傣藥咪多領(lǐng)通過Wnt/β-catenin/c-myc信號通路對增生性瘢痕表皮干細(xì)胞干性的作用機(jī)制

趙文斌，葉建州，楊雪松，楊恩品，鄒映東，羅光云，叢琳，王金容，謝兵，郭媛媛

增生性瘢痕(hypertrophic scar，HS)是傷口異常修復(fù)的結(jié)果，其表現(xiàn)為瘢痕持續(xù)增殖突出皮面，呈現(xiàn)潮紅，質(zhì)地堅硬，且高低不平和形狀不規(guī)則[1]。主要原因為細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積等[2]。目前，HS的治療仍然是一個難題。表皮干細(xì)胞(epidermal stem cells，ESCs)是表皮組織中一種具有無限增殖和分化潛能的細(xì)胞，在皮膚穩(wěn)態(tài)和傷口修復(fù)中起著重要作用[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，相比于正常皮膚，HS組織中具有更多的Integrin β1和p63陽性ESCs[5]，提示ESCs在HS的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。此外，研究表明，Wnt/β-catenin/c-myc通路參與皮膚的愈合過程[6]，且對干細(xì)胞干性具有重要的調(diào)控作用[7-8]。提示W(wǎng)nt/β-catenin/c-myc通路可能通過調(diào)控ESCs干性參與增生性瘢痕的發(fā)生發(fā)展。傣藥咪多領(lǐng)(云南琵琶甲)是云南傣族民間常用的一種藥用昆蟲，筆者前期研究發(fā)現(xiàn)[9-12]，該藥在臨床及動物實驗中對HS均具有一定的治療作用，但是具體機(jī)制尚需進(jìn)一步明確。故本研究擬探討傣藥咪多領(lǐng)是否能夠通過Wnt/β-catenin/c-myc通路影響ESCs干性，進(jìn)而對HS具有治療作用，為該藥治療HS提供基礎(chǔ)的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑 新西蘭大耳兔購買于昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，傣藥咪多領(lǐng)干燥粗粉購買于云南省中醫(yī)醫(yī)院制劑中心，青霉素、鏈霉素及DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購買于美國賽默飛旗下Gibco公司，Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時定量PCR試劑盒購買于寶生物工程(大連)有限公司，BCA試劑盒及RIPA裂解液購買于海碧云天生物技術(shù)有限公司，CCK-8試劑盒購買于北京索萊寶科技有限公司，免疫印跡一抗及二抗購買于英國abcam公司，康瑞保(復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠，10 g)購買于MerzPharma GmbH &Co.KGaA(德國)，乙醇(貨號：E118433)、石油醚(貨號：P119716)購買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，蘇木精伊紅染色試劑盒(C0105S)購買于上海碧云天生物科技有限公司。

1.2傣藥咪多領(lǐng)的提取制備 95%乙醇回流提取傣藥咪多領(lǐng)干燥粗粉4次后，對乙醇提取物進(jìn)行濃縮。取濃縮后的乙醇提取物進(jìn)行硅膠柱層析，石油醚超聲洗脫4次，30 min/次，蒸發(fā)干燥后，回收石油醚，用蒸餾水超聲提取石油醚3次，30 min/次，然后對提取液進(jìn)行濃縮，蒸發(fā)干燥后，即為傣藥咪多領(lǐng)水提取物。

1.3動物模型構(gòu)建、分組及觀察指標(biāo) 將新西蘭大耳兔進(jìn)行麻醉和兔耳消毒后，對兔耳的雙側(cè)耳腹做6個直徑為1 cm的圓形創(chuàng)面，間隔2 cm；每個創(chuàng)面完整切除全層皮膚和軟骨膜。壓迫止血后，涂擦紅霉素眼膏，暴露創(chuàng)面。上皮化后，將新西蘭大耳兔隨機(jī)分為NC組(對照組)，Model組(HS模型組)，PC組(15 mg/kg康瑞保涂抹組)，LD組(0.667 g/kg傣藥咪多領(lǐng)涂抹組)，MD組(1.334 g/kg傣藥咪多領(lǐng)涂抹組)和HD組(2.668 g/kg傣藥咪多領(lǐng)涂抹組)，每組5只新西蘭大耳兔，按照分組進(jìn)行涂抹外敷給藥，3次/d，0.5 mL/次，持續(xù)4周，期間觀察HS的顏色和質(zhì)地變化，并計算瘢痕增生指數(shù)(hypertrophic indx，HI)，HI=A/B，A=瘢痕凸起最高點至耳軟骨表面的垂直高度；B=瘢痕周邊正常皮膚皮緣至耳軟骨表面的垂直高度，于建模后第56天進(jìn)行取材。

