骨橋蛋白在大鼠肝缺血/再灌注損傷中的作用

郭麗蘋，蘇 娟，田新雁，陸 麗，胡亞榮，秦 燕

大理大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000

肝缺血/再灌注損傷(hepatic ischemia-reperfu-sion injury，HI/RI)是肝組織缺血再灌注后，肝功能和結(jié)構(gòu)損傷不僅未恢復(fù)，反而損傷程度加重的現(xiàn)象。HI/RI常見于肝移植、休克復(fù)蘇、嚴(yán)重肝外傷及肝葉切除等外科疾患，其損傷程度明顯影響了治療效果和預(yù)后，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致患者肝功能衰竭甚至多器官功能障礙而致死亡[1-2]。

骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是一種磷酸化糖蛋白，分布于多種組織和細(xì)胞中，具有多種生物學(xué)功能，在骨代謝、傷口愈合、血管生成、腫瘤發(fā)生和炎性免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用[3-4]。有報(bào)道[5-6]提示OPN與肝臟疾患存在密切聯(lián)系，但多數(shù)研究主要集中于其在肝臟慢性損傷過(guò)程中的作用(如肝纖維化)。目前OPN在多數(shù)疾病急性損傷中的作用日益引起重視[7-8]。急性HI/RI時(shí)，OPN是否參與其中，尚未見報(bào)道。本研究將通過(guò)建立大鼠急性HI/RI模型，進(jìn)一步探討OPN在其中的變化及作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g(昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(滇)k2015-0002])。

1.1.2 藥物與試劑:天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)測(cè)定試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)測(cè)定試劑盒、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測(cè)定試劑盒和丙二醛(malondialdehyde,MDA)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、RNase-Free ddH2O、TRNzol Universal總RNA提取試劑、FaskKing cNDA第一鏈合成試劑盒、SuperReal彩色熒光定量預(yù)混試劑(天根生化科技有限公司)；RNA引物設(shè)計(jì)與合成(上海生工生物工程股份有限公司)；0.9%氯化鈉溶液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司)；大鼠骨橋蛋白(OPN)酶聯(lián)免疫試劑盒(上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司)；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組與處理:將大鼠隨機(jī)分為：假手術(shù)(sham)組、缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)組，每組6只(n=6)。參照文獻(xiàn)[9]的方法復(fù)制大鼠HI/RI模型，根據(jù)再灌注時(shí)間，將I/R組分為6、12、24 h組。Sham組僅進(jìn)行肝蒂部干擾，缺血后直接取材。

1.2.2 血漿肝功能指標(biāo)的測(cè)定:常規(guī)分離的血漿-80 ℃凍存?zhèn)溆?。按照試劑盒說(shuō)明書操作步驟，于多功能酶標(biāo)儀505 nm波長(zhǎng)測(cè)定血漿中AST和ALT水平。

1.2.3 HE染(hematoxylin-eosin staining)色觀察肝組織形態(tài)學(xué):取肝左外側(cè)葉，4%多聚甲醛固定后，進(jìn)行石蠟包埋，再用切片機(jī)制作成4 μm切片，脫水透明后進(jìn)行H&E染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理?yè)p傷變化。

1.2.4 肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè):取約1 g肝外側(cè)葉組織，按質(zhì)量∶體積為1∶9的比例加入0.9%氯化鈉溶液，在功率為60%，超聲10 s與間歇30 s為1個(gè)循環(huán)，超聲循環(huán)3～5次的條件下制備10%勻漿液。4 ℃、3 000 r/min離心10 min，分離得10%肝勻漿上清液，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。采用BCA法測(cè)定其總蛋白濃度。分別根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，于紫外分光光度計(jì)550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，并計(jì)算出SOD的活力；于紫外分光光度計(jì)532 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，并計(jì)算出MDA的含量。

1.2.5 RT-qPCR測(cè)定肝組織OPN mRNA表達(dá):取適量肝組織置2 mL玻璃勻漿器中，加1 mL Trizol Universal試劑，冰上研磨完全后，按RNA提取試劑盒步驟提取肝組織總RNA。用超微量核酸蛋白質(zhì)測(cè)定儀測(cè)定總RNA濃度。取各組細(xì)胞的總RNA各1 μg，按RT-qPCR試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取產(chǎn)物3 μL進(jìn)行PCR循環(huán)。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延長(zhǎng)2 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。每份樣本以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照。OPN上游引物序列5′-GCTTGGCTTACGGACTGAGG-3′，下游引物序列列5′-GGGCAACTGGGATGACCTTG-3′，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為141 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物序列5′-GGGGCTCTCTGCTCCTCCCTG-3′，下游引物序列5′-CGGCCAAATCCGTTCACACCG-3′，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為107 bp。

