miR-629對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響及可能的分子機(jī)制

翟云芝，張浩然，石默晗

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，安徽 蚌埠 233004)

乳腺癌是全球女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害著廣大女性的生命健康[1]。乳腺癌的發(fā)病是一個(gè)多基因突變的結(jié)果，miRNA的異常表達(dá)可能是其發(fā)病因素之一。miRNA作為轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度約為18～22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，在真核細(xì)胞中廣泛存在[2]?，F(xiàn)有研究表明[3-4]，miRNA參與了大約30%人類基因組內(nèi)的基因表達(dá)，影響細(xì)胞遷移、增殖等生物學(xué)過(guò)程。miR-629是 miRNAs家族中的重要成員之一，相關(guān)報(bào)道顯示，miR-629在腎細(xì)胞癌、胃癌、肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤中都呈現(xiàn)出高表達(dá)，而且與患者的預(yù)后和臨床病理相關(guān)[5]，PTEN作為一種抑癌基因，具有特異性磷酸酯酶的活性。PI3K/AKT是細(xì)胞中的經(jīng)典信號(hào)通路，PTEN可使AKT去磷酸化，阻止由AKT調(diào)控的下游信號(hào)，是PI3K的負(fù)調(diào)控，可調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)分化和凋亡。目前少有miR-629在乳腺癌發(fā)病機(jī)制中的研究報(bào)道。本研究旨在探究miR-629在乳腺癌中的表達(dá)情況以及對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 細(xì)胞和組織 人乳腺癌細(xì)胞MCF-7購(gòu)自南京凱基有限公司，采用含10%胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，收集2020年3月至2020年4月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院乳腺癌手術(shù)切除的乳腺癌組織及其癌旁組織各40例，患者術(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療，組織標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)確認(rèn)。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化有限公司。熒光定量試劑盒、PCR引物購(gòu)自上海生工生物工程公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞裂解液等購(gòu)自碧云天生物公司。miR-629-inhibitor，miRNA inhibitor NC購(gòu)自上海吉瑪技術(shù)有限公司，PTEN兔單克隆抗體、鼠抗人PI3K、AKT和β-actin單抗購(gòu)自英國(guó)Abeam公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(莖環(huán)法) 將提取的總RNA，按RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄RNA，PCR檢測(cè)miR-629的表達(dá)情況。miR-629引物序列5′-CGTGGGTTTACGTTGGGAGAACT-3′。內(nèi)參U6引物序列 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′。預(yù)變性 94 ℃ 30 s，PCR反應(yīng)94 ℃ 10 s，60 ℃30 s，循環(huán)40個(gè)，采用2-ΔΔCT計(jì)算miR-629的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 在6孔板中接種對(duì)數(shù)期細(xì)胞2×105個(gè)，按說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染miR-629-inhibitor(IN組)和inhibitor NC(NC組)。NC序列為5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′。IN序列為 5′-AGUUCUCCCAACGUAAACCCA-3′。48 h后檢測(cè)miR-629的表達(dá)情況。采用 2-ΔΔCT計(jì)算miR-629的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 對(duì)數(shù)期NC組和IN組細(xì)胞利用胰酶消化計(jì)數(shù)，把細(xì)胞密度調(diào)整為5×105個(gè)/毫升，取100 μL接種到96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h。在 0 h、24 h、48 h 和72 h分別加入CCK-8溶液，孵育4 h，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度值。

1.2.4 Western Blot 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞各5×106個(gè)，加入500 μL RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解20 min，離心，取上清，加緩沖液，煮沸。電泳轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉。加入一抗，4 ℃孵育，PBST清洗加入二抗，孵育后洗滌，ECL發(fā)光液顯影。

1.2.5 平板克隆實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞懸液調(diào)整為每毫升15×105個(gè)，取1 μL接種在6孔板，然后加入培養(yǎng)基，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，2次PBS浸洗，甲醛固定和0.1%結(jié)晶紫染色，清洗后干燥，然后克隆計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 miR-629在乳腺癌組織中的表達(dá) 與癌旁組織(0.40±0.04)比較，乳腺癌組織中miR-629的mRNA相對(duì)表達(dá)水平(1.71±0.15)顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=52.182，P<0.001)，見(jiàn)圖1。

注：與癌旁組織比較，*P<0.001。圖1 乳腺癌組織及癌旁組織中 miR-629RNA的表達(dá)

2.2 抑制miR-629表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響 采用CCK-8測(cè)miR-629敲低后對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的影響。結(jié)果顯示，與 NC組細(xì)胞對(duì)比，IN組細(xì)胞在48 h和72 h的增殖速度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NC組細(xì)胞克隆形成數(shù)(101.67±11.93)明顯高于IN組(64.00±11.53)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.932，P=0.017)。見(jiàn)表1、圖2。

