綠色合成石墨烯對(duì)水體中鎘離子的去除效果及其對(duì)大腸桿菌的毒性

周元元，甘 莉，陳祖亮

(福建省污染控制與資源循環(huán)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建師范大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院、碳中和現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)學(xué)院，福建 福州 350007)

還原氧化石墨烯(reduced graphene oxide,rGO)是一種sp2雜化碳同素異形體的二維納米材料[1]，結(jié)構(gòu)獨(dú)特，具有優(yōu)良的電性能，廣泛應(yīng)用于電子、能源和環(huán)境修復(fù)等多個(gè)研究領(lǐng)域[2].rGO中存在大量缺陷、褶皺和殘余的含氧官能團(tuán)，是染料、重金屬等污染物的理想吸附劑[3].目前，制備rGO的方法主要有化學(xué)氣相沉積法、外延生長(zhǎng)法和化學(xué)還原法[4].在現(xiàn)有的研究方法中，化學(xué)還原法簡(jiǎn)便且可大規(guī)模制備，是商業(yè)上常用的方法[5].然而由于化學(xué)還原過(guò)程涉及有毒還原劑，如聯(lián)氨和氫化鋁鋰等，可能對(duì)環(huán)境和人體產(chǎn)生毒害作用，在一定程度上限制了其應(yīng)用[2].

為避免化學(xué)還原法帶來(lái)的危害，人們開(kāi)始探索反應(yīng)條件溫和且對(duì)環(huán)境友好的綠色還原劑，其中含有大量抗氧化性物質(zhì)的植物提取液被用來(lái)作為氧化石墨烯的還原劑和穩(wěn)定劑[2，6].研究發(fā)現(xiàn)，綠茶提取液中的生物分子可將氧化石墨烯還原為rGO，并包裹rGO[7]；萬(wàn)壽菊花提取物也可作為還原劑合成rGO[8].但無(wú)論哪種方法合成的rGO都不可避免地進(jìn)入土壤、水體和大氣等生態(tài)環(huán)境中，因此研究rGO對(duì)人體健康和環(huán)境生態(tài)的危害十分必要.報(bào)道稱rGO會(huì)對(duì)心肌組織造成損傷，并會(huì)改變心肌組織中幾種心肌酶的活性[9].也有研究表明，石墨烯對(duì)污泥中嗜酸硫桿菌(Acidithiobacillussp.)的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響[10]，但目前對(duì)綠色合成的rGO毒性還缺乏系統(tǒng)的研究.

本文在前期研究的基礎(chǔ)上，利用桉樹葉提取液合成還原氧化石墨烯(EL-rGO)[2]，并去除水體中的Cd2+；同時(shí)通過(guò)觀察菌體形貌，測(cè)定大腸桿菌在rGO中的死細(xì)胞與活細(xì)胞的比例(簡(jiǎn)稱死/活比例)、乳酸脫氫酶(LDH)釋放量和細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平來(lái)評(píng)估EL-rGO與商業(yè)還原氧化石墨烯(C-rGO)對(duì)大腸桿菌的毒性.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

材料與試劑：石墨粉，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；商業(yè)石墨烯(C-rGO)，蘇州碳豐石墨烯科技有限公司；磷酸二氫鉀、十二水合磷酸氫二鈉、無(wú)水硫酸鎂、硝酸鉀、氯化銨、氯化鈉、葡萄糖和磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，上海麥克林生化科技有限公司；胰蛋白、酵母粉，英國(guó)OXOID公司；LDH測(cè)定試劑盒，南京建成生物研究所；LIVE/DEAD BacLight細(xì)菌活力試劑盒，美國(guó)賽默飛公司；ROS試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌，河南省工業(yè)微生物菌種工程技術(shù)研究中心；桉樹葉，福建省福清農(nóng)場(chǎng).所有化學(xué)試劑級(jí)別均為分析純.

儀器：UV-9000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；Regulus 8100掃描電鏡，日本日立公司；Guavaeasycyte 5 HPL流式細(xì)胞儀，美國(guó)Luminex公司；Agilent 200火焰原子吸收光譜儀，上海安捷倫科技公司.

1.2 氧化石墨烯的制備

采用改良Hummers法氧化石墨粉合成氧化石墨烯[2].

1.3 桉樹葉提取液合成還原氧化石墨烯

稱取干燥桉樹葉10.0 g磨成粉末加入到1.0 L超純水中，恒溫80 ℃水浴加熱1 h，冷卻過(guò)濾，得到桉樹葉提取液.將0.1 g氧化石墨烯與200.0 mL桉樹葉提取液混合，恒溫80 ℃攪拌8 h，待溶液冷卻至室溫用0.45 μm濾膜過(guò)濾，將固體分別用無(wú)水乙醇和超純水沖洗3次，冷凍干燥48 h[2].

