miR-504調(diào)控蛋白酶體激活因子抑制人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7增殖及遷移

楊良權(quán)，于 淼，姜 茜，張明慧，楊海松

1.秦皇島市婦幼保健院 乳腺外科，河北 秦皇島 066000；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 乳腺外科，貴州 貴陽(yáng) 550004

乳腺癌(breast cancer)是全球性女性癌相關(guān)疾病死亡的主要原因[1-2]，現(xiàn)階段化學(xué)藥物療法仍是乳腺癌治療的重要組成部分[3]，但隨后導(dǎo)致的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，仍是乳腺癌診斷和治療面臨的主要臨床挑戰(zhàn)。

MicroRNA(miRNA) 是20 nt左右長(zhǎng)度的一類ncRNA，在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用。研究顯示在乳腺癌中miRNA特異性表達(dá)參與調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、凋亡、自噬以及遷移等。miR-200 b通過(guò)調(diào)節(jié)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231參與乳腺病理進(jìn)程[4]。miR-99a通過(guò)靶向調(diào)控HOXA1抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲[5]。miR-34家族可抑制p53介導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)，抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展[6]。特異性miR-504異常表達(dá)與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，本研究通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)蛋白酶體激活因子復(fù)合體亞基 3(proteasome activator subunit 3， PSME3)是miR-504的潛在靶點(diǎn)，但miR-504與PSME3在乳腺癌中的作用機(jī)制暫未發(fā)現(xiàn)，故本研究擬通過(guò)小鼠模型中miR-504對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響，并分析miR-504調(diào)控PSME3對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，最終闡明miR-504在乳腺癌中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 樣本、細(xì)胞與試劑

乳腺癌組織標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本來(lái)自秦皇島市婦幼保健院88例接受手術(shù)的乳腺癌患者，以上標(biāo)本涉及的所有患者均簽署知情同意書，并獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)202100012)。

人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心)；Western blot檢測(cè)試劑盒(上海雅酶生物科技有限公司)；PCR相關(guān)試劑、引物、檢測(cè)試劑盒(Invitrogen公司)；PSME3、Ki67抗體(Abcam 公司)；CCK-8試劑盒(HyClone公司)；胎牛血清(ClarkBio公司)。BALB/c裸鼠(北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染分組處理：將MCF-7細(xì)胞保存在RPMI1640培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清，l00 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素，在37 ℃，5% CO2中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h，將MCF-7細(xì)胞接種于6孔板，將細(xì)胞分為NC組、miR-504mimics組、miR-504 mimics+ PSME3組，按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.2 乳腺癌小鼠移植瘤模型：選取12只5周齡左右BALB/c裸鼠，隨機(jī)分為NC組(n=6)，miR-504 mimics組(n=6)。用miR-NC或miR-504 mimics轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，皮下注射到裸鼠左前上肢腋下處皮下，每只裸鼠接種細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/只。3周后處死小鼠，去除小鼠腫瘤組織并稱重。

1.2.3 免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)裸鼠瘤體組織中Ki67陽(yáng)性信號(hào)：將組織切片脫蠟入水，微波加熱法修復(fù)抗原，溫度94 ℃左右，10～15 min， 5%的正常羊血清封閉，37 ℃孵育60 min。棄去血清，加入一抗(PSME3抗體和Ki67抗體)，4 ℃過(guò)夜。加入二抗，常溫避光孵育60 min。棄二抗，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-504潛在靶基因：使用TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-504和PSME3的結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)熒光素酶活性：構(gòu)建野生型PSME3 3′-UTR(PSME3-Wt)質(zhì)粒和突變型PSME3 3′-UTR(PSME3-Mut)質(zhì)粒，將PSME3-Wt或PSME3-Mut與miR-NC，miR-504 mimics共轉(zhuǎn)染進(jìn)MCF-7細(xì)胞，檢測(cè)各組細(xì)胞中的熒光素酶活性。

