.970,表明產(chǎn)地不同的重樓主成分具有良好的一致性。吳鈺穎等[17]采用HPLC法對(duì)產(chǎn)自大理的重樓進(jìn)行分析,色譜柱為Thermore C18,流動(dòng)相為乙腈-水,建立了10個(gè)產(chǎn)區(qū)的多葉重樓和11個(gè)不同產(chǎn)地云南重樓根莖HPLC指紋圖譜,共有峰分別為14個(gè)、13個(gè),圖譜相似度分別大于0.900、0.922。多葉重樓和云南重樓的根莖圖譜有11個(gè)共有峰,但相似度僅為0.057~0.225,7種主要甾體皂苷成分存在較大差異,多葉重樓中重樓皂苷I、II、VI和VII的含量低于云南重樓。袁會(huì)瓊等[18]采用Agilent Zorbax-SB C18色譜柱,以乙腈-水為流動(dòng)相,對(duì)10批云南重樓和10批長(zhǎng)柱重樓進(jìn)行HPLC分析,共發(fā)現(xiàn)15個(gè)共有峰,指認(rèn)出6、7、8、9號(hào)峰分別為重樓皂苷VI、VII、II、I,且長(zhǎng)柱重樓中上述4種有效成分的含量明顯高于云南重樓,圖譜相似度分別為0.905~0.998和0.905~0.986,聚類分析(CA)結(jié)合主成分分析(PCA)顯示20批樣品被顯著地分成2類,可為其品種鑒定及質(zhì)量監(jiān)控提供參考。錢正明等[19]采用Welch Ultimate AQ-C18色譜柱,以水-乙腈為流動(dòng)相,對(duì)10批重樓樣品HPLC分析,圖譜中標(biāo)記出16個(gè)共有峰,相似度多小于0.900,CA和PCA結(jié)果顯示10批重樓聚為3類,表明重樓藥材化學(xué)成分存在差異。

    1.2 超高效液相色譜

    與HPLC相比,超高效液相色譜(UPLC)柱效更高,具有更強(qiáng)的分析效率、靈敏度及分離能力,與不同檢測(cè)器聯(lián)用,適合于不同類型藥物復(fù)雜體系的分析鑒定,結(jié)合指紋圖譜技術(shù)在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)中具有的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),目前對(duì)于中藥重樓的研究主要集中于甾體皂苷類成分[20-21]。

    趙飛亞等[22]采用UPLC法對(duì)10種不同產(chǎn)地重樓進(jìn)行分析,色譜柱為L(zhǎng)una Omega Polar C18,流動(dòng)相為乙腈-水,測(cè)定了55批藥材中重樓皂苷I、II、VI、VII、H和薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷的含量,并采用TOPSIS模型分析,發(fā)現(xiàn)重樓化學(xué)綜合質(zhì)量差異較大。高妍等[23]采用UPLC法對(duì)云南重樓、華重樓、偽品三者進(jìn)行分析,色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3,流動(dòng)相為乙腈-水,在10批云南重樓圖譜中標(biāo)定出偽原纖細(xì)薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、薯蕷皂苷及重樓皂苷VII、H、II、I、V共8個(gè)特征峰,10批云南重樓、3批華重樓的相似度分別為0.70~0.83、0.26~0.37,7批偽品圖譜相似度小于0.22,CA和PCA均能使三者得以區(qū)分。張紹山等[24]對(duì)23份云南重樓及多芽品系進(jìn)行UPLC分析,色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18,流動(dòng)相為乙腈-水,建立了10批樣品的UPLC指紋圖譜,標(biāo)定出8個(gè)共有峰,指認(rèn)出重樓皂苷VII、H、II、I 4個(gè)特征峰,重樓(多芽品系)樣品間相似度小于0.9,CA和PCA分析從整體上表明樣品成分及含量具有明顯差異。楊遠(yuǎn)貴[25]采用UPLC法對(duì)38批不同種重樓進(jìn)行分析,色譜柱為Shim-pack XR-ODS III column,流動(dòng)相為乙腈-0.05%甲酸水,定量分析出重樓皂苷I、II的含量差異,并結(jié)合PCA、偏最小二乘判別分析(PLS-DA),結(jié)果顯示,大部分重樓樣品的含量比(重樓皂苷II/重樓皂苷I)小于100%,6種不同重樓很好聚為兩類,其中滇重樓和五指蓮UPLC指紋圖譜中共有峰個(gè)數(shù)分別為32個(gè)、25個(gè),相似度分別大于0.80、0.82,對(duì)重樓進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)可為尋找滇重樓種源替代產(chǎn)品提供參考。