1.4 鎘離子去除實(shí)驗(yàn)

將0.1 g C-rGO與EL-rGO分別投加到200.0 mL濃度為40 μmol·L-1、pH為6的Cd2+溶液中，恒溫25 ℃反應(yīng)，在5、10、20、40、60、120、180 min時(shí)取5 mL通過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾，利用火焰原子吸收光譜儀在228.8 nm波長(zhǎng)測(cè)定濾液中Cd2+質(zhì)量濃度，平行3組.通過(guò)式(1)計(jì)算去除率評(píng)價(jià)rGO對(duì)Cd2+的去除性能.

(1)

式中ρ0為Cd2+溶液的初始質(zhì)量濃度，mg·L-1；ρt為t時(shí)刻Cd2+的質(zhì)量濃度，mg·L-1.

1.5 毒性實(shí)驗(yàn)

1.5.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：10.0 g胰蛋白胨，5.0 g酵母提取物，10.0 g NaCl溶于1.0 L超純水中，121 ℃高壓滅菌21 min.

液體培養(yǎng)基：1.8 g KH2PO4，3.5 g Na2HPO4·12H2O，0.1 g MgSO4，1.0 g KNO3，3.0 g葡萄糖，1.0 g NH4Cl溶于1.0 L超純水中，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2，105 ℃高壓滅菌21 min.

1.5.2 還原氧化石墨烯對(duì)大腸桿菌的毒性實(shí)驗(yàn)

1.5.2.1 大腸桿菌預(yù)處理

將大腸桿菌接種至LB培養(yǎng)基中37 ℃、250 r·min-1培養(yǎng)12 h，移至離心管中，8 000 r·min-1離心3 min棄上清液，用PBS沖洗再離心，重復(fù)3次，加入PBS稀釋菌體制成菌懸液，用分光光度計(jì)測(cè)定600 nm處的光密度(D600 nm)，調(diào)節(jié)菌液D600 nm為1.0，于4 ℃條件下保存?zhèn)溆?按體積分?jǐn)?shù)3%的接種量將大腸桿菌分別接種至含1.0、50.0 mg·L-1C-rGO的液體培養(yǎng)基中.同時(shí)，按相同步驟將大腸桿菌分別接種至含1.0、50.0 mg·L-1EL-rGO的液體培養(yǎng)基中，于30 ℃在200 r·min-1恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h.以不含rGO作為空白對(duì)照，所有實(shí)驗(yàn)平行3次.

1.5.2.2 掃描電鏡測(cè)定

將1.5.2.1培養(yǎng)后的菌液離心收集菌體，PBS洗滌3次，用體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛緩沖液浸泡菌體過(guò)夜，固定后的菌體用體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液逐級(jí)脫水10 min，最后菌體冷凍干燥48 h，通過(guò)SEM觀察rGO作用大腸桿菌前后的表面形貌.

1.5.2.3 乳酸脫氫酶釋放量測(cè)定

將1.5.2.1處理后的菌液離心收集上清液，取50.0 μL按照LDH試劑盒要求測(cè)定上清液中的LDH含量.

1.5.2.4 活性氧含量測(cè)定

將1.5.2.1處理后的菌液收集菌體裝載探針.用PBS按照體積比1∶1 000稀釋熒光探針，使其濃度為20.0 μmol·L-1，將菌體懸浮于探針中，調(diào)節(jié)菌液濃度為每毫升菌液中含106～107個(gè)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)20 min，PBS洗滌3次，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè).

1.5.2.5 死細(xì)胞與活細(xì)胞測(cè)定

將1.5.2.1處理后的菌液離心收集菌體，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%無(wú)菌氯化鈉沖洗3次，稀釋和調(diào)節(jié)菌液濃度，使每毫升菌液中含106個(gè)細(xì)胞，取100.0 μL菌液，用LIVE/DEAD BacLight試劑盒染色，室溫下避光培養(yǎng)20 min，混合均勻用流式細(xì)胞儀測(cè)定，計(jì)算死細(xì)胞與活細(xì)胞的比例.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同還原氧化石墨烯對(duì)鎘離子的去除率

