SD 大鼠慢性根尖周炎動物模型的研究進展

楊镕羽 ，宋 飛 ，黃 浩 ，段開文 ，錢石兵 ，向盈盈

（1）昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院口腔科，云南 昆明 650031;2）昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院微創(chuàng)介入科，云南 昆明 650106）

慢性根尖周炎（chronic apical periodontitis，CAP）是指根管內(nèi)存在病原菌感染或刺激，致使根尖周牙槽骨吸收和肉芽組織增生的一類慢性炎癥反應[1]。其發(fā)病機制尚不明確。目前，根管治療術(shù)（root canal therapy，RCT）作為治療根尖周炎的常用手段，但由于根管系統(tǒng)和根管內(nèi)病原菌的復雜性，以及口腔醫(yī)生操作方面的差異，仍有一些根管治療后的根尖周炎難以愈合。

由于人類個體的特殊性，很多情況下，無法直接研究根尖周炎的發(fā)病機理。因此，動物實驗是臨床前期實驗中一個必不可少的環(huán)節(jié)，其結(jié)果也是進行臨床試驗的重要依據(jù)，動物實驗能夠正常開展的前提是必須建立可靠的動物模型。其中，SD 大鼠憑借其生長速度快、易培養(yǎng)、適應性強、價格低廉、易飼養(yǎng)等優(yōu)勢，常用于研究根尖周炎的發(fā)病機制。

1 慢性根尖周炎動物模型概述

實驗動物的選擇因不同的實驗目的而不同，常用于建立根尖周炎模型的動物有猴、犬、鼠及小型豬等[2]。猴在遺傳物質(zhì)方面與人類有很高的同源性，在醫(yī)學研究中有很高的價值。然而，由于倫理及經(jīng)濟的限制，猴的應用相對較少，缺乏相關(guān)數(shù)據(jù)。犬類牙體和牙周組織解剖結(jié)構(gòu)相近、來源廣泛，但其攻擊性強、難于飼養(yǎng)而應用較少。小型豬的出現(xiàn)解決了豬體重增長快的缺點，其有乳牙及恒牙雙牙列，牙齒及牙周都與人相近，但因為價格及飼養(yǎng)等方面的問題而較少應用[3]。SD大鼠具有生長速度快、易培養(yǎng)、適應性強、價格低廉、易飼養(yǎng)等優(yōu)勢，而且其磨牙形態(tài)、口腔菌群與人類相似而常用于根尖周炎的相關(guān)研究[4]。而且SD 大鼠慢性根尖周炎模型的建立方法已經(jīng)成熟。所以SD 大鼠常被用于構(gòu)建慢性根尖周炎模型。

2 SD 大鼠牙齒發(fā)育特點

掌握SD 大鼠牙齒的發(fā)育過程及特點，不僅對建立慢性根尖周炎動物模型時選擇大鼠的周齡以及牙位提供依據(jù)[5]，而且還可以為研究人體牙齒發(fā)育進程提供一定的參考[6]。SD 大鼠作為哺乳動物，不同于人類，其在生長發(fā)育過程中僅有一個牙列，牙列中有16 顆牙齒，牙列分四個象限，每個象限分別有1 顆切牙和3 顆磨牙。顯微CT顯示，SD 大鼠出生后1 d 時下切牙礦化牙尖形成；出生7 d 時，第一磨牙牙尖礦化并相互融合；出生后14 d，第一磨牙基本形成牙冠，第二磨牙牙冠大部分形成；出生后3 周，切牙開始有咬合接觸，第一、二磨牙萌出，第三磨牙牙尖礦化并聯(lián)合；出生后4 周，第三磨牙的牙冠形成；6 周齡時第一磨牙及第二磨牙的牙根的長度基本確定；10 周齡時達到成體，牙尖開始出現(xiàn)不同程度的磨損，冠部發(fā)育葉出現(xiàn)磨損，根部根尖孔發(fā)育完成[7]。

