半月板運(yùn)動損傷力學(xué)機(jī)制及差異基因分析

蒲磊 漆正堂

(華東師范大學(xué)體育與健康學(xué)院 上海 200241)

隨著經(jīng)濟(jì)和社會的發(fā)展，人民生活水平的提高，運(yùn)動及意外事故造成的半月板損傷成為膝關(guān)節(jié)的常見外傷性疾病之一。半月板是纖維軟骨板，位于脛骨內(nèi)、外側(cè)髁關(guān)節(jié)面上，具有緩沖震動和保護(hù)膝蓋的功能。半月板損傷會導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)及其以下關(guān)節(jié)活動受限。運(yùn)動造成半月板損傷的常見因素是膝關(guān)節(jié)的突然制動和劇烈擺動等。因此，研究運(yùn)動引起的半月板損傷的力學(xué)機(jī)制可以避免運(yùn)動壽命降低和運(yùn)動損傷的發(fā)生。由于學(xué)科的相互交叉滲透及不斷發(fā)展，體育領(lǐng)域逐漸將基因組學(xué)相關(guān)研究方法與思路應(yīng)用于運(yùn)動損傷及各種疾病之中。目前而言，基于基因組學(xué)的運(yùn)動損傷及干預(yù)措施的研究正逐步推進(jìn)，針對運(yùn)動造成半月板損傷的DEGs分析仍較少?；仡櫺匝芯堪l(fā)現(xiàn)，半月板發(fā)生損傷后，不及時康復(fù)治療，損傷會積累，繼而影響相關(guān)生理功能，即使治療后，伴隨著年齡的增長，半月板損傷也會引起并發(fā)癥，如關(guān)節(jié)積液、骨關(guān)節(jié)炎、滑膜炎等。因此，利用生物信息學(xué)方法探索不同年齡段的DEGs，提供半月板損傷的基因靶點(diǎn)，可能對延緩、預(yù)防疾病具有一定的價值。

1 制動導(dǎo)致半月板損傷的機(jī)制

半月板是膝關(guān)節(jié)的重要軟骨組織，由于特殊的生理位置及功能，運(yùn)動造成的半月板損傷成為常見的運(yùn)動性疾病。制動在運(yùn)動過程中發(fā)揮著重要作用，動量矩在身體內(nèi)傳遞和轉(zhuǎn)移就是利用某些身體環(huán)節(jié)的突然制動，從而使環(huán)節(jié)原已獲得的動量矩向相鄰環(huán)節(jié)轉(zhuǎn)移和傳遞，然而制動又是導(dǎo)致半月板損傷的主要原因之一。運(yùn)動時，身體處于變化狀態(tài)，重心也隨之變化，當(dāng)身體急劇制動，重心未及時調(diào)整時，半月板在股骨髁與脛骨之間發(fā)生研磨，半月板受到壓縮-扭轉(zhuǎn)復(fù)合載荷，導(dǎo)致?lián)p傷。例如，足球運(yùn)動中，運(yùn)動員為減少慣量，大、小腿折疊后急劇伸小腿作強(qiáng)力扭轉(zhuǎn)，此刻半月板處在股骨內(nèi)外側(cè)髁、股骨的突起部位中間，未及時滑移，受到上、下關(guān)節(jié)面強(qiáng)烈沖擊和擠壓，導(dǎo)致?lián)p傷的發(fā)生。制動造成的半月板損傷主要表現(xiàn)為磨損與變性（改變性質(zhì)）［1］。

其中，磨損分為兩類，即界面磨損和疲勞性磨損。界面磨損由承載表面之間的相互作用引起，疲勞性磨損由關(guān)節(jié)變形引起。承載面磨損的可能機(jī)制為半月板微結(jié)構(gòu)受到破壞，正常加載機(jī)制（如分泌潤滑液）發(fā)生改變，表面研磨與粘黏，承載表面過于干涸而引發(fā)磨損。變形機(jī)制可能是，運(yùn)動時，由于劇烈制動，半月板受到外力作用，內(nèi)部產(chǎn)生對抗力，局部相對變形，繼續(xù)增加壓強(qiáng)，半月板受到過高載荷，未及時使組織間液重新分布與滑移，繼而因強(qiáng)烈碰撞導(dǎo)致半月板承載表面變形，最終引發(fā)疲勞性磨損。

