小鼠內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒Gag抗原在胰島的表達(dá)及單克隆抗體的制備

李 瑜，張 雯，，袁 昱，李姝亭，，王 哲，賁亞琍，*，戴 飏，3*

1.江漢大學(xué) 免疫疾病研究所， 湖北 武漢 430056; 2.江漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430056; 3.美國(guó)南加州生物醫(yī)學(xué)研究所，加利福尼亞州 圣地亞哥 92056

1型糖尿病(type 1 diabetes，T1D)是一類由T細(xì)胞介導(dǎo)，以β細(xì)胞破壞導(dǎo)致的胰島素絕對(duì)不足的一種自身免疫性疾病[1-2]。T1D在全球的發(fā)病率有逐年遞增的發(fā)展態(tài)勢(shì)[3]，探究T1D的發(fā)病原因不僅有利于T1D的早期診斷，更為了便于建立更高效安全的預(yù)防策略與治療方式。

ERV(endogenous retroviruses，ERV)是幾百萬年前動(dòng)物祖先的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染種系后整合到基因組內(nèi)的殘余物[4]。ERV序列在人類和小鼠基因組序列內(nèi)占5%～8%[5-6]。Gag基因可調(diào)節(jié)細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和促進(jìn)病毒的出芽。在30多年前就指出，逆轉(zhuǎn)錄病毒元件可能作為特殊抗原致敏免疫細(xì)胞，從而引發(fā)自身免疫反應(yīng)[7]。但目前對(duì)于觸發(fā)T1D初始自身免疫性反應(yīng)的觸發(fā)器尚不明確[8]。有資料指出，在宿主發(fā)育過程中，ERV可能在組織或器官的功能發(fā)展(包括免疫激活與耐受)中扮演了重要的角色[9]。

ERV Gag基因編碼的病毒核心蛋白能刺激非肥胖糖尿病(non-obese diabetic，NOD)模型小鼠的自身反應(yīng)性T細(xì)胞產(chǎn)生特異性反應(yīng)[10]。通過制備相關(guān)單克隆抗體來檢測(cè)NOD模型小鼠胰腺中組特異性抗原(group specific antigen,Gag)的表達(dá)情況，從而找尋該抗原的表達(dá)與T1D發(fā)病的相關(guān)性。希望為T1D的預(yù)防、早期診斷或治療方式提供一種新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)雌性6～8周齡BLAB/c小鼠，體質(zhì)量16～18 g[合格證號(hào)為SCXK(鄂)2015-0018，湖北疾控中心]；SPF級(jí)3～6周齡NOD模型小鼠體質(zhì)量14～18 g(從美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室購買并在江漢大學(xué)動(dòng)物中心繁殖)；小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒(Proteintech Group公司)；小鼠胰島β細(xì)胞株(min6)、人胚胎腎細(xì)胞系(HEK 293T)(由江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫疾病研究所保存)；Gag 194重組蛋白(由AtaGenix公司合成)；Gag 194多肽和Gag QR多肽(由Shanghai GL Peptide 公司合成)；單克隆抗體生物素化(由Proteinab公司合成)；Gag QR質(zhì)粒、Gag 194質(zhì)粒、R187單克隆抗體(美國(guó)南加州生物醫(yī)學(xué)研究所戴飏教授提供)。

1.2 方法

1.2.1 ERV Gag 194抗原表位的預(yù)測(cè): 利用免疫表位數(shù)據(jù)庫在線預(yù)測(cè)ERV Gag 194 B細(xì)胞抗原表位。同時(shí)對(duì)ERV Gag 194空間結(jié)構(gòu)、氨基酸序列和性質(zhì)以及抗原性等進(jìn)行分析，找到合適的多肽位點(diǎn)為下一步制備單克隆抗體做好準(zhǔn)備。

