LncRNA MINCR靶向miR-223抑制LPS誘導(dǎo)的人肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549損傷和炎性反應(yīng)

楊廣林，任麗娟，陳文靜，熊維軍

四川護(hù)理職業(yè)學(xué)院附屬醫(yī)院/四川省第三人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，四川 成都 610100

急性肺損傷疾病屬于一種急性炎性反應(yīng)，是由肺內(nèi)、外各種因素引起的肺損傷，該疾病嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展成為急性呼吸窘迫綜合征，致死率高達(dá)90%[1]。肺泡上皮細(xì)胞損傷屬于急性肺損傷的一種，因此研究肺泡上皮細(xì)胞損傷的機(jī)制顯得尤為重要。內(nèi)毒素在許多研究中被發(fā)現(xiàn)可引起肺損傷疾病，其主要成分是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，可引起肺泡上皮細(xì)胞凋亡，參與肺損傷的發(fā)生[2-3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是目前研究過程中新發(fā)現(xiàn)的一類非編碼RNA分子，而lncRNA MINCR作為lncRNA家族中的一員，在許多疾病中異常表達(dá)，例如，lncRNA MINCR在原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)水平顯著增加[4]。微小RNA(microRNA，miRNA)與許多疾病的病理生理過程密切相關(guān)，尤其是全身炎性反應(yīng)綜合征、急性肺損傷的免疫調(diào)節(jié)[5]。在全身炎性反應(yīng)過程中，miRNAs可以對(duì)許多炎性因子、轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而參與炎性細(xì)胞增殖、產(chǎn)生和釋放多種炎性因子[6]。miR-223作為miRNAs中的一員，在不同疾病的過程中發(fā)揮不同的作用。然而，miR-223在急性肺損傷中的表達(dá)和作用機(jī)制仍不清楚。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)到lncRNA MINCR與miR-223存在結(jié)合位點(diǎn)。因此,本研究以肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549為研究對(duì)象，探索lncRNA MINCR靶向調(diào)節(jié)miR-223對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷和炎性反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：人肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫)。

1.1.2 試劑： LPS[酷爾化學(xué)科技(北京)有限公司]；含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基(Giboc公司)；RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Genecopoeia公司)；白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒(酶聯(lián)生物科技有限公司)；活化的半胱天冬氨酸蛋白酶-3(cleave caspase-3)、B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma 2，Bcl-2)一抗(Abcam公司)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen公司)；野生型和突變型MINCR熒光素酶報(bào)告基因載體(MINCR WT、MINCR MUT)、Si NC(MINCR陰性對(duì)照)和Si MINCR(MINCR干擾載體)、miR-223 NC(miR-223陰性對(duì)照)、miR-223模擬物(miR-223 mimics)、miR-223抑制物(miR-223 antagomir)以及MINCR、miR-223、U6、β-actin引物(上海生工生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及轉(zhuǎn)染：將A549細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基接種，置于培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)中培養(yǎng)，待細(xì)胞增殖至80%～90%匯合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

將A549細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和LPS組、LPS+轉(zhuǎn)染組(Si NC組、Si MINCR組、miR-223 NC組、miR-223 mimic組、Si NC+miR-223 NC組、Si NC+miR-223 antagomir組、Si MINCR+miR-223 NC組、Si MINCR+miR-223 antagomir組)，其中LPS組選用對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞采用10 μg/mL LPS[8]進(jìn)行誘導(dǎo)24 h；Si NC組、Si MINCR組、miR-223 NC組、miR-223 mimic組、Si NC+miR-223 NC組、Si NC+miR-223 antagomir組、Si MINCR+miR-223 NC組、Si MINCR+miR-223 antagomir組待細(xì)胞匯合至50%～60%時(shí)，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒分別轉(zhuǎn)染Si NC、Si MINCR、miR-223 NC、miR-223 mimic、Si NC+miR-223 NC、Si NC+miR-223 antagomir、Si MINCR+miR-223 NC、Si MINCR+miR-223 antagomir至細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，再加入10 μg/mL LPS誘導(dǎo)24 h。

