河北省保定市HIV-1流行重組毒株基因分布特征及獨(dú)特重組毒株重組結(jié)構(gòu)分析

李艷，劉洋，趙煊赫，趙靜，楊學(xué)剛，安偉娜，李永勤

根據(jù)聯(lián)合國(guó)人類免疫缺陷病毒(HIV)/獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)(UNAIDS)聯(lián)合規(guī)劃署發(fā)布的官方報(bào)告[1]，2020年全球有3 770萬人感染了HIV。HIV-1具有高度的遺傳變異性，導(dǎo)致了HIV-1豐富的基因多態(tài)性，目前全球共發(fā)現(xiàn)了 123 種流行重組毒株(circulating recombinant form，CRF)和許多獨(dú)特重組毒株(unique recombinant form， URF)(http://www.hiv.lanl.gov)。在我國(guó)，迄今已報(bào)告了24 種CRFs，由CRFs引起的HIV-1感染達(dá)到了80%以上[2]。保定市是河北省人口最多的城市，緊鄰首都北京，所轄21個(gè)縣、區(qū)、市(包括雄安新區(qū)三縣)，自古是京畿要地，保定市艾滋病控制的成效在一定程度影響京津地區(qū)艾滋病的防控。當(dāng)前，保定市是河北省艾滋病疫情最為嚴(yán)重的城市之一[3]。保定和石家莊報(bào)告的HIV-1感染占全省總數(shù)的37.1%[4]。本研究以保定市2019年6月-2021年12月新診斷的、未接受抗病毒治療的296例HIV-1感染者為研究對(duì)象，進(jìn)行pol區(qū)全長(zhǎng)基因擴(kuò)增測(cè)序分型，了解本地區(qū)HIV-1毒株的流行重組亞型分布情況，并對(duì)不能明確分型的樣本運(yùn)用近末端稀釋法分兩段擴(kuò)增其近全長(zhǎng)基因組序列[5]，通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析和重組斷點(diǎn)分析確定其重組亞型和重組模式，為該地區(qū)艾滋病的防控提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 2019年6月-2021年12月所有在保定市疾控中心經(jīng)免疫印跡實(shí)驗(yàn)確證血漿HIV-1抗體陽性，準(zhǔn)備在保定市人民醫(yī)院(保定市艾滋病治療定點(diǎn)醫(yī)院)接受抗病毒治療的296例HIV-1感染者，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書，并經(jīng)保定市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核同意 。

1.2逆轉(zhuǎn)錄-巢式PCR 逆轉(zhuǎn)錄-巢式PCR方法擴(kuò)增HIVpol區(qū)全長(zhǎng)基因片段(約3.1 kb)。反應(yīng)引物及反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[6]。

1.3HIV-1近全長(zhǎng)基因組序列擴(kuò)增及測(cè)定 采用德國(guó) QIAGEN 公司的 QIAampViral RNA Mini Kit(50)試劑盒提取病毒RNA,按試劑說明書操作；選擇TaKaRa公司PrimeScript Ⅳ 1st strand cDNA Synthesis Mix使用引物 1.R3.B3R和07Rev8將RNA分別逆轉(zhuǎn)錄成3′和5′半分子cDNA。利用TaKaRa公司的LA Taq試劑進(jìn)行巢式聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增HIV-1的近似全長(zhǎng)基因；與HXB2對(duì)應(yīng)的引物序列和位置列于表1。兩個(gè)區(qū)域的兩輪擴(kuò)增使用相同的擴(kuò)增 條件如下：94 ℃ 3 min，然后94 ℃ 20 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 4.5 min，共35個(gè)循環(huán)，最后延伸68 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽性產(chǎn)物送至北京諾賽基因組研究中心進(jìn)行基因序列測(cè)定。

表1 逆轉(zhuǎn)錄和巢式 PCR 的引物序列和位置Tab.1 Sequence and locations of primers used in the reverse transcription and nested PCR