圖1是不同rGO去除Cd2+的時(shí)間曲線，C-rGO對(duì)Cd2+的去除速度慢且3 h后去除率僅為5.38%；而EL-rGO對(duì)Cd2+的去除速度快，5 min后去除率達(dá)61.9%，3 h后達(dá)70.2%，反應(yīng)60 min后達(dá)到平衡.由此可知，兩種rGO都能去除Cd2+，但EL-rGO的去除速度和效率遠(yuǎn)高于C-rGO.這可能是以下原因造成的：(1)EL-rGO表面帶負(fù)電荷，在較高的pH值下更容易形成靜電和螯合/絡(luò)合作用促進(jìn)吸附Cd2+[11]；(2)EL-rGO表面覆蓋的生物質(zhì)使其具有較好的分散性，能夠均勻地分散在Cd2+溶液中，提升了EL-rGO與Cd2+的傳質(zhì)效率[7]，從而提高了去除率；(3)提取液中的生物質(zhì)包裹EL-rGO，增強(qiáng)了材料的共軛結(jié)構(gòu)，提高了供電子能力，絡(luò)合更多的Cd2+[7].通過(guò)比較兩種材料對(duì)Cd2+的去除率，EL-rGO有較高的去除率，可作為吸附劑繼續(xù)研究，但使用EL-rGO是否產(chǎn)生毒性效應(yīng)，還需進(jìn)一步研究.

圖1 EL-rGO與C-rGO對(duì)Cd2+的去除率-時(shí)間曲線Fig.1 Removal efficiency-time curves of EL-rGO and C-rGO for Cd2+

2.2 毒性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 掃描電鏡測(cè)定

大腸桿菌與不同rGO共存后的表面形貌如圖2所示，圖2a是對(duì)照組，大腸桿菌呈短桿狀，結(jié)構(gòu)完整且表面紋路清晰.圖2b和2c則是經(jīng)過(guò)1.0、50.0 mg·L-1C-rGO處理后大腸桿菌的形貌，菌體呈現(xiàn)不同程度的碎裂、裂解，甚至有部分菌體碎裂成不規(guī)則的碎片.在可視范圍內(nèi)，50.0 mg·L-1C-rGO中的菌體損傷情況比1.0 mg·L-1C-rGO嚴(yán)重.這是因?yàn)閞GO比較鋒利，切割和刮破菌體，大量細(xì)胞質(zhì)外排.這與文獻(xiàn)報(bào)道的聯(lián)氨合成的rGO具有鋒利的邊緣導(dǎo)致菌體損傷，從而使rGO具有更高的抗菌活性相符[12].圖2d是1.0 mg·L-1EL-rGO處理的大腸桿菌形貌，細(xì)菌表面紋路清晰，在可視范圍內(nèi)小部分菌體發(fā)生破裂；而圖2e是經(jīng)過(guò)50.0 mg·L-1EL-rGO處理后，菌體之間不規(guī)則地黏結(jié)在一起，在可視范圍破損較少，表面紋路模糊，這可能是EL-rGO包裹在菌體表面[13].在質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，相較于EL-rGO，C-rGO中菌體表面光滑，破損較多；而質(zhì)量濃度為50.0 mg·L-1時(shí)，C-rGO中的菌體破損明顯增加，EL-rGO中菌體表面更粗糙.總體而言，兩種rGO對(duì)大腸桿菌都會(huì)造成損傷，這是由于機(jī)械破碎和附著包裹作用，且在相同濃度下，C-rGO處理的大腸桿菌比EL-rGO處理的破損嚴(yán)重，損傷更大.

(a)對(duì)照組；(b)1.0 mg·L-1 C-rGO+菌；(c)50.0 mg·L-1 C-rGO+菌；(d)1.0 mg·L-1 EL-rGO+菌；(e)50.0 mg·L-1 EL-rGO+菌圖2 不同質(zhì)量濃度rGO處理大腸桿菌的掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron micrographs of E.coli treated with different concentrations of rGO

2.2.2 細(xì)胞外乳酸脫氫酶測(cè)定

LDH是一種穩(wěn)定存在于細(xì)胞內(nèi)部的酶，反映細(xì)胞膜損傷程度和細(xì)胞膜的通透性[14].圖3是大腸桿菌在1.0、50.0 mg·L-1rGO中的LDH釋放情況，以空白組為100%來(lái)對(duì)比各實(shí)驗(yàn)組.在C-rGO實(shí)驗(yàn)組中，1.0 mg·L-1C-rGO處理后的大腸桿菌LDH釋放量高于50.0 mg·L-1處理的大腸桿菌，這是由于低質(zhì)量濃度的C-rGO難以在菌液中團(tuán)聚，與大腸桿菌細(xì)胞的相互作用更大，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，而50.0 mg·L-1比1.0 mg·L-1的C-rGO更容易團(tuán)聚[10]，相互作用小，從而損傷較小.而在EL-rGO實(shí)驗(yàn)組中，50.0 mg·L-1中的大腸桿菌LDH的釋放量比1.0 mg·L-1中的LDH釋放量高，說(shuō)明在50.0 mg·L-1EL-rGO下，大腸桿菌細(xì)胞的受損程度增加.同時(shí)所有實(shí)驗(yàn)組的LDH釋放量均高于對(duì)照組，這表明兩種rGO都破壞了細(xì)胞膜的完整性，對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜造成機(jī)械損傷，觸發(fā)膜應(yīng)激反應(yīng)[10，14].