軟骨變性的可能機(jī)制為軟骨受到異常應(yīng)力與應(yīng)變，隨著應(yīng)力的增加，力的作用點(diǎn)集中，軟骨內(nèi)產(chǎn)生斷裂，繼而引發(fā)軟骨變性與退化［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)，制動后數(shù)日內(nèi)，關(guān)節(jié)滑液分泌障礙，潤滑囊干涸、粘連、消失，關(guān)節(jié)軟骨接觸面的表層發(fā)生退行性變化，逐漸侵入各層，繼而引發(fā)軟骨細(xì)胞死亡、軟骨吸取營養(yǎng)功能障礙、纖維化等，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)粘連、關(guān)節(jié)攣縮、關(guān)節(jié)炎，引起關(guān)節(jié)活動障礙［4］。制動不僅能引起半月板單方面損傷，還會引起周圍韌帶的機(jī)械損傷，形成膝關(guān)節(jié)損傷。制動導(dǎo)致韌帶萎縮，韌帶應(yīng)力、應(yīng)變下降、機(jī)械性能降低，韌帶發(fā)生機(jī)械性損傷，最終關(guān)節(jié)穩(wěn)固性下降?？傊?，劇烈運(yùn)動增加了損傷發(fā)生的可能性，制動首先引起關(guān)節(jié)內(nèi)壓強(qiáng)增大，應(yīng)力、應(yīng)變發(fā)生變化，所受載荷超出范圍，發(fā)生損傷，進(jìn)而引發(fā)穩(wěn)定性下降、軟骨細(xì)胞凋亡、功能異常等［5-7］。

2 半月板損傷的差異基因分析與討論

隨著細(xì)胞生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，基因組學(xué)的調(diào)控療法逐漸被應(yīng)用于運(yùn)動損傷及各種疾病之中。目前而言，基于基因組學(xué)的運(yùn)動損傷研究及干預(yù)措施正逐步推進(jìn)?；仡櫺匝芯堪l(fā)現(xiàn)，針對運(yùn)動造成半月板損傷的DEGs分析仍較少。游茗柯等人［8］的研究報(bào)道，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、軟骨素酶-ABC、硫酸軟骨素（CS）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、胰島素樣生因子-1（IGF-1）等，對于半月板損傷的治療具有重要意義。國內(nèi)研究者賈瓊通過建立大鼠半月板損傷模型，分析腫瘤壞死因子（TNF-α）和超級生長因子TGF-β1 基因在半月板受損后的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TNF-α 的正負(fù)調(diào)控和TGF-β1 在軟骨組織的維持和修復(fù)作用，可用于治療、保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨。雖然大量研究證明基因表達(dá)與半月板損傷的發(fā)展相關(guān)，但半月板患者在不同年齡段病理變化的差異基因表達(dá)尚不清楚。

該研究通過GEO數(shù)據(jù)庫下載了GSE45233基因集，數(shù)據(jù)源采集年齡已劃分為＞40 歲和≤40 歲，據(jù)此，該研究將劃分為兩組：老年組/對照組（＞40 歲，6 人平均50歲，最大年齡55 歲，最小年齡43 歲）和年輕組/實(shí)驗(yàn)組（≤40 歲，6 人平均30 歲，最大年齡40 歲，最小年齡16歲）。利用GEO2R在線數(shù)據(jù)庫分析GSE45233，并以P＜0.05和logFC絕對值≥1作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出290個上調(diào)差異基因（DEGs）和235 個下調(diào)DEGs，并運(yùn)用UE和R軟件繪制火山圖（見圖1）。

