間充質(zhì)干細胞在腎臟疾病治療中的應用進展

楊蘊釗，石美涵，周 誠，白雪源

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心 腎臟病學部 解放軍腎臟病研究所 腎臟疾病國家重點實驗室 國家慢性腎病臨床醫(yī)學研究中心，北京 100853

干細胞在再生醫(yī)學展現(xiàn)的巨大治療潛力獲得了越來越多的關(guān)注，為各種炎性反應疾病和退行性病變提供了新的有效治療方式[1]。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是從各種組織分離的多能基質(zhì)細胞，是干細胞的一個分支。MSCs能夠通過多種方式如遷移至損傷部位、免疫抑制、抗氧化應激、促血管生成等特性發(fā)揮重要的作用。在腎臟疾病中，MSCs的研究也得到了越來越多的關(guān)注。本文總結(jié)了MSCs的作用機制及其在腎臟疾病的臨床前研究及臨床治療方面的研究進展。

1 間充質(zhì)干細胞的來源和特征

干細胞根據(jù)其來源可分為：胚胎干細胞、誘導多能干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞 (embryonic stem cell，ESCs)通常來源于著床前的囊胚，具有發(fā)育的多能性。Takahashi等[2]提取了在胚胎干細胞中表達但不在成熟細胞中表達的編碼轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)基因Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4，將其導入成體細胞使其恢復到類似于胚胎干細胞的高度不成熟狀態(tài)，被稱作為誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。但倫理和成瘤問題限制了它們的應用。MSCs是目前最受關(guān)注的成體干細胞，在骨髓、脂肪組織、胎盤、臍帶、羊水、牙髓等不同部位都被分離出了MSCs，MSCs具有多種功能，包括分化能力、免疫調(diào)節(jié)和促血管生成，使它們成為腎臟疾病治療的理想候選者[1]。人類 MSCs 的一個重要特性是低表達主要組織相容性復合物(MHC)Ⅰ類分子，不表達 MHC Ⅱ類分子，這意味著它們可以跨越 MHC屏障進行移植，不會引起顯著的免疫排斥反應[3]。不同來源的MSCs具有不同的性質(zhì)，主要體現(xiàn)在增殖速度、細胞因子譜和免疫調(diào)節(jié)能力。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-MSCs，BM-MSCs)是研究最廣泛的MSCs，但BM-MSCs獲取的途徑具有較大創(chuàng)傷性，能夠獲取的MSCs在骨髓組織中僅占0.01%～0.04%[4]。臍帶間充質(zhì)干細胞(umbilical cord-MSCs，UC-MSCs)、脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose tissue-MSCs, AD-MSCs)、胎盤間充質(zhì)干細胞(placenta-MSCs，AF-MSCs)是近年來獲得更多關(guān)注的成體干細胞，相對于BM-MSCs，它們有著更小創(chuàng)傷的獲取途徑、更強的增殖能力和更強大的免疫抑制能力[5]。這可能是因為它們比BM-MSCs有著更早期的胚胎學起源，是理想的MSCs獲取來源。

2 間充質(zhì)干細胞的作用機制

2.1 MSCs的旁分泌作用

雖然最初提出MSCs可通過被誘導分化而參與組織的再生修復作用，然而這種方式非常低效，大量的研究證明MSCs的旁分泌作用是其主要的機制，MSCs的旁分泌作用主要通過在損傷部位分泌大量的生物活性細胞因子(主要包括抗炎因子、趨化因子、生長因子和細胞外囊泡)而發(fā)揮治療作用[6]。MSCs分泌的趨化因子會募集巨噬細胞和淋巴細胞來分泌促炎因子，MSCs 并不是本身就帶有天然免疫抑制特性的，它需要促炎因子的刺激才會更大量地分泌抗炎因子，這是MSCs介導免疫抑制的關(guān)鍵步驟[7]。MSCs分泌的吲哚胺2,3雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、白介素10(interleukin-10，IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)等抗炎因子對免疫細胞有著廣泛的影響。其他方面，MSCs分泌的血管內(nèi)皮生長因子、造血生長因子對炎性反應損傷后的血管重塑至關(guān)重要[3]。細胞外囊泡(extracellular vesicle,EV)是MSCs衍生的膜封閉的顆粒，近期的研究發(fā)現(xiàn)在腎病的動物模型中，EV可以通過多種機制發(fā)揮作用[8]，是治療腎臟疾病的一個新思路。

