基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接和代謝組學(xué)研究雞血藤抗AS藥效與機(jī)制

方曉燕，李保生，黎飚，周柳芳，盧國(guó)康，彭靜靜，王金花，楊彩艷，3

(1. 廣西壯族自治區(qū)中藥體內(nèi)藥物化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)與應(yīng)用工程研究中心，廣西 百色 533000；2. 廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西 南寧 530023；3. 右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 百色 533000)

心腦血管疾病(cardio-cerebrovascular disease，CCD)是心血管疾病和腦血管疾病的總稱(chēng)，通常指由高血壓、高血脂、高黏血和動(dòng)脈粥樣硬化等導(dǎo)致的心臟、大腦和全身組織缺血性和出血性疾病[1]。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是CCD主要的病理和致死因素，全球僅由冠狀動(dòng)脈粥樣硬化疾病(coronary artery disease，CAD)導(dǎo)致的疾病致死率大約為31%[2-3]。代謝綜合征尤其是脂質(zhì)代謝改變?cè)诜逝謱?dǎo)致的CAD發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的角色[4]。鞘脂(sphingolipids)屬于組成細(xì)胞膜主要成分的一類(lèi)脂質(zhì)，其種類(lèi)和含量受各種酶的活性、不同基質(zhì)的可用程度影響，其中一些鞘脂還受到AS、Ⅱ型糖尿病、肥胖等疾病病理過(guò)程影響[5-6]。鞘氨醇-1-磷酸酯(sphingosine-1-phophate，S1P)作為一種具有生物活性的鞘脂控制如應(yīng)激反應(yīng)、穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞生長(zhǎng)等細(xì)胞功能的多樣性，因此sphingolipid/S1P信號(hào)通路在A(yíng)S發(fā)生、發(fā)展、預(yù)防和治療中更是具有重要的作用[7-8]。

中藥雞血藤(spatholobus suberectus，spatholobus parviflorus，butea suberecta) 屬于豆科密花豆屬密花豆的根和莖，被廣泛用于治療貧血、月經(jīng)病和CCD等多種與血虛、血瘀中醫(yī)證候相關(guān)的疾病[9-11]。之前藥理學(xué)研究成果表明雞血藤提取物通過(guò)回調(diào)COX-1(cyclooxygenase-1)、5-LO(5-lipoxygenase)、PLA2(phospholipase A2)和12-LO(12-lipoxygenase)的表達(dá)差異而具有抗炎藥效，通過(guò)降低由NMDA誘發(fā)興奮性毒性損傷凋亡細(xì)胞數(shù)量保護(hù)神經(jīng)元，同時(shí)還具有活血化瘀的藥效[12-15]。目前較少有研究雞血藤防治AS及并發(fā)癥藥效機(jī)制的報(bào)道?！痘实蹆?nèi)經(jīng)》曰上醫(yī)治未病、中醫(yī)治欲病、下醫(yī)治己病即醫(yī)術(shù)最高明的醫(yī)生并不是擅長(zhǎng)治病的人，而是能夠預(yù)防疾病的人，預(yù)防藥效及其機(jī)制吸引了越來(lái)越多中藥研究者的興趣；作為CCD主要病理特征，AS早期病變主要與脂質(zhì)過(guò)度吸收有關(guān)，此外根據(jù)中醫(yī)胖者多虛理論和臨床實(shí)踐過(guò)食肥甘厚味會(huì)影響運(yùn)動(dòng)功能；因此本文中使用高脂誘導(dǎo)的AS家兔研究雞血藤預(yù)防AS及少肌癥藥效并基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和代謝組學(xué)闡明其藥效機(jī)制和藥效物質(zhì)，為后續(xù)深入研究和開(kāi)發(fā)雞血藤提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)委托給上海中科新生命生物科技有限公司使用超高效液相色譜儀(UPLC，Agilent 1290 Infinity LC，Agilent)-高分辨質(zhì)譜(Q-TOF-MS，AB Triple TOF 6600，AB SCIEX)在25 ℃下完成。高分辨質(zhì)譜配有電噴霧離子源(ESI)，超高效液相色譜儀配置有色譜柱(Waters，ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μM，2.1 mm×100 mm column；Waters，ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μM，2.1 mm×100 mm column)以及低溫高速離心機(jī)(Eppendorf5430R)。全自動(dòng)化分析儀(7600-020，Hitachi)，自動(dòng)錐板式血液流變分析儀(SA9000，Beijing Succeeder Technology Inc.，Beijing，China)，數(shù)碼生物顯微鏡(Motic BA210，麥克奧迪公司) 和虛擬掃描切片系統(tǒng)(Motic BA600，麥克奧迪公司)。