1.4序列分析 測(cè)序結(jié)果使用Sequencher 5.4.6軟件進(jìn)行序列拼接，使用Bioedit進(jìn)行序列的比對(duì)和處理。將整理好的序列上傳HIV database，使用HIV blast在線工具(http://www.hiv.lanl.gov/ content/sequence/BASIC_BLAST/basic_blast.html)初步分析HIV亞型，并使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建NJ(Neighbor-joining)系統(tǒng)進(jìn)化樹(bootstrap值為1 000次，模型使用 Kimura two-parameter model)同步確認(rèn)。使用 jpHMM (http://jpHMM.gobics.de/submission_hiv.html)在線工具分析新型重組毒株的基因結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1人口學(xué)特征 本研究共納入296例HIV-1感染者，pol區(qū)全長(zhǎng)基因測(cè)序成功264例，成功率為89.19%。264例患者中，以男性(91.67%，242/264)為主、以26～49歲(63.64%，168/264)的青壯年居多、已婚(59.09%，156/264)為主，感染途徑以性接觸傳播(97.73%,258/264)為主，其中男男同性性傳播占84.47%(223/264)。

2.2HIV-1 亞型分析 根據(jù) HIV-1 BLAST和NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果，在264例新診斷的HIV-1感染者中，共發(fā)現(xiàn)11種HIV-1亞型，以CRF01_AE(51.89%, 137/264)、CRF07_BC(25.00%, 66/264)和B亞型(10.98%, 29/264)為主。其他幾種CRFs包括CRF103_01B(1.89%, 5/264)、CRF55_01B(1.52%, 4/264)、CRF59_01B(0.38%, 1/264)、CRF65_cpx(0.76%, 2/264)、CRF68_01B(0.76%, 2/264)、CRF80_0107(0.38%, 1/264)、CRF112_01B(0.38%, 1/264)和URFs(3.41%, 9/264)。

2.35株URF的重組模式分析及鑒定 9株URF中共獲得近全長(zhǎng)基因組5個(gè)，5個(gè)HIV-1感染者均為男性，年齡在26～50歲，均為男男性行為者(men who have sex with men, MSM)，標(biāo)本采集時(shí)CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)在134～364個(gè)/μL，病毒載量42 000～950 000 CPs/mL 之間。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)及RIP分析結(jié)果，篩選并采用與樣本株最相近的參考株，利用SimPlot 工具進(jìn)行序列相似性分析，并利用Bootscan工具進(jìn)行重組斷點(diǎn)分析，最后使用在線工具Recombinant HIV Drawing Tool繪制重組鑲嵌圖譜。027A是插入B亞型骨架的2個(gè)CRF01_AE片段的CRF01_AE/B重組，另外4例為CRF01_AE/CRF07_BC重組，其中BD201AQ 是插入 CRF07_BC 骨架的6個(gè)CRF01_AE 片段，BD133AQ和BD203AJ分別是插入CRF01_AE骨架的4個(gè)CRF07_BC片段，BD184AQ是插入CRF01_AE骨架的2個(gè)CRF07_BC片段，見圖2～6。

圖1 5條URFs的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of five URFs

圖2 027A的重組斷點(diǎn)分析；圖3 133AQ的重組斷點(diǎn)分析結(jié)果Fig.2 Analysis of recombination breakpoints of 027A；Fig.3 Analysis of recombination breakpoint of 133AQ

圖4 203AJ的重組斷點(diǎn)分析；圖5 BD201AQ的重組斷點(diǎn)分析Fig.4 Analysis of recombination breakpoints of 203AJ；Fig.5 Analysis of recombination breakpoints of BD201AQ

圖6 184AQ的重組斷點(diǎn)分析Fig.6 Analysis of recombination breakpoints of 184AQ

2.45個(gè)HIV-1 URF基因組的同源性分析 從HIV database下載中國(guó)區(qū)HIV-1 CRF01_AE近似全長(zhǎng)基因序列188條(紅色)，CRF07_BC亞型近似全長(zhǎng)基因序列38條(藍(lán)色)，B亞型近似全長(zhǎng)基因序列58條(粉色)，使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建Neighbor-Joining進(jìn)化樹，顯示027A與CRF01_AE參考株簇聚在一起，表明027A是以CRF01_AE為骨架的重組毒株，基因距離顯示，027A與來源于江蘇省的性傳播人群的參考序列CRF01_AE.CN.2007.07JSWX045.FJ441290的基因距離最小，為0.099。其余4條序列(201AQ、203AJ、184AQ、133AQ)與CRF01_BC參考株聚在一起，其以CRF07_BC為骨架，基因距離顯示201AQ、184AQ、133AQ均與參考序列CRF07_BC.CN.GZ070087.KF250366的距離最小，分別為0.074、0.099、0.087，而203AJ與參考序列CRF07_BC.CN.1114.HQ265552基因距離最近，為0.099(圖7)。

