大黃素對(duì)慢性牙周炎大鼠牙槽骨重建、炎癥反應(yīng)及RANKL/OPG蛋白表達(dá)的影響

姜麗媛

(安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?？谇会t(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230601)

慢性牙周炎可導(dǎo)致牙周支持組織受損，進(jìn)而引發(fā)牙齒松動(dòng)脫落或拔除，是口腔常見(jiàn)慢性感染性疾病[1]。一項(xiàng)調(diào)查顯示，世界范圍內(nèi)約10%的人群患有重度牙周炎[2]。研究顯示，慢性牙周炎不僅可導(dǎo)致牙周組織受損，亦與糖尿病、心血管疾病等形成及進(jìn)展聯(lián)系緊密，給患者帶來(lái)嚴(yán)重影響[3]。現(xiàn)階段臨床主要通過(guò)清除菌斑及牙石、消除牙齦炎癥對(duì)慢性牙周炎患者進(jìn)行干預(yù)，然而其清除牙菌斑的效果并不理想，尤其是對(duì)重度牙周炎患者[4-5]。故進(jìn)一步尋求慢性牙周炎有效的治療手段尤為重要。大黃素可發(fā)揮抗炎、抗腫瘤、免疫抑制等功效，其已廣泛應(yīng)用于各種炎癥性疾病治療[6-7]。有報(bào)道顯示，大黃素可抑制炎性因子表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮治療牙周炎的作用。核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL) /骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)是骨代謝過(guò)程中極為重要的途徑，研究證實(shí)，炎性因子可導(dǎo)致其比例失調(diào)，最終引發(fā)牙槽骨吸收[8]。基于上述背景，本研究旨在探究大黃素對(duì)慢性牙周炎大鼠牙槽骨重建、炎癥反應(yīng)及RANKL/OPG蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 48只SD大鼠購(gòu)于凱學(xué)生物科技(上海)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2019-0001，體質(zhì)量(280±20) g。將所有大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，均自由攝食及飲水，自動(dòng)控制晝夜循環(huán)，每12 h更換1次。

1.2 主要試劑 大黃素(批號(hào)：110756-201913，北京普非生物科技有限公司)；蘇木素(批號(hào)：CTS-1097，上海晅科生物科技有限公司)；伊紅(批號(hào)：C200201，武漢華美生物工程有限公司)；RIPA(批號(hào)：R1001221，武漢博歐特生物科技有限公司)；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒[批號(hào)：P0012，伊勢(shì)久(江蘇連云港)生物科技有限責(zé)任公司]；RANKL抗體(批號(hào)：bs-0747R-1，上海恒斐生物科技有限公司)；OPG抗體(批號(hào)：ab73400，上海西格生物科技有限公司)；β-actin抗體(批號(hào)：AF7018，武漢時(shí)勝生物科技有限公司)；ELISA試劑盒(批號(hào)：I1FE1021bm，上海威奧生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 分組 隨機(jī)抽取12只大鼠作為NC組，余36只大鼠通過(guò)探針?lè)蛛x其右側(cè)上頜第二磨牙牙齦 。隨后通過(guò)無(wú)菌醫(yī)用絲線于牙周進(jìn)行結(jié)扎，最后將絲線放在牙齦下，并進(jìn)行高糖飲食，連續(xù)2個(gè)月。建模成功后將牙周炎大鼠隨機(jī)分為模型組、大黃素低劑量組、大黃素高劑量組，每組12只，其中大黃素低、高劑量組分別予以200 mg/kg、400 mg/kg大黃素灌胃，NC組、模型組均予以等量生理鹽水灌胃，每日1次。各組大鼠均連續(xù)灌胃4周。大黃素給藥劑量參考相關(guān)文獻(xiàn)[9]。

1.3.2 HE染色觀察牙周組織形態(tài)變化 將大鼠斷頸處死，并分離其右側(cè)上頜骨第二磨牙牙周組織，約剪取0.5 g，將其置于4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片；經(jīng)60 ℃烤片處理后通過(guò)二甲苯脫蠟，然后將其置于梯度酒精(75%、85%、95%、100%)浸泡。從酒精中取出切片并通過(guò)0.5%蘇木素染色，10 min后取出并通過(guò)流水沖洗3次；將切片放入1%鹽酸酒精中10 s，取出再次流水沖洗3次；滴加氨水并經(jīng)流水沖洗3次；經(jīng)伊紅染色、梯度酒精脫水、二甲苯透明后封片并進(jìn)行觀察。