1.4HE染色切片觀察 取各組HS組織于固定液進(jìn)行蛋白變性凝固，梯度濃度酒精進(jìn)行脫水，隨后進(jìn)行石蠟固定包埋，于切片機(jī)上切成薄片，厚度為5 μm，水中燙平貼于載玻片上，45 ℃恒溫箱中烘干后，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，對染色后的切片進(jìn)行脫水。將脫水后的切片滴上加拿大樹膠，蓋上蓋玻片封固。待樹膠略干后，于顯微鏡下觀察并拍照。

1.5ESCs分離、分組及培養(yǎng) 將Model組中HS組織經(jīng)dispase酶消化后，收集表皮組織，再經(jīng)胰酶消化15 min，于200目篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，并收集細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并接種至含Ⅳ型膠原的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，采用胰酶消化傳代，最終進(jìn)行流式鑒定。鑒定后的ESCs分為control組(對照組)，LD-cell(0.025 g/mL傣藥咪多領(lǐng)處理組)、MD-cell(0.05 g/mL傣藥咪多領(lǐng)處理組)和HD-cell組(0.1 g/mL傣藥咪多領(lǐng)處理組)。

1.6Western blot檢測 HS組織及ESCs中各蛋白的表達(dá)水平取各組HS組織和ESCs細(xì)胞進(jìn)行RIPA裂解后，離心提取蛋白上清液進(jìn)行BCA定量分析。隨后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳3 h后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用TBS封閉1 h后，加入一抗，4 ℃孵育過夜，洗滌3次，加入相應(yīng)二抗，再次洗滌3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光底物，在凝膠成像系統(tǒng)中顯影并拍照，用Image J進(jìn)行條帶灰度值分析。

1.7RT-qPCR檢測 HS組織及ESCs中各mRNA的表達(dá)水平取各組HS組織及ESCs細(xì)胞，Trizol溶液提取總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后通過實時熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行mRNAs的定量分析，內(nèi)參為GAPDH，引物序列見表1。qPCR反應(yīng)體系：10 μL TB Green Premix Ex Taq Ⅱ，各0.8 μL PCR正反引物，0.4 μL ROX Reference Dye，2 μL DNA模板及6 μL H2O2。qPCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，進(jìn)行35個循環(huán)。實驗結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計算。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.8免疫熒光對HS組織中的Wnt4、β-catenin和c-myc進(jìn)行定量和定位 將各組HS組織石蠟切片進(jìn)行脫水和脫蠟，然后抗原修復(fù)，用PBS洗滌3次，5 min/次，10% BSA封閉30 min。取出滴加熒光一抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次，5 min/次；滴加熒光二抗，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗3次，5 min/次。甘油緩沖液封片后，熒光顯微鏡于40×下進(jìn)行觀察和拍照，并用Image J進(jìn)行熒光值分析。

1.9CCK-8檢測ESCs細(xì)胞活力 取各組對數(shù)生長期ESCs細(xì)胞，接種于96孔板中，每孔5×103個ESCs細(xì)胞，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱孵育2 h，然后酶標(biāo)儀在450 nm處測定OD值，并利用各時間點的測定OD值繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.10干細(xì)胞成球?qū)嶒灆z測ESCs成球效率 取各組對數(shù)生長期ESCs細(xì)胞，PBS洗滌3次去除含血清的舊培養(yǎng)基。用無血清懸浮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種于低黏附的6孔板中，每孔500個ESCs細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)7 d。收集形成的細(xì)胞球，1 000 r/min離心5 min去除上清液，隨后胰酶消化5 min，PBS洗滌2次，用無血清懸浮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，每孔500個ESCs細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)7 d后觀察ESCs成球情況。