1.2 藥材和劑量 雞血藤于2019年3月16日購(gòu)自百色市正陽(yáng)藥店，藥材樣本(編號(hào)2019-03-16) 存放于右江民族醫(yī)學(xué)院楊彩艷課題組。高脂飼料由課題組自制獲得，其配方為膽固醇-豬油-蛋黃-基礎(chǔ)飼料(1∶8∶4∶87)[16]。新西蘭家兔 (雌雄各半，體重2.00～2.50 kg，月齡4.5個(gè)月，質(zhì)量合格證編號(hào)：0008757)由廣西田東隆祥兔業(yè)有限公司提供(醫(yī)學(xué)倫理審查批號(hào)：2019030105)。膽固醇(編號(hào)：531F102，Beijing Solarbio Co. Ltd.)，總膽固醇(TC，編號(hào)：201012)，甘油三酯(TG，編號(hào)：201020)，低密度脂蛋白(LDL-C，編號(hào)：200928)和高密度脂蛋白(HDL-C，編號(hào)：200928)由麥克生物股份有限公司提供，超氧化物歧化酶(SOD，編號(hào)：20010910228，美康科技生物股份有限公司)，烏拉坦 (ethyl carbamate，編號(hào)：HY1223-500g)購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司。血脂康 (批號(hào)：20201201) 為北大維信生物科技有限公司生產(chǎn)。“痹病藥膳方”組成雞血藤25 g、土茯苓25 g、豬腿骨500 g，確定成人單味服用雞血藤中等劑量為75 g生藥量/天[17]。換算成兔子劑量是3.5 g/(d·kg)，藥材提取浸膏率為12%，因此0.21 g/(d·kg)、0.42 g/(d·kg)和 0.84 g/(d·kg)被分別用于低、中、高劑量進(jìn)行試驗(yàn)，血脂康組劑量為生藥量0.36 g/(d·kg)。

1.3 提取和藥效評(píng)價(jià) 干燥雞血藤 (25 kg)依次使用乙醇-水 (90∶10，50∶50和5∶95) 在室溫下浸提 (3次/梯度，72小時(shí)/次)。所有提取液混合并減壓濃縮干燥獲得3 000 g 顆粒狀浸膏。對(duì)48只兔子給予基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分成正常組、模型組、血脂康組及雞血藤低、中和高三個(gè)劑量組(每組均為雌雄各半)。每周測(cè)1次體重，正常組飲食基礎(chǔ)飼料，其它組飲食高脂飼料，雞血藤低、中和高劑量組額外分別按0.21 g/(d·kg)、0.42 g/(d·kg)和0.84 g/(d·kg)提取物口服給藥，單籠飼養(yǎng)，連續(xù)給藥60 d。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后所有兔子禁食不禁水12 h，使用5 mL肝素鈉采血管(每管外加0.4 mL 0.1 mg/mL肝素鈉)耳緣靜脈采血用于血脂組成、血液流變學(xué)和SOD含量實(shí)驗(yàn)。耳緣靜脈采血結(jié)束后從耳緣靜脈注射烏拉坦-水(20%，w/v； 4 mL/kg)麻醉，從頸動(dòng)脈采集血用于代謝組學(xué)分析，取主動(dòng)脈弓和比目魚(yú)肌用于病理形態(tài)分析。

1.4 代謝組學(xué)分析 所有血清樣本從-80 ℃冰箱中取出后均在4 ℃中緩慢溶解，每個(gè)樣本取100 μL加入400 μL甲醇-乙腈 (1∶1，v/v)后渦旋60 s，渦旋后樣本置于-20 ℃中1 h、在14 000 r/min下離心10 min沉淀蛋白質(zhì)。上清液經(jīng)0.22 μM濾膜過(guò)濾后取0.2 μL經(jīng)UPLC-Q-TOF-MS分析(柱溫25 ℃，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4 ℃，流速0.3 mL/min)。 洗脫劑A-B(A為25 mM乙酸銨與25 mM氨的水溶液，B為乙腈)0～0.5 min為5∶95、0.5～7 min從5∶95勻速變化至35∶65、7～8 min從35∶65變至60∶40、8～9 min為60∶40、9～9.1 min從60∶40變化至5∶95及9.1～12 min為5∶95(v/v)。質(zhì)譜分析使用陽(yáng)離子和陰離子兩種模式，參數(shù)設(shè)置如下：氣體溫度為250 ℃、干燥氣流速度為161/min、噴霧器為20 psig、鞘層氣體溫度為400 ℃、鞘層氣體流速為121/min、vcap為3000 V、噴嘴電壓為0 V、碎片電壓175 V、質(zhì)量范圍為50～1200、采集速度為4 Hz和循環(huán)時(shí)間為250 ms。