2.2 MSCs對免疫系統(tǒng)中的調(diào)控作用

MSCs對各種免疫細胞都有不同程度的影響。在固有免疫方面，MSCs 分泌的細胞因子可以調(diào)控樹突狀細胞(dendritic cell, DC)的成熟和遷移[9]。MSCs還可以被活化的 NK 細胞分泌的干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)誘導釋放IL-10、IDO、PGE2等，抑制 NK 細胞的過度反應[10]。MSCs對巨噬細胞的調(diào)控主要是誘導促炎型的M1型極化為抗炎型的M2型。在適應性免疫方面， MSCs 主要是通過分泌抗炎因子TGF-β、IL-10、IDO等抑制T細胞向促炎型Th1、Th17分化，促進抗炎Treg細胞的分化[11]。

3 MSCs治療腎臟疾病的基礎和臨床研究進展

3.1 MSCs治療急性腎損傷

急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)指腎功能突然下降，導致尿素和其他含氮廢物潴留以及細胞外液容量和電解質(zhì)失調(diào)。AKI中腎小管的損傷主要是由缺血性和腎毒性引起的氧化應激和炎性反應，不同來源的MSCs通過多種機制對AKI實現(xiàn)保護作用。在抑制炎性反應上，主要是通過提高旁分泌抗炎因子來減輕腎臟組織的損傷[12]。在氧化應激方面，研究發(fā)現(xiàn)MSCs在AKI中通過上調(diào)醌氧化還原酶 1 和超氧化物歧化酶來拮抗和限制氧化還原反應[13]。血管損傷是 AKI 的早期病理生理變化，MSCs還可以通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子基因的表達，維持AKI損傷后血管生成[13]。此外，在AKI發(fā)病過程中補體系統(tǒng)是介導炎性反應重要介質(zhì)之一， MSCs能夠下調(diào)C5a/C5Ar和抑制 DC 的成熟并促進它們向耐受性免疫抑制表型的轉(zhuǎn)變[14]。最近，許多研究表明恢復線粒體功能是 MSCs 修復AKI受損組織的潛在治療靶點，其中涉及多個通路，例如MSCs可以通過SIRT3刺激腎小管細胞生長并增強線粒體功能，還可以通過影響PI3K /Akt和線粒體凋亡信號通路來恢復線粒體損傷[15]。

基于大量關(guān)于 MSCs 在 AKI中的臨床前證據(jù)，關(guān)于MSCs治療AKI的臨床試驗也得到了開展(表1)。有研究開展了關(guān)于MSCs預防AKI的Ⅰ期臨床試驗，5例患有潛在腎臟疾病的患者在心臟大手術(shù)后，為預防AKI的發(fā)生，在腎主動脈輸注了MSCs，患者腎功能在術(shù)后均未惡化[16]。而在另一項臨床試驗中，156例心臟手術(shù)后患有早期AKI的患者接受 MSCs 治療后在腎損傷方面并沒有觀察到明顯的恢復信號[17]。當然這可能由于MSCs 治療效果不如預防效果或者被持續(xù)的腎損傷所掩蓋。有研究團隊設計了一種MSCs的組合生物設備SBI-101，將受試者的血液超濾液在體外經(jīng)MSCs調(diào)節(jié)后再輸送回去，不過受限于入組患者多合并有嚴重基礎疾病，并正在接受連續(xù)腎臟替代治療，患者沒有取得明顯的臨床改善。但是在細胞因子水平的檢測上，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IFN-γ、IL-10、TGF-β1以及趨化因子MCP-1 (CCL2)、MCP-2 (CCL8) 和 MCP-3 (CCL7) 的變化驗證了離體MSCs的干預方式與既往研究的MSCs調(diào)控促炎反應轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡追磻纳飳W一致[18]。為了更加具體地觀察到MSCs的臨床作用,有研究者提出了一套新的臨床設計方案：建立更加同質(zhì)性的入組患者，僅包括由腎小管上皮細胞損傷直接引起的 AKI 患者，排除了其他器官受損而病情嚴重的患者，將有助于更好地判斷MSCs在AKI中的具體作用[19]。