1.2.6 ELISA測(cè)定肝組織OPN的含量:用純化的大鼠OPN抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入OPN，再與HRP標(biāo)記的OPN抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中OPN含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肝組織形態(tài)學(xué)變化

Sham組鏡下可見到肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞呈索狀整齊排列，大小均勻，無(wú)變性和壞死。I/R 6 h見肝血竇變寬有大量紅細(xì)胞滯留，肝竇擠壓變形，有少量肝細(xì)胞變性、壞死和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；I/R 12 h時(shí)變化加重，肝細(xì)胞明顯排列不齊；I/R 24 h時(shí)肝細(xì)胞出現(xiàn)大量變性和壞死(圖1)。

2.2 血漿中AST和ALT水平的變化

與sham組比較，I/R各組大鼠血漿AST和ALT的活力均有不同程度的顯著升高，以I/R 12 h組最為明顯(P<0.01)(表1)。

2.3 肝組織中SOD活力和MDA含量的變化

與sham組比較，I/R各組大鼠肝組織中SOD活力隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)呈顯著下降趨勢(shì)，MDA含量逐漸升高，24 h時(shí)最為明顯(P<0.01)(表2)。

2.4 肝組織中OPN mRNA表達(dá)水平的變化

與sham組比較，I/R 6、12和24 h組大鼠肝組織OPN mRNA表達(dá)均不同程度增高，其中以I/R 24 h組最顯著(P<0.01)(表3)。

2.5 肝組織中OPN含量的變化

與sham組比較，I/R 24 h組大鼠肝組織中OPN蛋白含量顯著升高(P<0.05)，其余各組變化不明顯(表3)。

圖1 大鼠肝組織HE染色結(jié)果Fig 1 HE staining results of rats liver (×400)

表1 各組大鼠血漿中AST和ALT的水平變化

表2 各組大鼠肝組織中SOD活力和MDA含量的變化

表3 各組大鼠肝組織OPN mRNA表達(dá)及OPN含量的變化

3 討論

肝臟缺血一段時(shí)間，再恢復(fù)血液灌流后可通過(guò)氧化應(yīng)激及炎細(xì)胞的激活等作用引發(fā)肝臟結(jié)構(gòu)和功能的損傷[10]。隨著再灌流時(shí)間的延長(zhǎng)，出現(xiàn)肝細(xì)胞排列紊亂、不同程度的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和肝竇受擠壓并伴有淤血現(xiàn)象，I/R 24 h時(shí)肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯水腫和變性壞死。血漿中AST及ALT水平顯著升高，I/R 12 h時(shí)變化最明顯，說(shuō)明再灌注加重了肝損傷。肝組織中SOD的活力顯著降低，而MDA的含量顯著升高，以I/R 24 h時(shí)的變化最顯著，可見在HI/RI期間氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷了肝細(xì)胞。

I/R損傷過(guò)程中，氧化應(yīng)激可引起明顯的炎性反應(yīng)，使細(xì)胞黏附分子及趨化因子等生成增多，并吸引中性粒細(xì)胞聚集、黏附在血管內(nèi)皮細(xì)胞上，堵塞微循環(huán)，加重組織細(xì)胞水腫。激活的中性粒細(xì)胞可釋放大量活性物質(zhì)如自由基和蛋白酶等，導(dǎo)致周圍組織細(xì)胞損傷[11]。OPN是一種具有多種生理功能的磷酸化糖蛋白，在正常情況下表達(dá)甚微，但在炎性壞死和缺氧等誘導(dǎo)下，體內(nèi)多種細(xì)胞如成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等可大量表達(dá)OPN，調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞的趨化、黏附和聚集，刺激細(xì)胞因子分泌，引發(fā)炎性反應(yīng)[12]。本結(jié)果顯示，OPN的表達(dá)和含量隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)而升高，與肝臟病理形態(tài)學(xué)的變化和氧化損傷指標(biāo)的變化趨勢(shì)相一致。提示HI/RI可通過(guò)上調(diào)OPN，刺激肝巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞黏附分子、趨化因子等激活炎細(xì)胞而加重肝損傷。

綜上所述，OPN參與了急性HI/RI的發(fā)生，可能是評(píng)價(jià)肝臟損傷的重要指標(biāo)，但其在HI/RI中的作用及其機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。