1.2.2 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證MINCR和miR-223靶向關(guān)系：Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)MINCR、miR-223存在結(jié)合位點(diǎn)。取對(duì)數(shù)增殖期的A549細(xì)胞接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為MINCR WT+miR-223 NC組、MINCR WT+miR-223 mimics組、MINCR MUT+miR-223 NC組、MINCR MUT+miR-223 mimics組，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)。按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后，收集上清液檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中MINCR、miR-223表達(dá)水平：選取各組細(xì)胞，用RNA抽提試劑盒提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行用RT-qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系、條件參照RT-qPCR試劑盒說明書。分別以U6、β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct計(jì)算MINCR、miR-223相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見表1。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率:收集各組細(xì)胞，懸浮細(xì)胞后，加入5 μL annexin V-FITC與碘化丙啶，室溫避光孵育15 min；流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primers of RT-qPCR

1.2.5 ELISA檢測(cè)炎性因子:收集各組細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)上清液中IL-6、TNF-α水平。

1.2.6 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中cleaved caspase-3、Bcl-2的表達(dá)水平:收集各組細(xì)胞，加入裂解液，BAC法測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)至PVDE膜，牛奶封閉，依次加入稀釋后cleaved caspase-3、Bcl-2、β-actin一抗，4 ℃恒溫箱過夜；加入活化辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，用ECL顯色試劑盒顯色、拍照，用Image分析灰度值，得出目的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中MINCR、miR-223表達(dá)水平

與對(duì)照組相比，LPS組MINCR顯著增加(P<0.05)，而miR-223表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)(表2)。

表2 LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中MINCR、miR-223表達(dá)水平比較

2.2 MINCR與miR-223靶向關(guān)系的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)MINCR、miR-223存在結(jié)合位點(diǎn)。MINCR WT+miR-223 NC組相比，MINCR WT+miR-223 mimics組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)(圖1，表3)。

WT.wild-type；MUT.mutant-type圖1 Starbase預(yù)測(cè)MINCR、miR-223結(jié)合位點(diǎn)Fig 1 Starbase predicted the binding sites of MINCR and miR-223

表3 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)MINCR、miR-223的靶向關(guān)系

2.3 干擾MINCR對(duì)A549細(xì)胞中MINCR表達(dá)、凋亡、炎性因子的影響

與對(duì)照組相比，LPS組、Si NC組細(xì)胞凋亡率、IL-6、TNF-α含量、MINCR表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與Si NC組相比，Si MINCR組細(xì)胞凋亡率、IL-6、TNF-α含量、MINCR表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖2，表4)。

2.4 過表達(dá)miR-223對(duì)A549細(xì)胞中miR-223表達(dá)、凋亡、炎性因子的影響

與對(duì)照組相比，LPS組、miR-223 NC組細(xì)胞凋亡率、IL-6、TNF-α含量顯著增加(P<0.05)，miR-223表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與miR-223 NC組相比，miR-223 mimic組細(xì)胞凋亡率、IL-6、TNF-α含量顯著降低(P<0.05)，miR-223表達(dá)顯著增加(P<0.05)(圖2，表5)。

2.5 干擾MINCR或過表達(dá)miR-223對(duì)A549細(xì)胞中cleaved caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，LPS組、Si NC組、miR-223 NC組cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與LPS組、Si NC組相比，Si MINCR組cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與LPS組、miR-223 NC組相比，miR-223 mimic組cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)(圖3，表6)。

圖2 干擾MINCR或過表達(dá)miR-223后細(xì)胞凋亡檢測(cè)Fig 2 Apoptosis detection after interference with MINCR or over-expression of miR-223

表4 干擾MINCR對(duì)A549細(xì)胞中MINCR表達(dá)、凋亡、炎性因子的影響

表5 過表達(dá)miR-223對(duì)A549細(xì)胞中miR-223表達(dá)、凋亡、炎性因子的影響

A.control; B.LPS group; C.Si NC; D.Si MINCR; E.miR-223 NC; F.miR-223 mimic圖3 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞cleaved caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)Fig 3 Western blot showed cleaved caspase-3 and Bcl-2 protein expression in each group

2.6 干擾MINCR和抑制miR-223對(duì)A549細(xì)胞中凋亡、炎性因子的影響

與Si NC+miR-223 NC組相比，Si NC+miR-223 antagomir組細(xì)胞凋亡率、IL-6、TNF-α含量均顯著增

加(P<0.05)，Si MINCR+miR-223 NC組細(xì)胞凋亡率、IL-6、TNF-α含量均顯著降低(P<0.05)；與Si NC+miR-223 antagomir組相比，Si MINCR+miR-223 antagomir組細(xì)胞凋亡率、IL-6、TNF-α含量均顯著降低(P<0.05)；與Si MINCR+miR-223 NC組相比，Si MINCR+miR-223 antagomir組細(xì)胞凋亡率、IL-6、TNF-α含量均顯著增加(P<0.05)(圖4，表7)。