3.2 MSCs 治療糖尿病腎病

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者最嚴重的并發(fā)癥之一，也是導致終末期腎病的主要原因之一。免疫炎性反應是DN持續(xù)發(fā)展的驅(qū)動因素,炎性因子的釋放促進巨噬細胞浸潤腎小球和間質(zhì)，與DN的惡化程度密切相關(guān)[20]。有研究發(fā)現(xiàn)BM-MSCs可以通過激活轉(zhuǎn)錄因子EB來調(diào)節(jié)巨噬細胞的分化以抑制小鼠DN的進展[21]。類似的研究結(jié)果也表明在DN大鼠中MSCs可以減輕腎臟的巨噬細胞浸潤，下調(diào)IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1β等炎性因子的分泌[22]。除了聚焦于巨噬細胞外， T細胞也被認為在DN進展中扮演著重要的角色，研究表明在DN大鼠中，MSCs可以通過抑制DC的成熟來影響T細胞的增殖和活化，從而改善腎臟局部炎性反應和纖維化[23]。此外，相較于只能模仿人類DN早期的鏈脲佐菌素(STZ)和高糖高脂飲食的DN動物模型，BTBR ob/ob小鼠是更理想化的DN模型，近來研究結(jié)果表明MSCs 在治療BTBR ob/ob 小鼠模型中可以通過免疫抑制、抗氧化凋亡、自噬調(diào)節(jié)和維持線粒體穩(wěn)態(tài)發(fā)揮作用[24]。當然在大多數(shù)已發(fā)表的研究結(jié)果中，不同來源的MSCs都顯著改善了DN模型的血糖并降低 SCr、BUN 和尿蛋白等[25]。

相較于大量的基礎研究，目前只有少數(shù)臨床試驗報告了 MSCs對于DN的安全性和治療作用(表1)。一項針對DN的多中心RCT的臨床試驗采用MSCs相關(guān)產(chǎn)品——骨髓來源的間充質(zhì)前體細胞(mesenchymal precursor cells, MPCs)進行治療，入組的30 例患者在12 周隨訪中，MPCs組顯示出更穩(wěn)定的血漿清除率 (mGFR) 和腎小球濾過率(eGFR)[26]。雖然沒有表現(xiàn)出顯著的治療效果，但沒有患者產(chǎn)生針對供體 HLA 的持續(xù)抗體和發(fā)生不良事件。

3.3 MSCs治療狼瘡性腎炎

50%的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者都會出現(xiàn)狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)，多達10%的LN會進展為終末期腎病[27]。LN被視為一種典型的免疫復合物腎小球腎炎，其特征是針對核抗原的自身抗體導致腎臟受累。一項納入28 項動物實驗的薈萃分析顯示，在狼瘡腎炎動物模型中，不同來源的MSCs 的治療都顯著降低狼瘡小鼠的ds-DNA、ANA、SCr、BUN、蛋白尿。MSCs治療組的炎性因子 IL-2、IL-12、IL-17和 IFN-γ也較對照組有一定程度的降低[28]。不僅如此，MSCs相較于常規(guī)免疫抑制治療也展現(xiàn)了更好的效果，在對照環(huán)磷酰胺(CTX)的研究中觀察到，MSCs組較CTX治療組能夠更好地恢復腎功能，表現(xiàn)為 MRL/lpr 小鼠血清和尿肌酐水平正?；痆29]。在LN中,IgG、炎性免疫細胞和炎性因子是造成足細胞損傷的主要因素，UC-MSCs在患狼瘡的B6.MRL-Faslpr小鼠中通過減少巨噬細胞浸潤和將巨噬細胞極化為M2型恢復了足細胞足突之間的裂隙隔膜損傷，同時減少了 IgG 和 C3 在腎小球中的沉積[30]。B細胞高反應性在SLE發(fā)病機制中起重要作用，B細胞是調(diào)控自身免疫的重要靶點，而MSCs可以通過抑制 MRL/lpr小鼠中 BAFF(主要由 T 細胞和DC細胞表達來激活B細胞)的產(chǎn)生而抑制 B 細胞的過度活化[31]。此外， MSCs還可以劑量依賴性抑制LN鼠中的 Th17和Th1 淋巴細胞，促進Treg細胞的增殖[32]。這些都體現(xiàn)了MSCs在LN中的強大免疫穩(wěn)態(tài)能力。