2.1 切牙

SD 大鼠切牙由根基部終生開放，能不斷生長，來補償切端的磨耗[8-10]。Sharir 等[8]通過結(jié)合單細胞RNA 測序（scRNA-seq）、鼠遺傳學和組織損傷方法，揭示了維持和修復持續(xù)生長的鼠切牙的細胞層次結(jié)構(gòu)和機制。在鼠中，切牙干細胞可通過不斷地自我更新來補充由于咬傷而丟失的組織。因此，大鼠切牙常用于研究干細胞生成，組織再生及細胞分化的研究。此外，大鼠切牙類似于指甲，毛囊和腸道上皮，可用于建立連續(xù)自我更新器官的具有細胞動力學的模型[9]。

長期以來的觀點是，人類牙齒中含有與小鼠切牙間充質(zhì)干細胞相似的的間充質(zhì)干細胞。但是，SD 大鼠的切牙是否代表了研究人類牙齒發(fā)育和生理的特定方面的生物等效模型系統(tǒng)尚不清楚。

2.2 磨牙

SD 大鼠第1 磨牙2 周齡時形成牙冠，8 周齡時形成牙根，根長度及根分叉角度均很大，可以很好地承擔咬合力。第2 磨牙3 周齡時形成牙冠，8 周齡時完全形成牙根；第3 磨牙4 周齡時形成牙冠，10 周齡時形成牙根；第2、3 磨牙牙根長度相較于第1 磨牙進一步縮短，牙根數(shù)目也逐漸減小。第1 磨牙在SD 大鼠牙列中相較于其他磨牙最大，位置較靠前，且發(fā)育完成時間最早，因此，在口腔醫(yī)學中，SD 大鼠第1 磨牙常被用于動物實驗[7]。

3 SD 大鼠構(gòu)建慢性根尖周炎的方法

目前建立動物模型根尖周炎的方法主要有有髓腔開放法和優(yōu)勢細菌導入法[2]。

3.1 髓腔開放法

髓腔開放法就是開髓后，使牙髓組織與大鼠口腔內(nèi)菌群相接觸，從而使大鼠牙髓產(chǎn)生炎癥進而發(fā)展到根尖區(qū)。髓腔開放法可通過控制髓腔開放時間的長短來控制牙髓組織受感染的程度[11]。此種方法目前已較為成熟且應用較多。

馬典福等[12]在大鼠上下頜第1、2、3 磨牙開髓開放，3 周后經(jīng)X 線掃描大鼠上下磨牙區(qū)域，發(fā)現(xiàn)磨牙根尖周存在透射影，證明大鼠根尖周有感染。Yamasaki 等[13]在大鼠磨牙開髓使髓腔暴露 56 d，通過組織病理學檢查發(fā)現(xiàn)髓腔開放 7 天內(nèi)炎癥局限于牙髓內(nèi)，未達根尖；而髓腔暴露 14 d 后根尖周組織中可見炎癥細胞，并且隨著開放時間增加，根尖周感染的面積也逐漸擴大。Lin等[14]在大鼠雙側(cè)下頜第一磨牙開髓開放后，分別于術(shù)后0、7、14、21、28 和35 d 通過micro-CT、HE 染色、抗酒石酸鹽的酸磷酸酶（TRAP）染色、免疫組化雙染色免疫熒光法及實時熒光定量聚合酶鏈反應來觀察實驗牙的根尖區(qū)，研究發(fā)現(xiàn)術(shù)后0 天，根尖周區(qū)域完好無損，未觀察到骨吸收。第7 天時根尖周出現(xiàn)病變，隨著時間的增加，根尖病變的體積增加。第14～35 天病灶沿矢狀、水平、冠狀方向不斷擴大，第28 天達到高峰，第35 天根尖周病灶擴大率略有下降，第35 天根尖周病變擴大除第28 天外，仍大于其他時間點。然而，一些因素可能會對直接暴露于口腔中的髓腔及根管系統(tǒng)造成干擾，因此，在選擇髓腔開放法建立大鼠根尖周炎動物模型時，可通過開髓后置入PBS 緩沖液，玻璃離子水門汀封閉髓腔來建立慢性根尖周炎。