1.3.3 Micro-CT分析 骨組織重建通過(guò)Micro-CT對(duì)大鼠牙槽骨標(biāo)本進(jìn)行掃描，重構(gòu)大鼠牙槽骨結(jié)構(gòu)圖，相關(guān)計(jì)量指標(biāo)包括骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)目、骨小梁分離度。

1.3.4 ELISA法檢測(cè)牙周組織白介素-17(Interleukin-17，IL-17)、白介素-23(Interleukin-23，IL-23)水平 取0.1 g大鼠牙周組織制備組織勻漿，以3000 r/min的速度離心10 min，取上清液置于-80 ℃冰箱中等待檢測(cè)。稀釋提前制備好的樣品及對(duì)照品，加入50 μL檢測(cè)抗體后封板，輕輕震蕩后于37 ℃環(huán)境下孵育1 h。然后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，封板后輕輕震蕩，于室溫下培養(yǎng)45 min。將底物A、B置于其中，隨后放在37 ℃環(huán)境下避光反應(yīng)15 min，加入終止液終止顯色反應(yīng)，通過(guò)酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.5 Western Blot檢測(cè) 牙周組織RANKL、OPG表達(dá)取牙周組織通過(guò)RIPA裂解，經(jīng)離心機(jī)以2000 r/min的速度離心10 min后取上清液，并進(jìn)一步通過(guò)BCA法測(cè)定蛋白濃度。將30 μg蛋白樣品置于各個(gè)通道，經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并進(jìn)一步轉(zhuǎn)至PVDF膜，電轉(zhuǎn)完成后采用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉處理1 h，加一抗并于4 ℃環(huán)境下過(guò)夜； 加二抗置于室溫下孵育1 h，隨后于曝光儀中曝光處理，經(jīng)Image J分析RANKL、OPG目標(biāo)蛋白表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 各組牙周組織形態(tài)變化分析 NC組牙周組織未發(fā)生明顯變化；模型組出現(xiàn)牙齦上皮增生，且有牙周袋形成，可見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及破骨細(xì)胞形成；大黃素低、高劑量組牙齦上皮增生、破骨細(xì)胞數(shù)量均少于模型組，且有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)成骨細(xì)胞及類骨質(zhì)形成。見(jiàn)圖1。

圖1 各組牙周組織形態(tài)變化(HE染色，×400)

2.2 各組Micro-CT相關(guān)指標(biāo)對(duì)比結(jié)果 模型組骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)目均較NC組降低，骨小梁分離度較NC組升高(P<0.05)。大黃素低、高劑量組骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)目均較模型組升高，骨小梁分離度均較模型組降低(P<0.05)。大黃素高劑量組骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)目均較大黃素低劑量組升高，骨小梁分離度較大黃素低劑量組降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組Micro-CT相關(guān)指標(biāo)對(duì)比

2.3 各組炎性因子水平對(duì)比 模型組IL-17、IL-23水平均較NC組上調(diào)(P<0.05)。大黃素低、高劑量組IL-17、IL-23水平均較模型組下調(diào)(P<0.05)。大黃素高劑量組IL-17、IL-23水平均較大黃素低劑量組下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組炎性因子水平對(duì)比 單位：ng/L

2.4 各組牙周組織RANKL、OPG蛋白表達(dá)對(duì)比結(jié)果 模型組組織中RANKL蛋白表達(dá)較NC組上調(diào)，OPG蛋白表達(dá)較NC組下調(diào)(P<0.05)。大黃素低、高劑量組組織中RANKL蛋白表達(dá)均較模型組下調(diào)，OPG蛋白表達(dá)均較模型組上調(diào)(P<0.05)。大黃素高劑量組組織中RANKL蛋白表達(dá)較大黃素低劑量組下調(diào)，OPG蛋白表達(dá)較大黃素低劑量組上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖2。

表3 各組牙周組織RANKL、OPG蛋白表達(dá)對(duì)比結(jié)果

3 討論

大黃素可發(fā)揮抗炎、抗腫瘤、免疫抑制等功效，研究證實(shí)其可下調(diào)PLA2及5-LOX表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致LTs、TXB等因子分泌明顯降低，有利于抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[6，10]。張國(guó)華等[6]表明，大黃素可對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠牙周炎模型發(fā)揮保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制牙周組織中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族熱蛋白結(jié)構(gòu)域3炎癥小體通路進(jìn)而抑制IL-2、IL-6等炎性因子表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。徐梅等[11]通過(guò)建立慢性牙周炎大鼠模型并予以大黃素干預(yù)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)大黃素干預(yù)后其牙周膜細(xì)胞增殖明顯加快，有利于增強(qiáng)細(xì)胞活性，同時(shí)亦可下調(diào)炎性因子表達(dá)。