1.2.6 RT-qPCR檢測(cè)mRNA表達(dá)：用Trizol試劑提取細(xì)胞、組織中的總RNA，并根據(jù)制造商推薦的方案， PSME3的mRNA表達(dá)水平以β-actin為內(nèi)參，按照RT-qPCR試劑盒制造商指示，進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.2.7 Western blot檢測(cè)PSME3蛋白表達(dá)：提取細(xì)胞或組織蛋白質(zhì)，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，加與12% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。將1∶500比例稀釋的PSME3抗體和1∶1 000稀釋的β-actin抗體加入至PVDF膜，β-actin為內(nèi)參，4 ℃孵育過(guò)夜。棄一抗，加入二抗，室溫孵育1 h，隨后進(jìn)行ECL測(cè)定。

1.2.8 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力：轉(zhuǎn)染24 h后，將3組MCF-7細(xì)胞接種于96孔板。隨后每孔加入10 μL CCK-8溶液，黑暗中孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的吸光度(A)值。

1.2.9 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：將MCF-7細(xì)胞用0.01%胰蛋白酶消化30 min，再用預(yù)冷的PBS重懸并將細(xì)胞懸液加入預(yù)冷的70%乙醇中固定，置于4 ℃過(guò)夜。去除乙醇后用PBS洗滌2次并加入100 μL RNase A，37 ℃水浴30 min，接著添加400 μL PI染色并混勻，4 ℃避光30 min，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.10 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力：轉(zhuǎn)染后，收集各組細(xì)胞，將細(xì)胞為2×105個(gè)/mL，然后將200 μL細(xì)胞懸液接種于上室，在下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，隨后恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出小室后，將小室置于95%乙醇中固定5 min；在0.5%結(jié)晶紫染色液中染色10 min后，用PBS漂洗去除未結(jié)合細(xì)胞的染色液。用棉簽輕拭去小室濾膜上層的細(xì)胞，在顯微鏡下觀察濾膜下層細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-504對(duì)乳腺癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響

miR-504過(guò)表達(dá)的裸鼠的瘤體體積和質(zhì)量均明顯低于對(duì)照組(圖1A，B)，miR-504組裸鼠瘤體組織中Ki67陽(yáng)性信號(hào)(綠色區(qū)域)較對(duì)照組明顯降低，并且miR-504組裸鼠瘤體組織蛋白表達(dá)明顯降低(圖1C)。

2.2 PSME3是miR-504的靶基因

PSME3的3′-UTR上具有潛在的結(jié)合位點(diǎn)與miR-504形成互補(bǔ)(圖 2A)。miR-504 mimics與pMIR-PSME3-Wt質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)MCF-7細(xì)胞時(shí)，熒光素酶活性明顯降低；在轉(zhuǎn)染pMIR-PSME3-Mut細(xì)胞中熒光素酶活性均無(wú)明顯變化(圖2B)。MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-504 mimics組較NC組，PSME3的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.01)(圖2C，D)。

2.3 PSME3在乳腺癌組織中的表達(dá)

乳腺癌組織中PSME3的mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織(圖3A)。同時(shí)，乳腺癌組織中PSME3蛋白的表達(dá)也明顯升高(P<0.01)(圖3B)。

2.4 miR-504對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖、周期和遷移的影響

miR-504 mimics組細(xì)胞的增殖能力較NC組明顯降低， 但miR-504 mimics+PSME3組細(xì)胞的增殖的能力高于miR-504 mimic組(圖4A)。miR-504 mimics組S期細(xì)胞比值降低，但miR-504 mimics+PSME3組，降低了miR-504mimics組對(duì)S期阻滯的抑制效果(圖4B)。miR-504 mimics組能抑制細(xì)胞的遷移能力，但miR-504 mimics+PSME3組細(xì)胞的遷移能力明顯高于miR-504 mimics組(P<0.01)(圖 4C)。

A.TargetScan software prediction char; B.double luciferase reporter gene assay in MCF-7 cells; C.PSME3 mRNA expression was detected by RT-qPCR in MCF-7 cells; D.PSME3 protein expression was detected by Western blot in MCF-7 cells; *P<0.01 compared with NC group

A.RT-qPCR was used to detect PSME3 mNRA expression in breast cancer tissues; B.Western blot was used to detect PSME3 protein expression in breast cancer tissues; *P<0.01 compared with adjacent group