1.2.2 ERV Gag單克隆抗體的制備： 1)小鼠的免疫: BALB/c小鼠共進(jìn)行4次抗原免疫注射，每次注射100 μg偶聯(lián)抗原肽，首次注射完成后，第28和49天分別進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，在第59天時(shí)取血測(cè)試免疫效果并在首次免疫完成后的第70天時(shí)進(jìn)行第3次加強(qiáng)免疫。 2)血清效價(jià)的檢測(cè): 使用KLH以及KLH偶聯(lián)抗原肽檢測(cè)血清效價(jià)，每孔100 ng抗原包被96孔板，4 ℃ 過夜。次日每孔加入待測(cè)小鼠血清(血清從1 000開始往后2倍稀釋使用，直到512 000倍)，37 ℃ 2 h。洗板，加入抗小鼠二抗，37 ℃孵育1 h，洗板，加入顯色劑，室溫避光15 min后，加入ELISA終止液。酶標(biāo)儀450 nm讀取吸光度(A)值。 3)細(xì)胞的融合: 將SP2/0細(xì)胞懸液與脾細(xì)胞懸液均勻混合。200 g/min離心5 min，棄去上清，取0.8 mL PEG滴加到細(xì)胞中。加入20 mL 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，200 g/min離心8 min棄去上清，HAT培養(yǎng)基混勻，將融合細(xì)胞接種到飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 4)單克隆的篩選: 融合10～20 d后，取細(xì)胞上清檢測(cè)，進(jìn)行兩輪篩選。 5)雜交瘤細(xì)胞的亞克隆: 將待克隆的雜交瘤細(xì)胞懸液滴加到準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，顯微鏡下發(fā)現(xiàn)明顯的克隆生長(zhǎng)后開始檢測(cè)。 6)單克隆抗體的生產(chǎn): 液體石蠟接種于健康BALB/c小鼠腹腔內(nèi)，10 d后腹腔接種3×105個(gè)/0.5 mL雜交瘤細(xì)胞，觀察小鼠腹水產(chǎn)出情況，并做好腹水的采集工作。 7)單克隆抗體亞型的鑒定: 使用小鼠單克隆抗體亞型試劑盒進(jìn)行鑒定，依照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，吸光度(A)值最高的孔對(duì)應(yīng)相應(yīng)的亞型。

1.2.3 小鼠ERV Gag單克隆抗體特異性的鑒定： 1)ELISA檢測(cè)： 采用KLH偶聯(lián)多肽(1 μg/mL)、Gag 194多肽(1 μg/mL)、Gag 194重組蛋白(0.5 μg/mL)、Gag QR多肽(1 μg/mL)和KLH(1 μg/mL)多肽包被孔板。 2)Western blot檢測(cè)：采用質(zhì)粒Gag 194、Gag QR對(duì)HEK 293T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染(轉(zhuǎn)染時(shí)長(zhǎng)48 h)，并分別收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞內(nèi)蛋白、min6細(xì)胞內(nèi)蛋白、Gag 194重組蛋白，以及正常培養(yǎng)的HEK 293T細(xì)胞內(nèi)蛋白。使用5株小鼠ERV Gag單克隆抗體和R187單克隆抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1.2.4 內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒Gag抗原在NOD小鼠胰腺中的表達(dá)： 因能自發(fā)T1D模擬人患T1D的過程，NOD小鼠一直是用于T1D研究的良好動(dòng)物模型。C57BL/6小鼠是對(duì)照小鼠，此品系小鼠是T1D抗性小鼠。在免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，使用生物素化的1F4C8、2D4C6、5F9E4單克隆抗體檢測(cè)20周齡(T1D發(fā)病前期)NOD小鼠、3周齡(幼齡)NOD小鼠、20周齡C57BL/6小鼠和3周齡(幼齡)C57BL/6小鼠胰腺中Gag 蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 ERV Gag單克隆抗體制備結(jié)果