    1.3 薄層色譜

    薄層色譜(TLC)常用于鑒別、雜質(zhì)檢查或含量測(cè)定,在中藥的質(zhì)量控制中起著重要的作用,展開速率快,分辨能力強(qiáng),展開劑和展開方向可隨用隨換,操作簡(jiǎn)便易行。隨著高效薄層色譜(HPTLC)的出現(xiàn),將常量薄層色譜的靈敏度和分辨力大大提高,方法更加高效、快速、可靠,可提供色譜指紋圖譜的電子圖像和密度圖來檢測(cè)植物樣品中是否存在標(biāo)記化合物[26]。

    洪淑華[27]采用預(yù)制硅膠G薄層板,展開劑為氯仿-甲醇-水(15∶5∶1)的下層溶液,點(diǎn)樣量2 μL,顯色劑為10%硫酸乙醇溶液,105℃加熱,365 nm紫外燈和日光下檢視,對(duì)9個(gè)重樓商品藥材和10個(gè)自然保護(hù)區(qū)來源重樓樣品進(jìn)行分析并建立TLC指紋圖譜,以重樓皂苷I、II為指標(biāo)成分,發(fā)現(xiàn)來源不同的重樓樣品的品質(zhì)參差不齊;CA顯示,9個(gè)商品藥材劃分為5個(gè)類群,品質(zhì)與來源不相一致,品種較為混亂,10個(gè)自然保護(hù)區(qū)樣品劃分為4個(gè)類群,與實(shí)際情況一致。于新蘭等[28]采用G薄層板,展開劑選用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(17∶40∶21∶10)10℃以下放置的下層溶液,檢視后可見23個(gè)熒光條斑,經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜鑒別出其中8個(gè),分別為重樓皂苷I、II、III、V、VI、VII、D和纖細(xì)薯蕷皂苷,該方法可快速鑒別重樓藥材,從整體上對(duì)藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

    2 光譜指紋圖譜

    2.1 紅外光譜

    紅外光譜(IR)中吸收峰的位置與強(qiáng)度反映出化學(xué)分子結(jié)構(gòu)上的差異,以此來鑒別結(jié)構(gòu),適用于固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài)樣品的分析,具有測(cè)定快、特征性強(qiáng)、分辨率高、檢測(cè)無損等特點(diǎn),對(duì)于中藥復(fù)雜化學(xué)成分可進(jìn)行多個(gè)組分定性定量分析,成為中藥質(zhì)量控制方面的一種有效手段[29-30]。

    吳喆[31]采用FT-IR法分別采集滇重樓、白花重樓、毛重樓、南重樓、五指蓮共50份樣品的紅外光譜信息,發(fā)現(xiàn)1 653、1 156、1 082、1 021、925、851、759、572、524 cm-1等為重樓屬植物的共有峰,1 535 cm-1和1 369 cm-1是毛重樓和五指蓮的特征吸收峰,PLS-DA和PCA分析將5種重樓準(zhǔn)確區(qū)分。同時(shí)對(duì)9種滇重樓不同炮制品整體化學(xué)成分變化進(jìn)行對(duì)比研究,特征峰分布為3 387、2 923、1 745、1 463、1 338、1 240、1 207、1 158、1 180、1 080、1 048、1 020、988、921、895、859、833、765、708、572、529 cm-1,且圖譜峰形大體相似,少數(shù)特征吸收峰數(shù)目、位置和吸收強(qiáng)度存在差異,表明不同炮制方法造成重樓化學(xué)成分和含量的變化。余孟杰等[32]采用FT-IR對(duì)10份七葉一枝花樣品進(jìn)行研究,建立IR指紋圖譜,并對(duì)3 400、2 940、1 640、1 411、1 250、1 200~950、1 150、1 020、920、860、760、700 cm-1附近的吸收峰進(jìn)行了歸屬,采用相關(guān)系數(shù)法計(jì)算相似度,以此對(duì)重樓類藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。鄭江萍等[33]建立了19份重樓藥材的IR指紋圖譜,共有特征峰有3 470 cm-1、2 990 cm-1、1 670 cm-1、1 420 cm-1、1 080 cm-1、960 cm-1,根據(jù)七葉一枝花、寬葉重樓、球藥隔重樓、華重樓的IR圖譜的差異,可對(duì)準(zhǔn)確區(qū)分重樓藥材,實(shí)現(xiàn)快速鑒別的目的。裴藝霏[34]以云南省和貴州省采集的野生及栽培滇重樓的根莖、莖及葉作為研究材料,用FT-MIR、ATR-FTMIR、NIR等多種光譜技術(shù)采集指紋圖譜,結(jié)合多種變量篩選方法及多來源信息融合策略,建立了單一或融合PLS-DA、SVM及RF滇重樓產(chǎn)地鑒別及年限鑒別模型,輔以HCA及PCA方法,系統(tǒng)分析不同部位、年限和產(chǎn)地的滇重樓品質(zhì)差異,建立滇重樓光譜評(píng)價(jià)體系,為滇重樓質(zhì)量評(píng)價(jià)與資源合理利用提供了理論基礎(chǔ)。