2.5 miR-504在乳腺癌裸鼠移植瘤模型中對(duì)PSME3表達(dá)的影響

miR-504組裸鼠瘤體組織中PSME3陽(yáng)性信號(hào)(紅色區(qū)域)的表達(dá)明顯低于對(duì)照組(圖5A)，同時(shí)miR-504組裸鼠組織中PSME3蛋白以及mRNA表達(dá)降低(圖5B)。

A.cell proliferation was detected by CCK8 assay; B.S phase cell ratio was detected by flow cytometry; C.Transwell assay was used to detect the migration ability of cells; *P<0.01 compared with NC group; # P<0.01 compared with miR-504 mimics group

A.regulation of miR-504 on PSME3 was detected by immunofluorescence; B.regulation of miR-504 on PSME3 was detected by Western blot and RT-qPCR; *P<0.01 compared with NC group

3 討論

MicroRNA表達(dá)特異性表達(dá)和惡性腫瘤的病理進(jìn)程密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中miR-504異常低表達(dá)，上調(diào)miR-504對(duì)非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲和EMT過(guò)程有明顯的抑制作用[7]； miR-504在下咽鱗狀細(xì)胞癌臨床標(biāo)本中表達(dá)下調(diào)，并通過(guò)靶向CDK6抑制下咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖[8]；在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中，miR-504發(fā)揮抑癌作用[9]。MCF-7細(xì)胞是一種乳腺癌經(jīng)典細(xì)胞系，該細(xì)胞具備分化的乳腺上皮細(xì)胞的一些特性，敲除一些基因可使MCF-7細(xì)胞株增殖能力減弱，其他一些基因的表達(dá)也能抑制其增殖[10]。在本研究中乳腺癌移植瘤裸鼠模型觀察miR-504對(duì)瘤體生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)miR-504高表達(dá)能抑制MCF-7細(xì)胞的增殖并導(dǎo)致瘤體的質(zhì)量和體積均明顯降低。這些結(jié)果提示miR-504可能參與了對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)并對(duì)乳腺癌產(chǎn)生抑制效果。

通過(guò)與靶基因結(jié)合，miRNA可在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[11]。本研究通過(guò)預(yù)測(cè)并經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證實(shí)發(fā)現(xiàn)PSME3是miR-504的潛在靶基因，在MCF-7細(xì)胞中上調(diào)miR-504能抑制PSME3的mRNA和蛋白表達(dá)。另一方面，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-504高表達(dá)的裸鼠瘤體組織中PSME3的表達(dá)明顯降低，進(jìn)一步證實(shí)了PSME3是miR-504的潛在靶點(diǎn)，因此推測(cè)PSME3是miR-504在乳腺癌中發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶基因。

PSME3已證實(shí)在乳腺癌、甲狀腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤中異常高表達(dá)，發(fā)揮癌基因的功能[12-13]，比如在乳腺癌中，過(guò)表達(dá)PSME3可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞EMT[14]。與既往研究結(jié)果類似，在本研究中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示移植瘤裸鼠模型的乳腺癌組織中PSME3的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯上升，提示PSME3與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為了進(jìn)一步確定miR-504對(duì)乳腺癌的影響，以及此過(guò)程PSME3作用中，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察miR-504和PSME3對(duì)MCF-7細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-504 mimics能抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，S期阻滯和遷移能力，但PSME3高表達(dá)后，miR-504的調(diào)控效果被逆轉(zhuǎn)。上述結(jié)果表明miR-504可能是通過(guò)負(fù)性調(diào)控PSME3的表達(dá)參與調(diào)節(jié)MCF-7細(xì)胞生物學(xué)行為從而發(fā)揮抑癌的作用。

綜上，miR-504通過(guò)抑制PSME3抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，S期阻滯和遷移能力，并且在裸鼠體內(nèi)能抑制瘤體的生長(zhǎng)，表明miR-504可能具有抑制乳腺癌的作用，并且在這一過(guò)程中PSME3作為靶基因發(fā)揮重要作用。