鮑曼不動桿菌外膜囊泡誘發(fā)人單核-巨噬細胞THP-1的炎性反應(yīng)

付士祥，席 月，丁龍坤，閆 曼，趙 俊，焦玉東，吳 亮*

1.揚州市第三人民醫(yī)院，江蘇 揚州 225000； 2. 江蘇大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013

鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii,A.baumannii)是目前臨床常見病原菌，近年來各類抗生素的長期大量使用，鮑曼不動桿菌耐藥性迅速增強，多重/泛耐藥菌株在臨床中的分離率迅速上升，由此誘發(fā)的呼吸機相關(guān)性肺炎給重癥患者的救治帶來了巨大挑戰(zhàn)[1]。目前對于鮑曼不動桿菌耐藥性研究較多，但對其毒力機制的研究卻滯后，嚴重阻礙了臨床鮑曼不動桿菌感染的治療[2]。鮑曼不動桿菌侵入宿主細胞后可以誘發(fā)宿主強烈免疫反應(yīng)并造成炎性損傷，進而誘發(fā)急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征[3]。鮑曼不動桿菌的各種毒力因子不僅誘發(fā)宿主組織和細胞炎性損傷，還可以幫助細菌逃避宿主免疫清除。已知的鮑曼不動桿菌毒力因子包括：外膜囊泡、外膜蛋白質(zhì)和生物被膜等[4]。

外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs)是近年來新發(fā)現(xiàn)的革蘭陰性菌的一種全新分泌模式，OMVs內(nèi)含高濃度且結(jié)構(gòu)完整的細菌毒力蛋白質(zhì)并可以進行長距離轉(zhuǎn)運，將毒力蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運至遠處器官發(fā)揮致病作用[5]。OMVs通常來源于細菌外膜系統(tǒng)，故稱細菌外膜囊泡，是由外膜、周質(zhì)蛋白質(zhì)、磷脂和LPS構(gòu)成。OMVs直徑約為20～250 nm，內(nèi)含各種外膜蛋白質(zhì)、miRNA、lncRNA等毒力成分，在細菌致病過程中發(fā)揮重要作用。鮑曼不動桿菌可以分泌OMVs，但對其OMVs的致病作用仍缺乏充分研究。本研究通過超速離心法純化制備鮑曼不動桿菌OMVs，并探討OMVs誘導(dǎo)巨噬細胞THP-1炎性反應(yīng)能力。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

人單核白血病細胞系THP-1(中科院細胞庫)由本實驗室自行保種和培養(yǎng)；鮑曼不動桿菌標準菌株(ATCC 19606)(南京鼓樓醫(yī)院檢驗科周萬青博士惠贈)；RPMI 1640細胞培養(yǎng)液和胎牛血清(BI公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒(SYBR Green染料法)、總RNA提取試劑盒(南京諾唯贊生物科技公司)；引物(蘇州金唯智生物科技公司合成)；RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑(PMSF)、細胞核蛋白質(zhì)和細胞質(zhì)蛋白質(zhì)抽提試劑盒、活性氧檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；IL-1β檢測試劑盒(ELISA)(江蘇酶免實業(yè)有限公司)；兔抗NLRP3、caspase-1、Beclin-1、LC3-Ⅱ、鼠抗β-肌動蛋白抗體和HRP標記的山羊抗兔或鼠抗體(武漢ABclonal生物科技公司)；細胞caspase-3酶活性測定試劑盒(北京Solarbio生物技術(shù)公司)；ECL顯色液(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 鮑曼不動桿菌OMVs的提純： 常規(guī)方法增菌培養(yǎng)鮑曼不動桿菌標準株，參考文獻[6]方法提純細菌OMVs，所提純OMVs重溶于適量無菌PBS緩沖液并保存于4℃中，BCA法試劑盒檢測蛋白濃度，經(jīng)2.5%戊二醛固定后送揚州大學(xué)測試中心進行透射電鏡分析。