3.2 優(yōu)勢菌導入法

根尖周炎主要是由于牙齒根管內(nèi)及根尖周存在感染而導致的一類炎癥。觀察并分析根管及根尖周的細菌，可發(fā)現(xiàn)根尖周炎的根管及根尖周的優(yōu)勢菌多為專性和兼性厭氧菌，即根尖周炎是一種以專性和兼性厭氧菌為主的多細菌感染性疾病[15]。Korona-Glowniak 等[16]研究了與不同牙髓感染相關(guān)的根管微生物群的微生物多樣性。收集了45 例樣本，包含牙周病8 例、慢性根尖周炎29 例和牙髓壞死8 例。其中19 例（42.2%）存在根管繼發(fā)感染。然后采用培養(yǎng)法和實時PCR 擴增引物和水解探針檢測法檢測和鑒定口腔微生物群，檢測到厚壁菌門（62.9%）、放線菌門（14.0%）、擬桿菌門（12.1%）、變形菌門（9.1%）和梭桿菌門（4.2%）。研究發(fā)現(xiàn)，54.6% 為專性厭氧菌。在牙髓壞死和未經(jīng)治療根尖周炎的根管中，G-厭氧菌為優(yōu)勢菌。而在繼發(fā)感染的根管中，G+兼性厭氧菌檢出率高。

G-厭氧菌作為未經(jīng)治療的根尖周炎根管內(nèi)的優(yōu)勢菌，根尖周組織常因其細胞壁成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）及多種水解酶而受損害，因此，可在根管內(nèi)導入 LPS 來制備慢性根尖周炎動物模型。Wang 等[17]通過在大鼠上下第一磨牙開髓后，置入蘸滿LPS 的棉球，并保持髓腔開放。研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后即刻，根尖周即表現(xiàn)為輕度炎癥；術(shù)后1 周時，牙周膜間隙增寬；術(shù)后2～3 周時，牙槽骨破壞明顯，且破壞面積隨時間增加而增加；而到第5 周時，根尖炎癥表現(xiàn)為慢性，根尖破壞開始局限。盡管在大鼠髓腔內(nèi)導入LPS 可以觀察到根尖周的破壞，然而由于缺少細菌及其他毒性產(chǎn)物的作用，單純導入LPS 難以真實地觀察到根尖周炎的進展過程。

對于難治性、復發(fā)性慢性根尖炎等特別的根尖炎則可以選擇在髓腔及根管內(nèi)導入相應優(yōu)勢菌后封閉根管口來建立動物模型[18]。Yuanita 等[19]在大鼠右上第1 磨牙區(qū)開髓后，向髓腔內(nèi)注射106CFU/mL 的糞腸球菌ATCC29212 液10 μL，3周后使用免疫組化檢查分析RANKL 和NFATc1的表達確認形成了根尖周炎。Wang 等[20]在大鼠右下頜第一磨牙開髓后，注入濃度為1.0×108CFU/mL的糞腸球菌ATCC29212 液直至充滿髓腔，分別于術(shù)后第0、7、14、21 和28 天取樣行HE 染色，并通過免疫組織化學染色檢測JAK2 和STAT3 等相關(guān)蛋白的表達。研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后21 d 時，骨吸收達到峰值。王佳佳等[20]通過在鼠磨牙分別注入糞腸球菌及牙齦卟啉單胞菌，于術(shù)后12 周取樣，觀察二者在根尖周骨質(zhì)破壞的差異。

在根管內(nèi)封入優(yōu)勢菌可高效地建立模型，細菌濃度越高，出現(xiàn)病損的時間越短。

4 慢性根尖周炎SD 大鼠模型評價

根尖周炎的特征是牙槽骨破壞和根尖周肉芽組織形成。在慢性根尖周炎發(fā)生發(fā)展過程中能夠吸收及根尖周炎癥因子的研究將有助于加深筆者對慢性根尖周炎中細菌對根尖周組織破壞的了解，從而可以改善臨床診斷和治療。目前在慢性根尖周炎動物模型中常用影像學來直觀地觀察根尖周骨質(zhì)破壞情況，或者使用組織學、免疫組化染色以及實時PCR 來檢測根尖周炎癥因子的表達從而確定是否形成根尖周炎[21]。