基于動物實驗取得的大量令人鼓舞的結(jié)果，MSCs治療LN的臨床試驗也相應得到了開展(表1)。最早開展的LN臨床試驗選用BM-MSCs 治療4例難治性 SLE 青年患者，在12-18 個月的隨訪期間，所有患者腎功能損傷均得到緩解，血清C3降低[29]。有更大樣本量的研究納入了 81 例活動性和難治性 LN 患者進行BM-MSCs和UC-MSCs的治療，在12個月的隨訪中，60.5%患者的腎臟炎性反應得到緩解[33]。在另一項臨床試驗中，50%患者的腎臟炎性反應在BM-MSCs治療后的第4年得到完全緩解，僅5例患者(6%)死于非治療相關(guān)事件，更進一步驗證了MSCs的長期有效性和安全性[34]。一項多中心的RCT臨床試驗選用UC-MSCs治療重癥LN患者也取得了令人滿意的結(jié)果[35]。然而并非所有的報道都是樂觀的，昆明一項針對重癥LN 患者的RCT臨床試驗中，UC-MSCs組并沒有比標準免疫抑制劑組有額外的治療效果，該項臨床試驗被迫中止[36]。當然這并不是意味著UC-MSCs沒有起到免疫抑制的作用，重癥LN的病情進展有可能會掩蓋MSCs的作用。

3.4 MSCs治療原發(fā)性腎小球疾病

腎小球腎炎 (glomerulonephritis，GN) 常由各種病因誘發(fā)的自身免疫反應引起，是導致終末期腎病的常見原因。相較于AKI、DN、LN， MSCs在腎小球疾病的研究沒有得到太多的關(guān)注，可能由于GN通常起病隱匿，治療效果需要較長周期的驗證，難以確定最佳治療時機。

3.4.1 MSCs治療抗腎小球基底膜 (anti-glomerular basement membrane, anti-GBM) 腎炎:腎小球腎炎中最嚴重和進展最快的病理類型是以腎小球新月體形成為主的抗腎小球基底膜腎炎，常會在短期進入終末期腎病。其主要機制是其針對基底膜Ⅳ型膠原蛋白 α-3 鏈的循環(huán)抗體與基底膜結(jié)合并引發(fā)炎性反應。有研究首先報道了hBM-MSCs在患有anti-GBM腎炎的 Wistar-Kyoto大鼠發(fā)病早期的治療作用, hBM-MSCs顯著降低了anti-GBM腎炎大鼠的尿蛋白水平和血清肌酐水平，減少了腎小球新月體形成，其治療機制可能與調(diào)控Th1/Th2和Th17/Treg細細胞的平衡、抑制過度的免疫炎性反應有關(guān)[37]。有趣的是該團隊的另一項研究利用MSCs 衍生的條件培養(yǎng)基 (MSCs-conditioned media，MSCs-CM)也顯示出對anti-GBM腎炎大鼠的治療作用[38]，MSCs-CM通過影響MCP1促進M1型巨噬細胞向M2的極化轉(zhuǎn)變，減輕體內(nèi)免疫炎性反應，而對Th1/Th2 和Th17/Treg沒有明顯影響。此外，一些研究利用MSCs作為載體，將一些已經(jīng)證實對anti-GBM腎炎有抑制作用的基因傳導到MSCs中，如激肽釋放酶[39]、谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶 Mu 2[40]、抗氧化基因1[41]，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因過后的MSCs可以更大程度地抑制炎性細胞因子的表達，減少巨噬細胞和 T 淋巴細胞向腎臟的浸潤。這些發(fā)現(xiàn)推動了轉(zhuǎn)基因 MSCs 作為新的方式靶向治療腎臟疾病。

表1 在Clinical Trials注冊已經(jīng)完成或終止的有關(guān)MSCs治療人類腎病的臨床試驗總結(jié)

3.4.2 MSCs治療系膜增生性腎小球腎炎(mesan-gial proliferative glomerulonephritis，MsPGN):MsPGN是一種以系膜細胞增生及系膜基質(zhì)增多為主要病理特征的腎炎，抗Thy1.1腎炎是最經(jīng)典的MsPGN動物模型，通過注射抗Thyl.1單克隆抗體可特異性識別大鼠腎小球系膜細胞表面Thyl.1分子，進而導致補體依賴性系膜溶解和腎小球內(nèi)炎性細胞浸潤及明顯的蛋白尿產(chǎn)生。有研究表明通過腎動脈注射BM-MSCs可以顯著改善Thy1腎炎的系膜細胞溶解，并降低蛋白尿的水平[42]。在另一項研究中，胎膜來源的MSCs移植Thy1大鼠后抑制系膜細胞的增殖、巨噬細胞浸潤、系膜基質(zhì)積聚以及細胞外基質(zhì)相關(guān)分子的表達[43]。