圖7 5個(gè)HIV-1獨(dú)特型重組毒株發(fā)的同源性(基因距離)Fig.7 Homology (gene distance) of 5 HIV-1 unique recombinant strains

3 討論

自 1981 年發(fā)現(xiàn)首例HIV 以來，全球因 CRF 引起的 HIV感染率從 2000 年之前的 9.3% 急劇上升到 2015 年的22.8% 。包括中國(guó)在內(nèi)的東亞是亞型間重組流行率最高的地區(qū)，2015年重組毒株比例達(dá)到80.5%[7]。在早期，中國(guó)HIV-1流行基因型主要為B′/B亞型(47.5%)、C亞型(34.3%)和CRF01_AE(9.6%)[8]。2007年以后， CRF01_AE(41.1%)逐漸增多，成為中國(guó)的主要毒株，而其他重組形式，如CRF07_BC(25.3%)和CRF08_BC(12.6%)也急劇上升，成為主要流行毒株[9]。本研究發(fā)現(xiàn)保定市HIV-1三種主要基因型為CRF01_AE(51.89%)、CRF07_BC(25.00%)和B亞型(10.98%,)，與河北省全省的基因亞型基本一致[10]。CRFs和URFs達(dá)到了89.02%，新型CRFs達(dá)到了7種，并且URFs達(dá)到了3.41%。多種亞型共存的現(xiàn)象，給雙重感染創(chuàng)造了機(jī)會(huì)，導(dǎo)致新型重組毒株的出現(xiàn)。重要的是2020年發(fā)現(xiàn)于保定市的CRF103_01B毒株[11]，位列本次研究的HIV-1亞型的第4位，占到了1.89%，有明顯上升的趨勢(shì)。本次研究中首次發(fā)現(xiàn)了CRF112_01B，此亞型于2021年在北京MSM中發(fā)現(xiàn)，尚未見公開報(bào)道，此次在保定市的MSM人群中發(fā)現(xiàn)，提示HIV-1在保定和北京的MSM人群中具有緊密傳播性。

本研究發(fā)現(xiàn)的5個(gè)URFs，具有不同的鑲嵌片段，涵蓋了主要的三種亞型，重組模式有兩種：一種是以CRF01_AE為骨架插入B亞型的CRF01_AE/B重組，一種是以CRF07_BC為骨架插入CRF01_AE的0107重組，與河北省石家莊和邯鄲CRF01_AE/CRF07_BC重組以及廊坊報(bào)道的CRF01_AE/B重組鑲嵌結(jié)構(gòu)不同[12-14]，說明河北省HIV-1亞型間的重組多種多樣，是否存在潛在的CRF或者正在形成新的CRF，應(yīng)密切注意觀察。

以往對(duì)于河北省HIV-1的分子流行病學(xué)研究大多是基于pol區(qū)全長(zhǎng)或gag區(qū)全長(zhǎng)及pol區(qū)部分片段結(jié)構(gòu)基因[6,15]，其限制性在于容易將獨(dú)特型重組毒株誤判為CRF01_AE、CRF07_BC等已經(jīng)識(shí)別的亞型，因此常常忽略重組毒株的流行情況，低估HIV-1流行亞型的多樣性。本次研究通過NFLG技術(shù)共鑒定了5株新型獨(dú)特重組毒株，并對(duì)其重組模式進(jìn)行了描述，提示保定地區(qū)的HIV-1具有豐富的基因多樣性，而HIV-1新型重組毒株的出現(xiàn)可能會(huì)進(jìn)一步增加HIV-1耐藥和免疫逃逸等的風(fēng)險(xiǎn)[16]，提升HIV-1的防治困難。因此，分析保定市HIV-1重組毒株的流行特點(diǎn)，不僅有助于了解本地區(qū)HIV-1的多樣性和分子特征，還能為保定市HIV-1的預(yù)防和臨床治療提供數(shù)據(jù)支持。