1.11統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，相關(guān)圖片的繪制采用Graphpad 8.0軟件進(jìn)行繪制。組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實驗均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1傣藥咪多領(lǐng)對兔耳HS的影響 于建模后第56天對兔耳取材，并觀察各組HS變化。結(jié)果表明，PC組、MD組及HD組中HS的HI指數(shù)均顯著低于Model組(F=19.99，P<0.05，圖1a)，且PC組和HD組HI指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。此外，Model組HS呈現(xiàn)紅色，且質(zhì)地堅硬，而PC組、LD組、MD組和HD組HS顏色及質(zhì)地與周圍皮膚相近，見圖1a。同時，對各組HS組織進(jìn)行了HE染色發(fā)現(xiàn)，相比于NC組，Model組表皮下結(jié)締組織增生，真皮層中存在大量成纖維細(xì)胞，排列無序，細(xì)胞間質(zhì)有膠原纖維沉積，且微血管增生，管腔內(nèi)有紅細(xì)胞，結(jié)構(gòu)與人HS組織切片相似。相比于Model組，PC組、LD組、MD組和HD組表皮下結(jié)締組織增生和真皮層血管增生有不同程度的下降，各纖維密度也不同程度下降，此外表層排列較為規(guī)則，內(nèi)層排列紊亂，見圖1b。由以上結(jié)果可知，兔耳增生性瘢痕動物模型構(gòu)建成功，且傣藥咪多領(lǐng)對兔耳增生性瘢痕具有一定的治療作用。此外，HD組中傣藥咪多領(lǐng)劑量與HS治療藥物-康瑞保治療效果相近。

Characteristics of HS of rabbit ears in each group; HE staining of HS of rabbit ears in each group (×400)圖1 傣藥咪多領(lǐng)對兔耳HS的影響Fig.1 Effect of Blapsrynchopetera fairmaireon HS of rabbit ears

2.2傣藥咪多領(lǐng)對HS中ESCs標(biāo)志物和Wnt/β-catenin/c-myc信號通路的影響 Western blot結(jié)果顯示(圖2a)，相比于NC組，Model組中ESCs標(biāo)志物Integrin β1(t=60.76，P<0.05)、p63(t=52.44，P<0.05)、Wnt4(t=47.80，P<0.05)、β-catenin(t=79.75，P<0.05)、c-myc(t=55.71，P<0.05)蛋白均異常高表達(dá)(P<0.05)，且PC組、LD組、MD組和HD組中Integrin β1(F=1098.00，P<0.05)、p63(F=1977.00，P<0.05)、Wnt(F=800.00，P<0.05)、β-catenin(F=1139.00，P<0.05)、c-myc(F=1115.00，P<0.05)蛋白的表達(dá)水平顯著低于Model組(P<0.05)，而NC組、PC組和HD組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。RT-qPCR結(jié)果顯示(圖2b)，Model組中Integrin β1 mRNA(t=35.72，P<0.05)和p63 mRNA(t=47.29，P<0.05)表達(dá)水平顯著高于NC組，且PC組、LD組、MD組和HD組中Integrin β1 mRNA(F=798.60，P<0.05)和p63 mRNA(F=849.90，P<0.05)表達(dá)水平顯著低于Model組。進(jìn)一步通過免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)(圖2c)，Model組中Wnt4(t=35.28，P<0.05)、β-catenin(t=46.56，P<0.05)、c-myc(t=35.58，P<0.05)平均熒光水平顯著高于NC組，且PC組、LD組、MD組和HD組中Wnt4(F=376.50，P<0.05)、β-catenin(F=350.20，P<0.05)和c-myc(F=342.10，P<0.05)平均熒光水平顯著低于Model組。由以上結(jié)果可知，兔耳HS中ESCs相關(guān)標(biāo)志物異常高表達(dá)，且Wnt/β-catenin/c-myc信號通路被異常激活，此外，傣藥咪多領(lǐng)和康瑞保均能恢復(fù)這些蛋白的表達(dá)水平，且HD組中傣藥咪多領(lǐng)與康瑞保恢復(fù)效果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