    2.2 紫外光譜

    有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)中含有發(fā)色團(tuán)、助色團(tuán)等官能團(tuán),能夠產(chǎn)生特征性吸收光譜,可以利用紫外光譜(UV)對(duì)其進(jìn)行定性鑒別。紫外指紋圖譜可獲取稀溶液中190~400 nm的化學(xué)成分的疊加信息,利用紫外光譜分析法可以檢測(cè)或測(cè)定中藥中總成分的不飽和化學(xué)鍵和共軛體系的信息[35],特別適用于不飽和共軛體系化合物的鑒定,從而對(duì)中藥實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地鑒別分析。

    張金渝等[36]采用氯仿、無水乙醇和重蒸水3種不同極性溶劑分別對(duì)重樓樣品進(jìn)行紫外吸收光譜檢測(cè),建立了46份滇重樓及其他重樓居群的紫外光譜指紋圖譜,結(jié)果顯示,滇重樓的共有峰率在36.00%~77.78%,平均共有峰率為53.25%,滇中、滇南及滇西南、滇東南、滇西北、滇東及黔西5個(gè)相同地區(qū)內(nèi)滇重樓居群平均共有峰率分別為51.69%、55.23%、52.8%、54.24%、54.63%,表明地理距離近、環(huán)境相似的居群具有較高的共有峰率,居群間化學(xué)成分相似程度高。該方法能夠?qū)⒉煌乩韥碓吹牡嶂貥蔷尤簠^(qū)分開來,也可以將滇重樓與其他重樓區(qū)分開來。

    2.3 熒光光譜

    熒光光譜能夠形象地反映出含有共軛雙鍵熒光組分的各種分子信息,適用于含有熒光組分的藥物成分分析,具有靈敏度高、選擇性好、測(cè)試速度快等優(yōu)點(diǎn),可以進(jìn)行中藥藥性識(shí)別[37],在藥物成分分析與鑒定、藥動(dòng)學(xué)研究、藥理與藥效評(píng)價(jià)等方面廣泛應(yīng)用。

    洪淑華[27]采用熒光光譜法對(duì)9個(gè)重樓商品藥材和10個(gè)自然保護(hù)區(qū)來源重樓樣品進(jìn)行分析并建立了熒光光譜指紋圖譜,在Ex280 nm/Em330 nm和Ex280 nm/Em640 nm附近均具有熒光峰,且重樓皂苷I、II的熒光峰出現(xiàn)在Ex220 nm/Em340 nm和Ex270 nm/Em400 nm附近,而不同產(chǎn)地的樣品熒光峰等高線密集程度均不一樣。商品藥材均在Ex280 nm/Em330 nm、Ex280 nm/Em640 nm、Ex230 nm/Em340 nm和Ex230 nm/Em640 nm處有熒光峰,自然保護(hù)區(qū)來源的樣品在Ex400 nm/Em680 nm等處有熒光峰,按其三維熒光圖譜可將重樓樣品分為2大類。對(duì)比熒光峰峰高發(fā)現(xiàn),同一產(chǎn)地的樣品重樓皂苷含量不盡相同,相同部位不同來源的重樓樣品品質(zhì)不一致,同株不同部位重樓樣品,根中重樓皂苷含量高于莖葉,該方法簡(jiǎn)便可靠、簡(jiǎn)便易行、特征性強(qiáng),可作為重樓質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究、品質(zhì)鑒定的手段。