表1 抑制miR-629表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響

注：A.克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)miR-629表達(dá)對(duì)MCF-7 細(xì)胞增殖能力的影響，B.CCK-8法檢測(cè)下調(diào)miR-629 表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖能力的影響； 與NC組比較，*P<0.05。圖2 抑制miR-629表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 Western Blot檢測(cè)下調(diào)miR-629表達(dá)結(jié)果 PTEN的表達(dá)水平NC組(0.44 ±0.03 )較IN組細(xì)胞(1.31±0.11 )明顯降低(t=13.216，P<0.001)。P-PI3K和P-AKT蛋白亦明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

注：A.下調(diào)miR-629表達(dá)對(duì)PTEN表達(dá)的影響，B.下調(diào) miR-629表達(dá)對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表 達(dá)的影響；與NC組比較，*P<0.05。圖3 Western Blot檢測(cè)下調(diào)miR-629表達(dá)對(duì)PTEN 及PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年來(lái)有發(fā)病率上升和年輕化的趨勢(shì)[6]。盡管乳腺癌在治療方面有很大進(jìn)展，但仍有一部分復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后不良[7]。因此，研究乳腺癌增殖方面的可能機(jī)制，探究乳腺癌的潛在分子靶點(diǎn)，具有非常重要的臨床意義。miRNA是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，已經(jīng)證實(shí)參與了乳腺癌、鼻咽癌、惡性淋巴瘤等腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并且與腫瘤分期、藥物治療敏感度以及預(yù)后相關(guān)，miRNA可能是惡性腫瘤的分子治療靶點(diǎn)[8-9]。研究表明，miRNA發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用，通過(guò)調(diào)控靶基因，進(jìn)而影響信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)促進(jìn)腫瘤的作用[10-11]。

miRNA為腫瘤的靶向治療提供了新的思路和方向，隨著miRNA家族在乳腺癌的研究不斷深入，也不斷發(fā)現(xiàn)了乳腺癌的可能潛在靶點(diǎn)。有學(xué)者報(bào)道[12]，miRNA-21在乳腺癌患者中過(guò)表達(dá)，可能是乳腺癌的潛在靶點(diǎn)。PTEN因其磷酸酯酶的活性，可拮抗磷酸化酶活性，而發(fā)揮抗腫瘤作用；另外，PTEN蛋白還作用細(xì)胞信號(hào)通路，使IP3 的3位磷酸去磷酸化，從而抑制IP3激酶活性，影響細(xì)胞周期，從而達(dá)到抑制腫瘤[13]。已經(jīng)證實(shí)[14]，在腫瘤的進(jìn)展過(guò)程中，PI3K/AKT信號(hào)通路扮演了重要角色，負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)信息的傳遞，而且與其他通路協(xié)同參與細(xì)胞增殖和凋亡。AKT在該通路中作用關(guān)鍵，其可由上游 PI3K磷酸化或者PTEN突變而激活，進(jìn)而活化mTOR、VEGF、MAPK等下游分子，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和凋亡等。本研究旨在觀察miR-629在乳腺癌中的表達(dá)情況，探討其對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響及其可能的作用機(jī)制，為乳腺癌的靶向治療提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)和方向。本研究結(jié)果顯示，在乳腺癌組織中miR-629的表達(dá)水平呈現(xiàn)高表達(dá)，與癌旁組織比較顯著增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。學(xué)者YAN H J等[15]研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌中miR-629呈現(xiàn)高表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和遷移。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[16]，miR-629在肝癌中也呈現(xiàn)高表達(dá)，但在乳腺癌中少見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究還發(fā)現(xiàn)， miR-629敲低后對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的影響，與 NC組細(xì)胞對(duì)比，IN組細(xì)胞在48 h和72 h 的增殖速度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而且NC組細(xì)胞克隆形成數(shù)明顯高于IN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究還發(fā)現(xiàn)IN組細(xì)胞中PTEN的表達(dá)水平較NC組細(xì)胞明顯升高，而P-PI3K和P-AKT蛋白明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。據(jù)此推測(cè)miR-629促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，可能通過(guò)降低抑癌基因PTEN表達(dá)，激活PI3P/AKT信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的，提示是否可以通過(guò)抑制miR-629的表達(dá)，進(jìn)而靶向 PTEN/PI3K/AKT 信號(hào)通路，可能是治療乳腺癌的一個(gè)新的路徑。近年來(lái)，miR-629的下游靶基因也在不斷被研究發(fā)現(xiàn)，有學(xué)者報(bào)道FOXO3可能是miR-629-5p的下游潛在靶基因，并可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、自噬等過(guò)程[17]。

該研究樣本量較少，可能導(dǎo)致結(jié)果偏倚，將來(lái)會(huì)繼續(xù)開(kāi)展此方面的研究，進(jìn)一步探討miR-629與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展作用機(jī)制。