圖1 DEGs火山圖

然后，利用DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行上調(diào)、下調(diào)DEGs 的基因本體功能（GO）的生物過程（BP）和京東與基因組百科全書（KEGG）富集分析。圖2 結(jié)果顯示，上調(diào)DEGs 在BP 中顯著富集于骨骼系統(tǒng)開發(fā)、膠原纖維組織、軟骨發(fā)育、軟骨凝結(jié)、軟骨細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控、軟骨內(nèi)骨化、軟骨細(xì)胞分化等進(jìn)程中。KEGG 通路中，上調(diào)基因顯著富集的通路共5條：蛋白質(zhì)消化吸收通路、磷脂酰肌醇3 激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）信號通路、海馬信號通路、低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）信號通路和細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路等。P13K-Akt是一類AGC 家族的蘇氨酸激酶，P13K/Akt 通路與人類疾病密切相關(guān)，如癌癥、骨關(guān)節(jié)炎、心血管疾病、神經(jīng)疾病等，主要參與著調(diào)控細(xì)胞周期的多種環(huán)節(jié)，在細(xì)胞過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。有研究探討了P13K/Akt信號通路的激活可減少細(xì)胞的凋亡、減輕心肌內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等，并認(rèn)為上調(diào)P13K/Akt能夠減少肌細(xì)胞凋零，達(dá)到改善骨骼肌功能的效果［9］。李田洋等人［10］研究報(bào)道，P13K/Akt通路在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用，抑制P13K/Akt的磷酸化可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，對延緩骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展和治療有良好的療效。大量研究表明，P13K/Akt通路參與細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期及軟骨組織疾病的發(fā)生和發(fā)展，據(jù)此，推斷半月板損傷加劇可能機(jī)制為PI3K/AKT通路表達(dá)量減少，軟骨細(xì)胞逐漸凋亡，伴隨白介素（IL-1β）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和炎癥，軟骨細(xì)胞的一氧化碳和活性氧增加，半胱氨酸蛋白酶（Caspas-9/caspas-3）的產(chǎn)生和PI3K/Akt的磷酸化，最終引發(fā)半月板損傷惡化［11］。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）指在多細(xì)胞有機(jī)體中，由細(xì)胞分泌至細(xì)胞外間質(zhì)的大分子組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。ECM 與多種疾病密切聯(lián)系，相關(guān)研究已證實(shí)ECM 基因突變可引發(fā)骨關(guān)節(jié)炎，黃斑變性病，動脈粥樣硬化等疾病。楊等人［11-12］建立兔子模型，發(fā)現(xiàn)ECM誘導(dǎo)血管化組織工程對于修復(fù)兔子的半月板損傷具有一定潛力。該數(shù)據(jù)集采集者研究報(bào)道，細(xì)胞外基質(zhì)與年齡具有相關(guān)性，隨著年齡的增加，細(xì)胞外基質(zhì)也發(fā)生變化，該研究篩選了與軟骨穩(wěn)態(tài)和骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)了隨年齡增長而發(fā)生上調(diào)和下調(diào)變化的基因，暗示了軟骨病或?qū)㈦S著年齡而發(fā)生變化。這與該研究的富集分析結(jié)果不謀而合，上調(diào)DEGs基因集顯示7 個基因富集于ECM 通路，分別是：COL2A1、LAMB3、LAMC3、ITGA10、CHAD、COL9A3、COL9A2，這些基因與軟骨疾病密切相關(guān)，可為今后相關(guān)研究者提出大量實(shí)證。