圖4 干擾MINCR和抑制miR-223對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig 4 Effects of interference with MINCR and inhibition of miR-223 on cell apoptosis

表7 干擾MINCR和抑制miR-223對(duì)A549細(xì)胞中凋亡、炎性因子的影響

2.7 干擾MINCR和抑制miR-223對(duì)A549細(xì)胞中cleaved caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

與Si NC+miR-223 NC組相比，Si NC+miR-223 antagomir組cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，Si MINCR+miR-223 NC組cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與Si NC+miR-223 antagomir組相比，Si MINCR+miR-223 antagomir組cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與Si MINCR+miR-223 NC組相比，Si MINCR+miR-223 antagomir組cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖5，表8)。

3 討論

急性肺損傷屬于急性重癥疾病，臨床上主要病理表現(xiàn)為肺泡上皮細(xì)胞損傷、通透性增加、腔內(nèi)釋放

A.Si NC+miR-223 NC; B.Si NC+miR-223 antagomir; C.Si MINCR+miR-223 NC; D.Si MINCR+miR-223 antagomir圖5 干擾MINCR和抑制miR-223對(duì)cleavedcaspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig 5 Effects of interference with MINCR and inhibi- tion of miR-223 on the expression of cleaved caspase-3 and Bcl-2 proteins

表8 干擾MINCR和抑制miR-223對(duì)cleavedcaspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

多種炎性因子[8]。目前臨床治療方法主要是輔助通氣和藥物治療[9]。了解急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展及其調(diào)控機(jī)制可為臨床上提供靶向藥物提供依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)采用LPS誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549，以建立急性肺損傷體外細(xì)胞模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MINCR顯著增加，提示肺泡上皮細(xì)胞損傷可能與MINCR的高表達(dá)密切相關(guān)。研究表明lncRNAs可以通過調(diào)控基因表達(dá)，參與急性肺損傷的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和炎性浸潤(rùn)。研究發(fā)現(xiàn)干擾lncRNA MALAT1的表達(dá)，可以上調(diào)BMI-111，進(jìn)而降低炎性浸潤(rùn)和細(xì)胞凋亡，改善LPS誘導(dǎo)的肺損傷[10]。MINCR作為最新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其作用成為目前研究的熱點(diǎn)。在LPS誘導(dǎo)急性肺損傷細(xì)胞模型中，MINCR的表達(dá)水平顯著增加，干擾MINCR表達(dá)，可以抑制細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)細(xì)胞活力，從而改善肺泡細(xì)胞受損[11]。本研究發(fā)現(xiàn)干擾MINCR可以減緩炎性浸潤(rùn)以及細(xì)胞凋亡，減緩肺泡細(xì)胞受損，與之前報(bào)道一致。

miR-223作為miRNA家族中的一員，在肺部疾病中表現(xiàn)較為突出。在肺結(jié)核大鼠肺組織中，miR-223表達(dá)水平降低，影響細(xì)胞凋亡[12]。在LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞和急性肺損傷模型小鼠中，下調(diào)miR-223表達(dá)可導(dǎo)致LPS引起的肺損傷[13]。本研究發(fā)現(xiàn)提示過表達(dá)miR-223可以抑制炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡，減少肺細(xì)胞損傷，與之前報(bào)道相吻合。本研究進(jìn)一步證實(shí)MINCR與miR-223存在靶向關(guān)系，推測(cè)MINCR可能通過靶向調(diào)控miR-223影響A549細(xì)胞的損傷。MINCR通過海綿吸附miR-223，激活下游蛋白質(zhì)表達(dá)，降低鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性[14]。本研究細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-223 antagomir后，可逆轉(zhuǎn)Si MINCR發(fā)揮的作用。因此推測(cè)MINCR通過靶向上調(diào)miR-223表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞損傷。

綜上所述，MINCR可能通過靶向上調(diào)miR-223表達(dá)，改善LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞炎性反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞損傷，為急性肺損傷及其治療提供新的靶點(diǎn)，但由于MINCR作用靶點(diǎn)較多且急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，仍需要進(jìn)一步研究。