圖2 各組牙周組織RANKL、OPG蛋白表達(dá)對(duì)比

組織病理觀察是研究中常用方式之一，通過(guò)該方式可對(duì)牙周炎組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、牙槽骨吸收、破骨細(xì)胞形成等情況進(jìn)行分析，本研究通過(guò)HE染色對(duì)慢性牙周炎大鼠及正常大鼠牙周組織形態(tài)變化進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，模型組出現(xiàn)牙齦上皮增生，且有牙周袋形成，可見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及破骨細(xì)胞形成；大黃素低、高劑量組牙齦上皮增生、破骨細(xì)胞數(shù)量均少于模型組，且有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)成骨細(xì)胞及類骨質(zhì)形成。牙槽骨細(xì)胞破壞可作為牙周炎的臨床癥狀之一，CT三維重建測(cè)量法是當(dāng)下臨床判斷骨結(jié)構(gòu)的常用手段之一[12-13]。其中Micro-CT具有操作簡(jiǎn)便、可重復(fù)性強(qiáng)、無(wú)創(chuàng)、精確等優(yōu)勢(shì)，其可對(duì)骨小梁進(jìn)行精確掃描并實(shí)施3D重建，進(jìn)而對(duì)骨組織質(zhì)量進(jìn)行分析[14-15]。本研究結(jié)果顯示，模型組骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)目均較NC組降低，骨小梁分離度較NC組升高。大黃素低、高劑量組骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)目均較模型組升高，骨小梁分離度均較模型組降低，尤以高劑量組變化最為明顯。說(shuō)明大黃素可促進(jìn)慢性牙周炎大鼠牙槽骨重建。

炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)在慢性牙周炎牙周組織破壞和修復(fù)過(guò)程中扮演關(guān)鍵角色[16-17]。IL-23可參與抑制牙周膜纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，同時(shí)亦可導(dǎo)致牙槽骨吸收破壞，研究證實(shí)其在慢性牙周炎患者齦溝液中的表達(dá)較健康對(duì)照組顯著增加，且其表達(dá)與患者牙周組織破壞程度及炎癥反應(yīng)程度密切相關(guān)[18-19]。BUNTE K等[20]、王中秀等[21]研究表明，在牙周炎形成及進(jìn)展過(guò)程中伴隨著IL-17表達(dá)增強(qiáng)，此時(shí)Th17介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答亦隨之增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，模型組IL-17、IL-23水平均較NC組上調(diào)，說(shuō)明慢性牙周炎大鼠體內(nèi)炎性因子水平上調(diào)。既往報(bào)道表明，IL-17水平和牙槽骨吸收受損密不可分，IL-17A及輔助性T17細(xì)胞是牙槽骨吸收受損過(guò)程中極為關(guān)鍵的因素[16，22]。大黃素低、高劑量組IL-17、IL-23水平均較模型組下調(diào)，尤其是高劑量組下調(diào)更為明顯，說(shuō)明大黃素可明顯減少慢性牙周炎大鼠體內(nèi)炎性因子水平。

RANKL及OPG可參與調(diào)控牙周炎牙槽骨吸收過(guò)程并發(fā)揮重要作用，在正常生理情況下，前者表達(dá)較后者明顯減弱，此時(shí)破骨細(xì)胞形成明顯減少，牙周內(nèi)環(huán)境處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)[8]。劉勇剛等[8]、BALLI U等[23]報(bào)道顯示，牙周炎患者齦溝液RANKL表達(dá)較健康對(duì)照組明顯上調(diào)，OPG表達(dá)較健康對(duì)照組明顯減少，患者牙周局部微環(huán)境內(nèi)兩者處于失衡狀態(tài)，破骨細(xì)胞產(chǎn)生增加，進(jìn)而導(dǎo)致牙槽骨吸收過(guò)度，給骨密度及骨吸收帶來(lái)不良影響。本研究結(jié)果顯示，模型組組織中RANKL蛋白表達(dá)較NC組上調(diào)，OPG蛋白表達(dá)較NC組下調(diào)。大黃素低、高劑量組組織中RANKL蛋白表達(dá)均較模型組下調(diào)，OPG蛋白表達(dá)均較模型組上調(diào)，尤以大黃素高劑量組變化最明顯。 說(shuō)明大黃素可能是通過(guò)上調(diào)OPG表達(dá)，下調(diào)RANKL及IL-17、IL-23表達(dá)而延緩牙周組織破壞，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)牙槽骨改建作用。大黃素可上調(diào)OPG表達(dá)，下調(diào)RANKL表達(dá)，并抑制慢性牙周炎大鼠牙周組織炎癥反應(yīng)，有利于促進(jìn)其牙槽骨重建。