Note:aP<0.05 vs. NC group;bP<0.05 vs. Model group; 1 indicated NC group; 2 indicated Model group;3 indicated PC group; 4 indicated LD group; 5 indicated MD group; 6 indicated HD group.The expression levels of ESCs markers and Wnt/β-catenin/c-myc pathway-related proteins were detected by Western blot; The expression levels of ESCs markers mRNA were detected by RT-qPCR;Quantitative and localization analysis of Wnt/β-catenin/c-myc pathway-related proteins by immunofluorescence圖2 傣藥咪多領(lǐng)對HS中ESCs標(biāo)志物和Wnt/β-catenin/c-myc信號通路的影響Fig.2 Effect of Blapsrynchopetera Fairmaire on the expression of markers of ESCs and Wnt/β-catenin/c-myc pathway in HS tissues of rabbit ears

2.3成功分離ESCs Model組兔耳HS中分離的ESCs，在普通光學(xué)顯微鏡下呈橢圓狀，且具有較大的細(xì)胞核，胞質(zhì)和包漿較少，整個細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單，符合干細(xì)胞的一般形態(tài)和結(jié)構(gòu)，見圖3a。此外，通過免疫熒光檢測了ESCs標(biāo)志物的表達(dá)水平和定位，結(jié)果顯示，ESCs中均有Integrin β1和p63表達(dá)，且主要集中表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，符合ESCs中Integrin β1和p63的表達(dá)定位，見圖3b。進(jìn)一步通過流式細(xì)胞儀檢測另外的ESCs標(biāo)志物表達(dá)水平，結(jié)果顯示，相比于control組、LD-cell組、MD-cell組和HD-cell組中CD29(F=137.50，P<0.05)、CD19F(F=59.61，P<0.05)和CK19(F=106.20，P<0.05)陽性細(xì)胞比率均下調(diào)，見圖3c。由以上結(jié)果可知，成功分離了ESCs，且傣藥咪多領(lǐng)可能會抑制兔耳HS中分離的ESCs干性。

Note:*P<0.05 vs. control group.Morphology and structure of ESCs under ordinary light microscope; Quantitative and localization analysis of ESCs markers by immunofluorescence;The rate of each positive cells was detected by Flow cytometry圖3 成功分離ESCsFig.3 Successfully separated ESCs

2.4傣藥咪多領(lǐng)對ESCs干性的影響 Western blot(圖4a)及RT-qPCR(圖4b)結(jié)果顯示，相比于control組，MD-cell組和HD-cell組中Integrin β1(蛋白：F=91.23，P<0.05；mRNA：F=246.90，P<0.05)和p63(蛋白：F=68.85，P<0.05；mRNA：F=162.10，P<0.05)蛋白和mRNA的表達(dá)水平顯著下調(diào)。CCK-8結(jié)果顯示，傣藥咪多領(lǐng)對ESCs的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，且IC50=0.836 g/mL，見圖4c。干細(xì)胞成球?qū)嶒灲Y(jié)果顯示(圖4d)，LD-cell組、MD-cell組和HD-cell組ESCs成球數(shù)顯著低于control組(F=85.10，P<0.05)。由以上結(jié)果可知，傣藥咪多領(lǐng)能夠抑制ESCs干性。

Note:aP<0.05 vs. control group； 1 indicated control group; 2 indicated LD-cell group; 3 indicated MD-cell group; 4 indicated HD-cell group.～ The expression levels of ESCs markers were detected by Western blot and RT-qPCR; The proliferation of ESCs were detected by CCK-8; Sphere efficiency of ESCs was detected by stem cell spheroidization test圖4 傣藥咪多領(lǐng)對ESCs干性的影響Fig.4 Effect of Blaps rynchopetera Fairmaire on stemness of ESCs