1.2.2 THP-1細胞-OMVs共孵育： 按常規(guī)方法培養(yǎng)THP-1細胞，取對數(shù)增殖期細胞接種于6孔板(1×106個/孔)，12 h后加入100 μg/mL佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)誘導(dǎo)12 h轉(zhuǎn)化為巨噬態(tài)(PMA-stimtilated THP-1 cell)(即細胞絕大部分貼壁)，再分別加入5和50 μg/mL的OMVs，同時設(shè)正常對照組，繼續(xù)培養(yǎng)1、3 和6 h后終止實驗，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 RT-qPCR檢測mRNA： 使用Trizol法抽提THP-1細胞總RNA，參照文獻[7]報道方法檢測NLRP3炎性復(fù)合體mRNA表達水平。以GAPDH作為內(nèi)參，通過公式2-△△Ct計算基因相對表達量。引物序列(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.4 ELISA檢測IL-1β:收集各組細胞培養(yǎng)上清液采用ELISA試劑盒檢測上清液中IL-1β濃度，使用酶標儀在450 nm處測吸光度值，繪制標準曲線并計算各組細胞上清液中IL-1β濃度。

1.2.5 酶促動力學(xué)法檢測caspase-3活性:嚴格按照試劑盒說明書，收集1×106個細胞并以無菌PBS緩沖液充分洗滌去除殘留培養(yǎng)液。細胞中加入100 μL裂解液于冰上裂解15 min，以4 ℃、14 000 r/min離心15 min后吸取上清轉(zhuǎn)移至新離心管中并立即用于caspase-3酶活性檢測。在離心管中逐次加入檢測緩沖液80 μL、待測樣本10 μL和反應(yīng)底物Ac-DEVD-pNA(2 mmol/L) 10 μL后充分混勻并于37 ℃中避光反應(yīng)90 min，分光光度計檢測A405吸光度值。同時設(shè)置空白對照組以蒸餾水代替待測樣本，并檢測其吸光度值。實驗組△A405=測定管A405-空白對照管A405(樣本中caspase-3催化產(chǎn)生的pNA產(chǎn)生的吸光度)，通過標準曲線計算樣本的caspase-3酶活性。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測目的蛋白:采用文獻[7]報道方法檢測NLRP3、caspase-1、LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達量，以鼠抗β-肌動蛋白抗體為內(nèi)參。經(jīng)兩輪抗體孵育后采用ECL顯色液曝光顯色，通過灰度掃描分析各個目的蛋白相對表達量。

1.2.7 流式細胞測量術(shù)檢測活性氧：按照試劑盒說明書采用2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)探針法檢測THP-1細胞活性氧水平。將細胞與DCFH-DA探針孵育后用于流式細胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 OMVs的超微結(jié)構(gòu)

OMVs為典型的圓形囊泡狀，由脂質(zhì)雙分子層包裹，呈現(xiàn)經(jīng)典“盤杯狀”特征。大小約160 nm，其內(nèi)可見低電子密度物質(zhì)(圖1)。

2.2 OMVs誘導(dǎo)NLRP3炎性復(fù)合體活化

不同濃度OMVs作用THP-1細胞時，NLRP3和caspase-1的mRNA表達量較對照組顯著升高(P<0.05)。作用3 h時，50 μg/mL組NLRP3的mRNA表達量顯著高于5 μg/mL組(P<0.05)(圖2)。

2.3 細胞培養(yǎng)上清中IL-1β含量

不同濃度OMVs作用THP-1細胞，THP-1細胞培養(yǎng)液上清中IL-1β含量較對照組均顯著升高(P<0.05)。1和3 h時，50 μg/mL組細胞培養(yǎng)液上清IL-1β含量顯著高于5 μg/mL組(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with the control group; # P<0.05 compared with the 5 μg/mL group圖3 THP-1細胞培養(yǎng)液上清中IL-1β含量Fig 3 Content of IL-1β in supernatant of THP-1 cells

2.4 細胞caspase-3活性

以不同濃度OMVs處理THP-1細胞后，細胞caspase-3酶活性較對照組均顯著升高(P<0.05)(圖4)。

2.5 THP-1細胞自噬相關(guān)蛋白的表達

以不同濃度OMVs處理THP-1細胞后， THP-1細胞LC3-Ⅱ和Beclin-1表達量較對照組顯著升高(P<0.05)。3 h時，50 μg/mL組細胞Beclin-1表達量顯著高于5 μg/mL組(P<0.05)。與對照組比，5 μg/mL組Beclin-1蛋白表達僅在6 h相對升高(P<0.05)。隨著OMVs作用濃度和時間的增加，在1和3 h 時THP-1細胞LC3-Ⅱ蛋白表達量逐漸升高，50 μg/mL組LC3-Ⅱ表達量顯著高于5 μg/mL組(P<0.05)(圖5)。