圖3 大腸桿菌在不同濃度rGO作用下LDH相對(duì)釋放量Fig.3 Relative release of LDH from E.coli under the action of different concentrations of rGO

2.2.3 細(xì)胞內(nèi)活性氧分析

細(xì)胞受到外界刺激會(huì)做出氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的ROS含量瞬時(shí)增加，致使細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化狀態(tài)失去平衡，發(fā)生氧化應(yīng)激[15].圖4為1.0、50.0 mg·L-1rGO作用大腸桿菌48 h后細(xì)胞內(nèi)ROS的含量變化，以空白組為100%來(lái)對(duì)比ROS產(chǎn)生情況，實(shí)驗(yàn)組的ROS產(chǎn)生量均高于對(duì)照組，說(shuō)明大腸桿菌在兩種rGO作用下都會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激.在相同濃度下，EL-rGO組的大腸桿菌ROS產(chǎn)生量均高于C-rGO組，說(shuō)明大腸桿菌在EL-rGO中氧化應(yīng)激較強(qiáng)，這可能是EL-rGO表面的生物質(zhì)包裹層與細(xì)菌細(xì)胞接觸，甚至進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)相互作用，誘導(dǎo)較多的脂質(zhì)過(guò)氧化(LPO)[16]，導(dǎo)致細(xì)胞膜流動(dòng)性和通透性發(fā)生變化，細(xì)胞活力降低，最終細(xì)胞死亡[17].

圖4 不同質(zhì)量濃度rGO處理后的大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的ROS水平變化Fig.4 Changes in intracellular ROS levels in E.coli treated with different concentrations of rGO

2.2.4 死細(xì)胞和活細(xì)胞比例分析

LIVE/DEAD BacLight試劑盒是基于細(xì)胞膜的完整性而對(duì)細(xì)菌群體的活力進(jìn)行監(jiān)測(cè)，已經(jīng)或即將死亡的大腸桿菌因細(xì)胞膜受到損傷被染成紅色；而細(xì)胞膜完整的細(xì)胞被染成綠色[18].圖5是大腸桿菌在不同質(zhì)度濃度的C-rGO與EL-rGO作用下的死/活比例.50.0 mg·L-1rGO中的大腸桿菌死/活比例高于1.0 mg·L-1rGO中的大腸桿菌.說(shuō)明rGO毒性受質(zhì)量濃度的影響，這與ROS結(jié)果相符.在1.0 mg·L-1時(shí)，C-rGO與EL-rGO中的大腸桿菌的死/活比例分別為1.25和1.26，表明兩種rGO對(duì)大腸桿菌都有影響，但兩者差別不大.而50.0 mg·L-1時(shí)，EL-rGO中的死/活比例為1.9，高于C-rGO中大腸桿菌的死/活比例，表明50.0 mg·L-1的EL-rGO比C-rGO毒性略大，初步推測(cè)EL-rGO表面覆蓋有抗菌活性的生物質(zhì)[19]，導(dǎo)致毒性較大.但同時(shí)也證明EL-rGO比C-rGO抗菌性能更好，更適合作為抗菌材料.

圖5 大腸桿菌在不同rGO中的死/活比例Fig.5 Dead/live ratio of E.coli in different rGO

3 結(jié)論

(1)25 ℃時(shí)，在pH=6，40 μmol·L-1的Cd2+溶液中投加0.1 g·L-1rGO，3 h后EL-rGO對(duì)Cd2+的去除率達(dá)70.2%，遠(yuǎn)高于C-rGO對(duì)Cd2+的去除率5.38%，說(shuō)明EL-rGO對(duì)重金屬污染物有較高的去除率.

(2)通過(guò)掃描電鏡觀察，結(jié)合大腸桿菌在rGO中的死/活比例、乳酸脫氫酶相對(duì)釋放量和胞內(nèi)活性氧水平的測(cè)定可知，兩種rGO在1.0 mg·L-1時(shí)，均可破壞大腸桿菌細(xì)胞膜的完整性，造成細(xì)胞損傷，但毒性差別不大；在50.0 mg·L-1時(shí)，EL-rGO毒性則相對(duì)略大，具有一定的抗菌性能，可作為抗菌材料研究.

(3)EL-rGO合成過(guò)程綠色友好，不涉及有毒物質(zhì)，有利于EL-rGO在環(huán)境領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用.