2.1.1 ERV Gag蛋白結(jié)構(gòu)分析和抗原多肽設(shè)計(jì)：位于4號(hào)染色體108152234-108153844處的CS4.108x基因作為目前已知的一個(gè)ERV gag基因，gag 194基因(克隆于NOD小鼠胰島)序列與其具有極高的同源度。gag QR基因從min6細(xì)胞中克隆所得。3個(gè)基因產(chǎn)物的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果如圖1所示。圖2為ERV Gag 194抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果。最終選擇Gag 194 193-210號(hào)多肽序列(193-VSRLRGRRDPPAVDSTTS-210)為小鼠ERV Gag單克隆抗體的制備靶點(diǎn)， 相應(yīng)的Gag QR基因的多肽序列為：193-VSRLRGKRDPPAADSTTS-210。

The omitted parts in Gag 194 or Gag QR were identical amino acids to CS4.108x圖1 氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig 1 Amino acid sequence alignment

圖2 ERV Gag 194抗原表位預(yù)測(cè)Fig 2 Epitope prediction of ERV Gag 194

2.1.2 第3次加強(qiáng)免疫小鼠血清ELISA效價(jià)的檢測(cè)結(jié)果： 第3次加強(qiáng)免疫后BALB/c小鼠血清效價(jià)檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。

2.1.3 細(xì)胞融合復(fù)篩的結(jié)果：首次篩選中有14株陽性率較高的克隆株，復(fù)篩中有5株陽性率較高的克隆株：1F4、2D4、3C3、4D6、5F9。細(xì)胞融合復(fù)篩結(jié)果如圖4所示。

2.1.4 抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果: 圖5為抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果。

2.1.5 單克隆抗體亞型鑒定: 制備的5株小鼠ERV Gag單克隆抗體均為IgG2b亞型。圖6為小鼠ERV Gag單克隆抗體亞型鑒定結(jié)果。

A.serum ELISA test for binding to the Gag peptide; B.KLH-peptide conjugate; sera of 5 BALB/c mice were collected after the third immunization (100 ng antigen per well); PC.positive control; NC.negative control; K.kilo

圖4 細(xì)胞融合復(fù)篩結(jié)果Fig 4 Screening after cell fusion

A.Gag peptide package board(50 ng antigen per well); B.KLH antigen coating plate(50 ng antigen per well)圖5 抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果Fig 5 Evaluation of antibody titers

A.heavy chain; B.light chain圖6 單克隆抗體亞型鑒定結(jié)果Fig 6 Identification of Ig subtype of the mAbs

2.2 ERV Gag單克隆抗體特異性檢測(cè)

2.2.1 ELISA檢測(cè)的結(jié)果: 5株小鼠ERV Gag單克隆抗體對(duì)Gag 194來源的多肽或重組蛋白均具有較高的敏感度，而多Gag QR來源的多肽敏感度較低。圖7為小鼠ERV Gag單克隆抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果。

2.2.2 Western blot檢測(cè)的結(jié)果: 1F4C8、2D4C6、3C3B9和5F9E4抗體與Gag 194重組蛋白能發(fā)生特異性結(jié)合，其中1F4C8、2D4C6、5F9E4抗體還能特異性結(jié)合Gag 194質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后的HEK 293T細(xì)胞內(nèi)Gag蛋白。除此之外，1F4C8、2D4C6抗體對(duì)Gag QR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后的HEK 293T細(xì)胞內(nèi)Gag蛋白也能產(chǎn)生特異性結(jié)合。在多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，4D6B3小鼠ERV Gag單克隆抗體均不識(shí)別任何上樣蛋白，這可能因?yàn)?D6B3小鼠ERV Gag單克隆抗體僅識(shí)別Gag多肽而無法結(jié)合蛋白。R187抗體是Gag大鼠的單克隆抗體，能夠特異性識(shí)別Gag QR來源的Gag蛋白。圖8為小鼠ERV Gag單克隆抗體蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.3 ERV Gag抗原在NOD小鼠胰腺中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)檢測(cè)的結(jié)果： 無論是幼齡還是T1D發(fā)病前期的NOD小鼠胰腺均可檢測(cè)到Gag抗原的表達(dá)，但C57BL/6小鼠胰腺未檢測(cè)到Gag抗原。(本實(shí)驗(yàn)背景呈淡粉色，這是因?yàn)楸締慰寺】贵w由小鼠生產(chǎn)制備而成，與檢測(cè)樣本(小鼠胰腺冰凍切片)存在交叉反應(yīng)所導(dǎo)致的)。圖9為免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3 討論