2.5傣藥咪多領(lǐng)通過Wnt/β-catenin/c-myc信號通路對ESCs干性的影響 為了探討傣藥咪多領(lǐng)是否通過Wnt/β-catenin/c-myc信號通路影響ESCs干性，本觀察將ESCs分為control組，BRF(0.836 g/mL傣藥咪多領(lǐng)處理)組和LiC1(0.836 g/mL傣藥咪多領(lǐng)和Wnt/β-catenin/c-myc通路激活劑LiC1處理)組，并通過Western blot、RT-qPCR、CCK-8及干細(xì)胞成球?qū)嶒炦M(jìn)行了驗證。

Western blot和RT-qPCR結(jié)果顯示，相比于control組，BRF組中Integrin β1(蛋白：t=13.29，P<0.05；mRNA：t=21.87，P<0.05)、p63(蛋白：t=16.78，P<0.05；mRNA：t=14.13，P<0.05)、Wnt(蛋白：t=7.69，P<0.05；mRNA：t=10.89，P<0.05)、β-catenin(蛋白：t=9.46，P<0.05；mRNA：t=11.90，P<0.05)、c-myc(蛋白：t=15.18，P<0.05；mRNA：t=12.39，P<0.05)蛋白及mRNA的表達(dá)水平顯著下調(diào)(圖5a～5b，P<0.05)，且相比于BRF組，LiC1組中Integrin β1(蛋白：t=9.68，P<0.05；mRNA：t=13.25，P<0.05)、p63(蛋白：t=8.67，P<0.05；mRNA：t=11.11，P<0.05)、Wnt(蛋白：t=6.16，P<0.05；mRNA：t=9.75，P<0.05)、β-catenin(蛋白：t=7.87，P<0.05；mRNA：t=7.61，P<0.05)、c-myc(蛋白：t=6.73，P<0.05；mRNA：t=9.54，P<0.05)蛋白及mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)。CCK-8結(jié)果顯示(圖5c)，BRF組和LiC1組中ESCs增殖活力顯著低于control組(t=11.80，P<0.05)，且相比于BRF組，LiC1組中ESCs增殖活力明顯增加(t=3.00，P<0.05)。此外，干細(xì)胞成球?qū)嶒灲Y(jié)果顯示(圖5d)，BRF組和LiC1組中ESCs成球數(shù)顯著低于control組(t=13.27，P<0.05)，且相比于BRF組，LiC1組中ESCs成球數(shù)明顯增多(t=10.79，P<0.05)。由以上結(jié)果可知，傣藥咪多領(lǐng)通過抑制Wnt/β-catenin/c-myc信號通路的激活，從而抑制ESCs干性。

Note:aP<0.05 vs. control group； bP<0.05 vs. BRF group.～ The expression levels of ESCs markers and Wnt/β-catenin/c-myc pathway-related protein were detected by Western blot and RT-qPCR; The proliferation of ESCs were detected by CCK-8; Sphere efficiency of ESCs was detected by stem cell spheroidization test圖5 傣藥咪多領(lǐng)通過Wnt/β-catenin/c-myc信號通路對ESCs干性的影響Fig.5 Effect of the Blaps rynchopetera Fairmaire on the stemness of ESCs through the Wnt/β-catenin/c-myc pathway

3 討論

HS是一種傷口愈合失常的常見病，其特征是過度纖維化以及皮膚成纖維細(xì)胞的膠原蛋白紊亂[13]。HS通常發(fā)生在深層次創(chuàng)傷或燒傷之后的傷口愈合過程中，嚴(yán)重者影響正常功能，從而給患者帶來身體、心理和美學(xué)問題[14]。臨床數(shù)據(jù)表明，HS在手術(shù)后及燒傷后具有極高的發(fā)病率，且在傷后2～18個月呈指數(shù)生長[15]。HS形成的主要危險因素包括性別、年齡、遺傳易感性、免疫反應(yīng)、損傷類型、傷口大小和深度、傷口的解剖部位和機(jī)械張力等[16]。但是，目前對HS發(fā)育的機(jī)制了解得不全面，因此沒有特效的療法。祖國醫(yī)學(xué)博大精深，對瘢痕的治療具有悠久的歷史，一般認(rèn)為瘢痕與先天稟賦和素體特異有關(guān)，多采用攻毒散結(jié)、活血化瘀和通絡(luò)止疼之品進(jìn)行治療[17]。據(jù)《中華本草》和《西雙版納傣藥志》記載，傣藥咪多領(lǐng)是云南傣族長期使用的一種藥用昆蟲，具有消炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)和解毒等功效。本研究通過新西蘭大耳兔構(gòu)建HS動物模型，探討傣藥咪多領(lǐng)對HS的影響。研究發(fā)現(xiàn)，傣藥咪多領(lǐng)可顯著減少HS組織中成纖維細(xì)胞數(shù)目、膠原纖維密度和HI指數(shù)，且傣藥咪多領(lǐng)作用后HS的顏色和質(zhì)地基本恢復(fù)至正常皮膚水平，表明傣藥咪多領(lǐng)對HS具有一定的治療作用，此外，本研究還探討了傣藥咪多領(lǐng)對HS的作用機(jī)制。