*P<0.05 compared with the control group圖4 THP-1細胞caspase-3活性Fig 4 Caspase-3 activity in THP-1

2.6 OMVs誘導(dǎo)THP-1細胞生成活性氧

不同濃度OMVs作用THP-1細胞1 h時，5和50 μg/mL組細胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)表達量均明顯高于對照組(P<0.05)；3 h時，僅5 μg/mL組細胞活性氧表達量顯著高于對照組(P<0.05)(圖6)。

*P<0.05 compared with the control group; # P<0.05 compared with the 5 μg/mL group圖5 THP-1細胞自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1表達量Fig 5 Expression of autophagy related proteins LC3-Ⅱ and Beclin-1 in THP-1

*P<0.05 compared with the control group圖6 THP-1細胞活性氧(ROS)表達Fig 6 ROS exprssion in THP-1

3 討論

細菌毒力因子在其侵入宿主細胞及逃避宿主免疫系統(tǒng)清除中發(fā)揮重要作用。外膜囊泡(OMVs)是細菌毒力蛋白質(zhì)的一種新型轉(zhuǎn)運載體，可以攜帶細菌的各種毒力蛋白質(zhì)從病灶處向遠方器官轉(zhuǎn)運。OMVs中所攜帶的毒力蛋白質(zhì)較胞漿中的純度更高且結(jié)構(gòu)完整，其致病作用更強[8]，但鮑曼不動桿菌OMVs致病能力仍缺乏深入研究。

本研究結(jié)果表明，鮑曼不動桿菌OMVs可以誘導(dǎo)THP-1細胞(monocyte-derrved macrophages/PMA-stimulated THP-1 cells)NLRP3炎性復(fù)合體活化和IL-1β大量表達，且上述炎性因子表達量與OMVs濃度和作用時間呈正相關(guān)。適度炎性反應(yīng)可以清除侵入病原體并介導(dǎo)組織修復(fù)[9]，但嚴重感染時(如急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征)的過度炎性反應(yīng)會進一步誘發(fā)“細胞因子風(fēng)暴”及組織器官損傷[10]。其他革蘭陰性桿菌OMVs也有類似功能，如肺炎克雷伯菌OMVs可以誘導(dǎo)HEp-2細胞和U937細胞產(chǎn)生大量炎性因子，并且誘導(dǎo)小鼠肺部出現(xiàn)與肺炎克雷伯菌直接感染相似的組織損傷[11]。有研究表明不同耐藥性鮑曼不動桿菌OMVs的毒力并不相同，似乎隨著耐藥性增加而下降，上述情況值得進一步研究[12]。

凋亡和自噬是真核細胞的特殊死亡現(xiàn)象，具有維持生命體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)兩種濃度的鮑曼不動桿菌OMVs均可以顯著誘導(dǎo)THP-1細胞自噬和凋亡。適度自噬和凋亡可以下調(diào)炎性反應(yīng)水平，其機制可能是通過誘導(dǎo)巨噬細胞的自噬和凋亡以清除受損線粒體，減少活性氧和線粒體DNA釋放，同時降解caspase-1前體以抑制NLRP3炎性小體活化，繼而抑制IL-1β成熟[13]。但大量巨噬細胞的自噬和凋亡會減少人體內(nèi)免疫細胞數(shù)量，降低固有免疫力，反而有利于細菌增殖。本研究結(jié)果顯示在OMVs作用下，THP-1細胞感染1 和3 h時自噬和凋亡水平較高，感染6 h 時細胞NLRP3表達量降低，這可能與細胞大量死亡有關(guān)。

綜上所述，鮑曼不動桿菌OMVs可以誘發(fā)宿主巨噬細胞的自噬和凋亡，并激活NLRP3炎性復(fù)合體和增加活性氧的生成。但大量巨噬細胞死亡反而有利于細菌大量增殖并加重炎性反應(yīng)。因此，對于鮑曼不動桿菌感染者，仍應(yīng)該盡早主動采用抗生素清除細菌，降低患者體內(nèi)細菌和OMVs數(shù)量，預(yù)防嚴重感染誘發(fā)“細胞因子風(fēng)暴”。