圖2 上調(diào)DEGs的BP和KEGG 富集分析結(jié)果圖

圖3 顯示，下調(diào)DEGs 在BP 中顯著富集于細(xì)胞增殖，超氧化代謝過程，免疫應(yīng)答，蛋白質(zhì)磷酸化，白細(xì)胞介素-1β正調(diào)節(jié)，細(xì)胞凋亡過程，線粒體ATP合成耦合電子傳遞的正調(diào)控，細(xì)胞分裂，先天免疫反應(yīng)等過程。下調(diào)DEGs 顯著富集于3 條通路，即破骨細(xì)胞分化、中性粒細(xì)胞胞外陷阱形成、B細(xì)胞受體信號通路。骨細(xì)胞分化通路是骨生成的重要通路，相關(guān)研究報(bào)道，骨的生成是破骨細(xì)胞（OC）與成骨細(xì)胞（OB）保持平衡相互作用的結(jié)果，二者失去平衡將引起骨疾病，OC 前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化需要細(xì)胞因子的參與，如巨噬細(xì)胞集落刺激因子、核轉(zhuǎn)錄因子-κB受體活化因子等，其中調(diào)控NF-κB已被證實(shí)可促進(jìn)關(guān)節(jié)炎軟骨再生［13-16］。中性粒細(xì)胞胞外陷阱（NET）指中性粒細(xì)胞（NEU）與感染性病原體作用后排出的細(xì)胞外DNA 鏈，NET 是血液中豐富的免疫細(xì)胞，參與著非感染炎癥的調(diào)控，NET也是消滅病原體，宿主抵御病原感染的關(guān)鍵點(diǎn)，其表達(dá)水平增多或減少都影響著急性、慢性疾病的病理過程［17-20］。B細(xì)胞受體（BCR）信號通路是B 細(xì)胞存活的重要信號通路，B 細(xì)胞在體液免疫中發(fā)揮著不可替代的作用，B 細(xì)胞膜表面表達(dá)著BCR，BCR 是能夠識別并結(jié)合抗原的免疫膜蛋白受體，進(jìn)行BCR 調(diào)控對于多種免疫疾病具有重要治療意義［21-23］。

圖3 下調(diào)DEGs的BP和KEGG富集分析結(jié)果圖

最后，基于STRING數(shù)據(jù)庫利用Cytoscape（3.82）軟件分別構(gòu)建了上調(diào)DEGs（見圖4）和下調(diào)DEGs（見圖5）的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)相關(guān)度（Degree）篩選出3 個上調(diào)關(guān)鍵基因和3 個下調(diào)關(guān)鍵基因。上調(diào)關(guān)鍵基因?yàn)閂EGFA、FGF2、SOX9。下調(diào)關(guān)鍵基因?yàn)锽IRC5、BUB1、CDK1。血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）是血小板衍生因子（PDGF）和血小板衍生生長因子（VEGF）家族的成員，該基因是血管生成的必要因子，在血管生成中誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖，保護(hù)細(xì)胞避免凋亡和衰老［24］。成纖維細(xì)胞生長因子-2（FGF2）可促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（SMSCs）增殖并保持其多能性，間充質(zhì)干細(xì)胞又是半月板細(xì)胞的有用來源，間充質(zhì)干細(xì)胞可遷移至損傷部位，結(jié)合營養(yǎng)因子發(fā)揮修復(fù)功能，間接或直接改善半月板損傷。另外，袁媛等人通過建立牙髓模型，也發(fā)現(xiàn)FGF2預(yù)處理后可促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的增殖及分化能力，對牙髓的再生發(fā)揮著重要作用［25-27］。SOX9是軟骨性轉(zhuǎn)錄因子，主要在間充質(zhì)軟骨的形成過程中表達(dá)，對Aggrecan 和Co12a1 的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮重要作用［28］。BIRC5該基因是凋亡抑制因子家族的成員，編碼抑制凋亡細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，李玉龍等人［29］研究發(fā)現(xiàn)結(jié)合相關(guān)因子，沉默BIRC5 可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，該基因主要應(yīng)用于癌癥的靶點(diǎn)研究，但通過對其調(diào)控，應(yīng)用于半月板損傷治療也具有一定潛力。BUBI是有絲分裂檢查點(diǎn)的重要成員之一，參與著有絲分裂過程微管與絲點(diǎn)結(jié)合的檢測，并在衰老、腫瘤、不孕等方面發(fā)揮著調(diào)控作用［30-31］。周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）是一套Ser/Thr 激酶系統(tǒng)，它對細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、檢查點(diǎn)的激活發(fā)揮著關(guān)鍵作用，CDK1 對細(xì)胞生存具有重要意義，目前已受到腫瘤研究的高度關(guān)注。