ESCs是具有無限增殖潛能的細(xì)胞群，可以通過對稱或不對稱分裂實現(xiàn)自我更新，連續(xù)產(chǎn)生功能性細(xì)胞以維持表皮的穩(wěn)態(tài)，分布在表皮和毛囊基底層的ESCs是皮膚發(fā)育、新陳代謝和損傷修復(fù)的重要細(xì)胞來源[18]。當(dāng)皮膚受到創(chuàng)傷時，ESCs遷移和增殖水平顯著上調(diào)，且分泌不同的細(xì)胞因子和生長因子參與表皮-間充質(zhì)細(xì)胞相互作用[19]。研究[20]發(fā)現(xiàn)，HOXA9通過上調(diào)ESCs中VEGF表達(dá)水平促進(jìn)ESCs干性，從而有助于HS的發(fā)展；ESCs在瘢痕形成期干性顯著增強(qiáng)[21]；此外，Plikus等[22]也發(fā)現(xiàn)，ESCs在創(chuàng)面愈合和瘢痕形成過程中增殖和分化能力顯著上調(diào)。這些研究成果都提示，ESCs干性的增強(qiáng)與HS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，相比于正常皮膚，增生性瘢痕中ESCs標(biāo)志物Integrin β1和p63的表達(dá)水平顯著上調(diào)，且傣藥咪多領(lǐng)能顯著抑制Integrin β1和p63的表達(dá)水平及ESCs增殖和克隆形成數(shù)，從而對HS具有一定的治療作用。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin/c-myc信號通路在HS發(fā)生發(fā)展中起到重要的調(diào)控作用，且參與多種干細(xì)胞干性的調(diào)控。例如，Sato等[23-24]發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin/c-myc信號通路在HS中異常激活，并促進(jìn)HS的發(fā)生發(fā)展，Sun等[6]也得到了同樣的結(jié)論。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[25]，作為Wnt/β-catenin通路的下游靶標(biāo)，c-myc在HS中被異常激活，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和分化，膠原蛋白的合成和降解以及細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，最終導(dǎo)致瘢痕增生。另有研究[26]顯示c-myc在皮膚瘢痕和皮膚瘢痕癌組織中高表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin/c-myc信號通路在體內(nèi)HS組織中異常被激活，且在體外ESCs細(xì)胞中異常高表達(dá)，且LiC1處理ESCs后，ESCs干性增強(qiáng)，而傣藥咪多領(lǐng)能逆轉(zhuǎn)這一過程。

綜上所述，本研究探討了傣藥咪多領(lǐng)通過Wnt/β-catenin/c-myc信號通路對增生性瘢痕表皮干細(xì)胞干性的影響，Wnt/β-catenin/c-myc信號通路相關(guān)蛋白和ESCs標(biāo)志物在體內(nèi)HS組織和體外ESCs中均異常高表達(dá)，且傣藥咪多領(lǐng)能夠抑制它們的表達(dá)水平，且對HS具有一定的治療效果。此外，在體外利用LiC1激活ESCs中Wnt/β-catenin/c-myc信號通路后，ESCs的干性顯著增強(qiáng)，而傣藥咪多領(lǐng)能夠抑制這一過程。因此，傣藥咪多領(lǐng)能夠通過抑制Wnt/β-catenin/c-myc信號通路激活抑制ESCs干性，從而影響HS的發(fā)展。