根據(jù)前期研究表明，NOD小鼠的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可釋放外泌體(exosomes, EXOs)，自身反應(yīng)性B細(xì)胞和T細(xì)胞能被釋放的EXOs有效激活，但C57BL/6小鼠的MSCs所釋放的EXOs并不能引發(fā)此誘導(dǎo)反應(yīng)。通過蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析EXOs蛋白成分時(shí)發(fā)現(xiàn)，ERV 的Gag和 Env抗原均在MSCs分泌的EXOs中高表達(dá)。通過構(gòu)建gagKD和gagWT的EXOs，在相關(guān)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)gagWT的EXOs能更有效的激活CD4+T細(xì)胞。據(jù)此推測(cè)，Gag極有可能是一個(gè)重要的T細(xì)胞抗原。單抗則是進(jìn)一步研究Gag抗原的必需材料，于是分析Gag 194抗原位點(diǎn)，選取單克隆抗體制備靶點(diǎn)(Gag 194:193-VSRLRGRRDPPAVDSTTS-210)，并成功制備了5株(1F4C8、2D4C6、3C3B9、4D6B3、5F9E4)小鼠ERV Gag單克隆抗體，5株抗體亞型均為IgG2b型。

制備的小鼠ERV Gag單克隆抗體均能較好的識(shí)別Gag 194來源的抗原。R187可識(shí)別多個(gè)小鼠白血病病毒(murine leukemia virus，MuLV)的Gag抗原[11]。而gag QR的基因序列與MuLV gag的基因序列高度同源。因此R187抗體能夠特異性結(jié)合Gag QR來源的蛋白。通過比較，2D4C6抗體特異性更好，對(duì)Gag 194 和Gag QR來源的Gag蛋白均能有效結(jié)合。

無論處于何周齡的NOD小鼠，其胰腺均可檢測(cè)到ERV Gag抗原，但在胰島炎性反應(yīng)發(fā)生的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域內(nèi)未檢測(cè)到ERV Gag抗原。此外，NOD小鼠的胰島MSCs分泌的EXOs也表達(dá)ERV Gag蛋白，由此可推斷胰島MSCs是表達(dá)此抗原的重要細(xì)胞群或之一， 然而此處并不能排除部分胰島內(nèi)分泌細(xì)胞也存在表達(dá)Gag抗原的可能性。C57BL/6小鼠的胰腺均不表達(dá)ERV Gag抗原。由此可見，ERV Gag抗原在NOD小鼠幼年時(shí)期的胰腺中就已經(jīng)開始表達(dá)，這提示了ERV Gag抗原是NOD小鼠的特殊抗原，且在NOD小鼠幼年時(shí)期此抗原就開始表達(dá)，可以推測(cè)該抗原的表達(dá)與T1D發(fā)生有一定的相關(guān)性。

A.1F4C8; B. 2D4C6; C. 3C3B9; D. 4D6B3; E. 5F9E4; the values shown were average of two repeated wells; similar data were observed in two separate experiments

綜上所述，Gag 194抗原在NOD小鼠體內(nèi)是否比其他ERV抗原(如Gag QR)有更的免疫刺激作用還需進(jìn)一步研究，而新制備的小鼠ERV Gag單克隆抗體特別是2D4C6為此研究提供了一種有效工具。

M.protein marker; 1.recombinant protein; 2.293T-transfected by Gag 194; 3.293T-transfected by Gag.QR; 4.Min6 cells; 5.293T (-).A.anti-Gag mAbs; B.Coomassie Brilliant Blue staining

Dashed circles indicated islets, yellow arrows indicated islet areas infiltrated by lymphocytes(×20); A.1F4C8; B.2D4C6; C.5F9E4