3.4.3 MSCs治療局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS):FSGS是由對足細胞有損傷的循環(huán)因子、藥物、毒物所引起的腎小球疾病，主要的病理特征是彌漫或者階段性的足突消失。嘌呤霉素氨基核苷大鼠腎病模型(PAN)與阿霉素大鼠腎病模型是兩種常見的FSGS嚙齒類動物模型，具有類似人FSGS的病理特征。有研究表明在PAN模型中BM-MSCs可以通過調(diào)節(jié)腎臟中的Th1向Th2 細胞分化來實現(xiàn)對足細胞的保護[44]。此外，還有一些MSCs治療阿霉素大鼠腎炎的研究結(jié)果表明，MSCs可以通過增加腎基質(zhì)金屬蛋白酶/金屬蛋白酶-1的比率，下調(diào)IL-6 和 TNF-α炎性因子的表達，抑制RAS的表達和MAPK信號通路的激活等多方面發(fā)揮作用[45-46]。另一項研究是通過對FSGS家族患者的腎臟穿刺獲得的組織進行外顯子測序，發(fā)現(xiàn)了新的基因突變位點，利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建的p.Gly1617ValfsX15突變小鼠具有FSGS的病理特征，并發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs可以通過影響IL-22來改善FSGS小鼠的早期病情進展[47]。

MSCs用于治療腎小球腎炎的臨床研究并不多，大多是一些病例報道。有研究報道了一例自體BM-MSCs治療抗中性粒細胞胞質(zhì)抗體(antineutrophil-cytoplasmic antibody,ACNA)相關(guān)腎血管炎的臨床研究，一例73歲男性ACNA患者在經(jīng)歷利妥昔單抗治療伴發(fā)嚴重的自身感染和標準免疫治療無效后選擇了自體BM-MSCs移植，12個月的隨訪中，患者在沒有其他任何治療方式干預的情況下達到了臨床緩解[48]。另有報道一例13 歲男孩在腎移植后出現(xiàn)了FSGS，鑒于免疫抑制劑治療后的腎毒性作用所引起的腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化，患者接受了同種異體BM-MSCs 移植，22 個月的隨訪顯示，循環(huán)免疫炎性因子減少并且無不良事件發(fā)生[49]。當然，從這些單一的病例中尚不能得出多種MSCs對GN明確有效的結(jié)論，更多GN患者大型隊列的建立將有助于MSCs在該領(lǐng)域臨床研究的進展。

4 總結(jié)與展望

大量臨床前研究都證實了MSCs在腎臟疾病具有保護作用，免疫調(diào)節(jié)被認為是一個很重要的治療機制，包括抗炎、抗氧化和抗細胞凋亡的作用。目前的關(guān)鍵在于如何最大限度地發(fā)揮 MSCs 的治療效果，迄今已經(jīng)提出了幾種提高 MSCs治療效率的方法，如預處理(生理、藥物、物理)和基因修飾。經(jīng)過一定方式預處理后的MSCs比常規(guī)的MSCs有著更好的治療效果，如缺氧刺激后的MSCs在治療Thy1腎炎中可以更加有效地減少腎小球細胞凋亡和炎性反應[57]。二甲雙胍環(huán)境培養(yǎng)的AD-MSCs在治療LN小鼠時明顯增強了MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能[58]。預處理似乎是一種刺激MSCs發(fā)揮更理想效果的方法。此外，MSCs的治療時間點是一個關(guān)鍵，MSCs在大多數(shù)動物實驗中都顯示出了一定的療效，但是大多數(shù)的治療都是在疾病模型的早期開展的，而對MSCs長久的影響關(guān)注較少，有研究顯示在動物模型的病情后期，MSCs 向脂肪異常分化并發(fā)生纖維化[59]，這可能是MSCs遠期的不良影響。在臨床試驗方面，盡管MSCs所取得的效果仍然存在爭議，但MSCs的安全性和低致敏性得到了驗證。還有一點需要考慮的是，在大多數(shù)腎病的治療中常會聯(lián)合免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素，而在臨床試驗中發(fā)現(xiàn)標準劑量的免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素會干擾MSCs功能，但不影響其免疫抑制特性[60]。所以在聯(lián)合使用免疫抑制藥物、糖皮質(zhì)激素和MSCs之前，應考慮以上問題。除此之外，臨床試驗中還有許多關(guān)鍵問題尚待解決，包括確定最佳細胞類型、給藥途徑和時機，以及細胞劑量和次數(shù)。總之，如何更加有效地發(fā)揮MSCs的治療作用還亟待于今后更多的研究。