    3 生物指紋圖譜

    分子標(biāo)記技術(shù)是以生物個(gè)體間遺傳物質(zhì)的差異進(jìn)行標(biāo)記,具備靈敏度高、重現(xiàn)性好、分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)?;诜肿訕?biāo)記技術(shù)建立的生物指紋圖譜已被廣泛應(yīng)用于藥用植物鑒定鑒別研究中,并成為中藥材鑒定質(zhì)量控制的重要技術(shù)[38]。

    辛本華等[39]對(duì)來自四川和云南的重樓屬種的遺傳多態(tài)性進(jìn)行RSAP標(biāo)記分析,構(gòu)建出8個(gè)種的DNA指紋圖譜,借助系統(tǒng)進(jìn)化樹可以明確不同種的進(jìn)化關(guān)系,從而為重樓的種類鑒定和種間的分類地位提供分子生物學(xué)依據(jù)。劉勝坤等[40]對(duì)13份重樓進(jìn)行ISSR標(biāo)記分析,12條引物擴(kuò)增出條帶181條,其中多態(tài)性帶174條,占比96.13%,Nei’s基因多樣性指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)及遺傳相似系數(shù)的范圍分別為0.214~0.327、0.351~0.500、0.293~0.624,并通過聚類分析將重樓種質(zhì)分為3類。周武先等[41]對(duì)13份重樓樣品進(jìn)行CDDP標(biāo)記分析,并進(jìn)行條形碼編碼,多態(tài)性條帶73個(gè),占比91.25%,該方法檢測(cè)靈敏,可以快速鑒定重樓。Duan等[42]采用DNA條形碼結(jié)合高分辨熔融分析技術(shù),對(duì)重樓及其偽品進(jìn)行了鑒別,結(jié)果表明,內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)分子區(qū)域與HRM分析相結(jié)合,可以有效鑒別9種中草藥,其中包括2種重樓的正宗產(chǎn)地和7種常見的摻假品,DNA條形碼與HRM分析相結(jié)合是一種準(zhǔn)確、可靠、快速、經(jīng)濟(jì)、可靠的分析工具,有助于重樓的質(zhì)量控制。

    4 結(jié)語

    重樓是我國(guó)常用的中藥材,市場(chǎng)需求量大,同屬植物較多,存在混淆、混用或替用現(xiàn)象。種質(zhì)來源、生產(chǎn)產(chǎn)地及方式等諸多因素都對(duì)重樓藥材的質(zhì)量產(chǎn)生顯著影響,并最終影響著藥物的療效及產(chǎn)品的穩(wěn)定與可控,以單一指標(biāo)成分難以控制重樓的真實(shí)品質(zhì),建立其科學(xué)可靠的質(zhì)控體系十分必要。

    基于光譜、色譜、生物等方法的指紋圖譜技術(shù),可以解開重樓成分“密碼”,較為全面的反映重樓內(nèi)部整體特征,對(duì)藥材實(shí)現(xiàn)真?zhèn)舞b別、優(yōu)劣考察,區(qū)分藥材各個(gè)部位及檢測(cè)原料與成品之間的一致性和穩(wěn)定性,進(jìn)而對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行系統(tǒng)描述和評(píng)價(jià)。目前,關(guān)于重樓指紋圖譜技術(shù)的研究主要集中于高效液相色譜,適用于各類藥材的快速高效質(zhì)量分析。近年來,生物指紋圖譜的研究逐漸深入,借助分子遺傳標(biāo)記并應(yīng)用于中藥材的質(zhì)量控制。但是,重樓指紋圖譜與生物活性或臨床療效等相關(guān)的化學(xué)成分的關(guān)聯(lián)性研究報(bào)道較少,有待于確定其完整的譜效關(guān)系,揭示藥材的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。因此,綜合運(yùn)用各種現(xiàn)代技術(shù)對(duì)重樓進(jìn)行深度挖掘研究,進(jìn)一步完善其質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)體系,可以更好地實(shí)現(xiàn)重樓藥材的合理開發(fā)和科學(xué)應(yīng)用。

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