4.1 影像學分析法

X 線檢測常用于確定根尖周是否有骨破壞，隨著影像科技的不斷發(fā)展，高分辨率的顯微 CT（micro-computed tomgraphy，micro-CT/μ-CT）在動物標本的研究中扮演著不可或缺的角色，在分析動物根尖周骨質(zhì)破壞方面的應用越來越廣[22]。micro-CT 分析法是一種以高度準確的方式對硬組織的3D 結(jié)構(gòu)進行成像和評估的方法[23]。其通過特定的3D 參數(shù)，可以無損，快速且非常準確地評估骨量和骨內(nèi)部微結(jié)構(gòu)[24]。

SD 大鼠建立根尖周炎模型后，可通過micro-CT 掃描大鼠根尖周組織，不僅可以直觀地觀察到根尖周組織破壞情況，而且還可以分析相關(guān)數(shù)據(jù)更準確地量化根尖周骨吸收情況。骨表面積骨體積比值（BS/BV）和骨表面積組織體積比值（BS/TV），可以反映根尖周骨量多少；骨體積分數(shù)（BV/TV）則反應樣本樣本中骨小梁骨量的多少，該值增大表明骨合成速率大于分解速率，反之亦然，從而反應骨代謝情況。

4.2 根尖周細胞因子

根尖周炎形成后，根尖區(qū)聚集大量炎癥細胞釋放炎癥介質(zhì)，導致根尖炎癥及骨質(zhì)破壞[21]。其中，TNF-α 和IL-6 是被認為根尖周的骨質(zhì)破壞有密切關(guān)系，根尖周炎時，常使用組織學、免疫組化染色以及實時PCR 檢測TNF-α 和IL-6 的表達情況來分析慢性根尖周炎時炎癥情況。

白細胞介素-6（IL-6）是一類與免疫及炎癥反應密切相關(guān)的炎癥因子，它可通過活化T 淋巴細胞、刺激巨噬細胞及B 細胞分化來實現(xiàn)造血及促進骨吸收的功能。在根尖周炎中，IL-6 可通過一系列的機制從而促進破骨細胞的表達，從而造成根尖周炎癥及骨吸收[25]。Azuma 等[26]通過體外研究發(fā)現(xiàn)，慢性根尖周炎患者的IL-6 表達水平較高，并且其水平與根尖周病變的大小成正比。Silva 等[27]研究發(fā)現(xiàn)在切除大鼠卵巢后誘導的根尖周炎與未切除卵巢組組相比，實驗牙根尖區(qū)炎癥程度更重，IL-6 表達水平更高。

腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）是一類重要的促炎細胞因子和免疫調(diào)節(jié)因子，在臨床根尖周炎病變組織和大鼠實驗性根尖周炎中均有較高表達。TNF-α 一方面能刺激炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，另一方面可通過促進破骨細胞的發(fā)育破壞骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)，導致根尖周骨破壞[28]。Ye 等[22]在建立大鼠根尖周模型后，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測TNF-α 以證明根管內(nèi)炎癥因子的表達。Tsosura 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在建立大鼠根尖周炎后，根尖區(qū)TNF-α 的表達量明顯升高。盡管TNF-α 與慢性根尖周炎具有一定關(guān)聯(lián)，但目前關(guān)于TNF-α 如何參與慢性根尖周炎的發(fā)病機制尚不明朗，在未來的研究中，應對其具體說明，為實驗研究提供更有價值的依據(jù)。

5 小結(jié)

目前常用于建立根尖周炎模型的動物有猴、犬、鼠及小型豬等，其中，SD 大鼠具有生長速度快、易培養(yǎng)、適應性強、價格低廉、易飼養(yǎng)等優(yōu)勢，而且其磨牙形態(tài)、口腔菌群與人類相似而常用于根尖周炎的研究。盡管關(guān)于SD 大鼠構(gòu)建慢性根尖周炎的研究已經(jīng)發(fā)展得較為成熟，對于理解疾病與宿主之間的交互關(guān)系、治療方法等方面，有著重大的意義。但是其并不能完全復制人類慢性根尖周炎的發(fā)生及發(fā)展過程。真正能夠模擬人類慢性根尖周炎自然發(fā)病機制、實用且重復性高的模型還亟待進一步探索和研發(fā)。