圖4 PPI上調(diào)DEGs網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 PPI下調(diào)DEGs網(wǎng)絡(luò)圖

通過上述差異基因分析，該研究認(rèn)為不同年齡段的半月板損傷發(fā)展具有差異性，對關(guān)鍵基因VFGFA、FGF2、SOX9、BIRC5、BUB1、CDK1的調(diào)控可能成為治療半月板損傷的靶點(diǎn)。例如，Grunewald等人［32］通過建立小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，衰老過程中，盡管VEGF產(chǎn)生量未具有顯著性差異，但VEGF 在多個關(guān)鍵器官中的表達(dá)量顯著性減少；Joe.V等人以構(gòu)建的小鼠模型為研究對象，發(fā)現(xiàn)了FGF2的表達(dá)水平會隨著年齡的增長而增加，F(xiàn)GF2 由于無法識別性地選擇激活休眠干細(xì)胞池，因此導(dǎo)致了干細(xì)胞被不必要地激活，而通過抑制FGF2表達(dá)量，可以有效地抑制小鼠體內(nèi)干細(xì)胞數(shù)量的下降，這表明了隨著年齡的增長，干細(xì)胞池會被逐漸耗盡，進(jìn)而導(dǎo)致干細(xì)胞數(shù)量下降［33］；Gruber 等人［34］研究發(fā)現(xiàn)，SOX9 的表達(dá)量與年齡成反比，即隨著年齡的增長，SOX9的表達(dá)量將會下降。相較于老年組而言，年輕組在半月板損傷的康復(fù)中可能更具有優(yōu)勢，但由于基因表達(dá)水平較高，損傷及引發(fā)相關(guān)疾病的加劇速度也較快，因此針對不同年齡段應(yīng)采用不同手段。老年組由于多種益于軟骨發(fā)育及修復(fù)的細(xì)胞逐漸凋亡的同時，促進(jìn)病情加劇的相關(guān)細(xì)胞也隨之凋亡，可在病情極端惡化時進(jìn)行靶點(diǎn)基因調(diào)控，促進(jìn)軟骨再生及延緩。并制訂微量的體育鍛煉方案，提高肌肉性能，關(guān)節(jié)穩(wěn)定性、靈活性，增加自身免疫力和消炎藥物輔以控制病情。而年輕組由于細(xì)胞凋亡與增殖因子及自身免疫系統(tǒng)因子正處于壯年期，不建議利用基因調(diào)控對其進(jìn)行治療［35］?？刹捎眠m宜的運(yùn)動進(jìn)行康復(fù)鍛煉，適宜的體育鍛煉對軟骨具有積極的影響，如抗阻運(yùn)動，通過增大肌肉體積來提高關(guān)節(jié)負(fù)載能力，同時減少與軟骨之間的摩擦阻力，進(jìn)而發(fā)揮間接性治療作用。

3 結(jié)語

該研究認(rèn)為，制動會造成半月板磨損、變性，避免劇烈制動可防止損傷發(fā)生，一旦損傷發(fā)生，可根據(jù)病情發(fā)展及患者年齡等情況采取針對性治療方法。

該研究為綜述性研究，其確切結(jié)論及機(jī)制仍需更進(jìn)一步臨床研究證實(shí)，研究過程中發(fā)現(xiàn)了諸如KIF11及多種雌激素基因的反復(fù)出現(xiàn)，暗示了可能還受到性別影響，遺憾的是，基因集數(shù)據(jù)并未對此分類，相關(guān)影響因素有待進(jìn)一步探討。