1.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接研究及構(gòu)建藥效代謝差異物-抗AS相關(guān)靶點(diǎn)等相關(guān)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 從OMIM (https://omim.org)、DisGeNET (http://www.disgenet.org)和GeneCards(https://www.genecards.org)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取AS疾病差異基因即藥物治療潛在藥效靶點(diǎn)。從TCMSP (http://tcmspw.com/tcmsp.php) 和DrugBank (http://www.drug.bank.ca/)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取雞血藤化合物、藥材靶點(diǎn)、化合物靶點(diǎn)信息，對(duì)化合物進(jìn)行ADME (oral bioavailability，OB≥30%；drug-likeness，DL≥0.18)篩選，進(jìn)一步獲得潛在藥效物質(zhì)和其靶點(diǎn)信息。在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)查找與AS疾病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)實(shí)驗(yàn)基因芯片，獲得更為確切的AS疾病差異表達(dá)基因(P≤0.05)即潛在藥效靶點(diǎn)。應(yīng)用OmicShare數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建OMIM、DisGeNET和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)及雞血藤藥效靶點(diǎn)子集獲得雞血藤抗AS藥效靶點(diǎn)；進(jìn)一步應(yīng)用OmicShare數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建雞血藤抗AS藥效靶點(diǎn)與基因芯片獲得的差異表達(dá)基因子集，子集靶點(diǎn)作為重點(diǎn)關(guān)注的基因即更潛在藥效靶點(diǎn)。運(yùn)用KEGG通路衍射(https://www.genome.jp/kegg/tool/map_pathway2.html)分析獲得關(guān)鍵的信號(hào)通路，STRING(https://string-db.org)和GeneMANIA(http://genemania.org)數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape軟件構(gòu)建靶點(diǎn)-靶點(diǎn)、靶點(diǎn)-化合物-基因芯片關(guān)系網(wǎng)絡(luò)、靶點(diǎn)-代謝物、代謝物-代謝物等相關(guān)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)[18-19]。運(yùn)用AMBER 18和PyMol 2.5軟件，Auto-Dock Vina 1.2及一些輔助技術(shù)進(jìn)行分子對(duì)接模擬研究。

2 結(jié)果

2.1 雞血藤對(duì)家兔的藥效

2.1.1 雞血藤對(duì)AS家兔SOD、體重和血脂水平的影響結(jié)果 從表1可知所有家兔的體重均增加，和正常組與模型組相比，除低劑量組在30 d及中劑量組外差異不具有統(tǒng)計(jì)意義；這提示高脂飲食并沒(méi)有導(dǎo)致家兔體重顯著增加，適當(dāng)?shù)碾u血藤用量能促進(jìn)其增加。各組間SOD含量差異不明顯(P>0.05)，這意味著高脂飲食并沒(méi)有導(dǎo)致4.5月齡家兔的SOD水平發(fā)生異常變化。雞血藤提取物各項(xiàng)脂質(zhì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。與正常組比較，模型組能明顯 (P<0.05)增加血漿中TG、TC、LDL-C和HDL-C水平，除高劑量組中HDL-C在30 d之外血脂康組和雞血藤各組中TG、TC、LDL-C和HDL-C水平均高于正常組但低于模型組；此外，和模型組相比，除30 d時(shí)HDL-C外，血脂康組和雞血藤各組大部分差異都具有統(tǒng)計(jì)意義。除HDL-C外，血脂康各項(xiàng)指標(biāo)比雞血藤各組更接近正常組；在60 d時(shí)除LDL-C外中劑量組和高劑量組其余各項(xiàng)指標(biāo)比低劑量組更接近正常組，但與低劑量組相比只有30 d時(shí)LDL-C、HDL-C及TC差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中劑量組和高劑量組之間的差異不明顯。以上結(jié)果表明雞血藤和血脂康具有降血脂的藥效，使用雞血藤最佳的劑量可能是 0.42 g/(d·kg)，血脂康降血脂作用比雞血藤?gòu)?qiáng)。

表1 雞血藤對(duì)AS家兔SOD、體重和血脂水平影響

表1(續(xù)) 雞血藤對(duì)AS家兔SOD、體重和血脂水平影響

2.1.2 雞血藤對(duì)AS家兔血液流變學(xué)的影響結(jié)果 與正常組相比，除60 d時(shí)血漿黏度外模型組各項(xiàng)指標(biāo)均明顯增加(P<0.05)，各實(shí)驗(yàn)組大部分?jǐn)?shù)據(jù)值也明顯增大(P<0.05)。與模型組相比，血脂康組各項(xiàng)數(shù)據(jù)均明顯降低，接近于正常組；對(duì)低劑量組而言只有30 d時(shí)紅細(xì)胞聚集指數(shù)明顯降低(P<0.01)，除30 d時(shí)全血黏度(200.00 s-1)外中劑量組和高劑量組的各項(xiàng)數(shù)據(jù)均明顯降低(P<0.05)。與低劑量組相比，高劑量組和中劑量組的數(shù)據(jù)更接近正常組，與低劑量組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中劑量組和高劑量組之間的差異不明顯。以上的結(jié)果表明血脂康和雞血藤乙醇-水提取物均具有改善血液流變學(xué)的藥效，雞血藤最佳劑量可能是0.42 g/(d·kg)，雞血藤藥效弱于血脂康。見(jiàn)表2。

表2 雞血藤對(duì)AS家兔血液流變學(xué)影響結(jié)果

表2(續(xù)) 雞血藤對(duì)AS家兔血液流變學(xué)影響結(jié)果

2.1.3 形態(tài)學(xué)結(jié)果 主動(dòng)脈弓形態(tài)學(xué)變化見(jiàn)圖1，正常組血管內(nèi)膜邊界非常清楚且在血管內(nèi)膜表面沒(méi)有發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)條紋；模型組血管內(nèi)膜表面脂質(zhì)條紋非常明顯，內(nèi)膜變厚、內(nèi)彈力膜消失。血脂康組不如正常組光滑完整，內(nèi)皮細(xì)胞的排列也不如正常組規(guī)律但其程度都明顯比模型組輕。低劑量組、高劑量組形態(tài)改變與模型組相似但血管內(nèi)膜邊界比模型組清晰，中劑量組內(nèi)膜上脂質(zhì)條紋消失；血脂康組和雞血藤各劑量組內(nèi)膜厚度、粥樣斑塊面積、內(nèi)膜與中膜厚度比值都介于正常組和模型組之間，中劑量組比低劑量組和高劑量組值小，中劑量組比血脂康組大(見(jiàn)表1)[19]；以上的結(jié)果表明雞血藤乙醇-水提取物能阻止因高脂飲食誘導(dǎo)的脂質(zhì)在家兔血管內(nèi)壁聚集導(dǎo)致的AS疾病，最佳的劑量為0.42 g/(d·kg)，其藥效比血脂康弱。比目魚(yú)肌形態(tài)學(xué)變化見(jiàn)圖2，和正常組相比，模型組肌肉內(nèi)部裂紋明顯比正常組增大，肌肉的橫截面積比正常組明顯減小，血脂康組雞血藤組中劑量組肌肉橫截面積接近正常組，雞血藤中劑量組比正常組略大；說(shuō)明雞血藤在劑量為0.42 g/(d·kg)時(shí)能有效預(yù)防高脂飲食對(duì)比目魚(yú)肌即運(yùn)動(dòng)功能的損害，其藥效比血脂康略強(qiáng)。

2.2 代謝組學(xué)研究 研究AS家兔血清代謝組學(xué)，從而研究雞血藤預(yù)防AS藥效機(jī)制。質(zhì)量控制(QC)樣品UPLC-Q-TOF-MS總離子流圖表明各色譜峰的保留時(shí)間和響應(yīng)強(qiáng)度重疊都很好，因此整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中儀器誤差引起的變化較小。XCMS軟件在陽(yáng)離子和陰離子模式下分別提取到11 489和8 516個(gè)離子峰。利用UPLC-Q-TOF-MS 數(shù)據(jù)建立主成分分析(PCA)模型識(shí)別正常組、模型組和中劑量組之間整體性差異(見(jiàn)圖3和表3)，結(jié)果表明正離子模式組間的聚類(lèi)系數(shù)要高于負(fù)離子模式。以上結(jié)果表明正離子模式比負(fù)離子

圖1 雞血藤對(duì)AS家兔主動(dòng)脈弓病理形態(tài)學(xué)研究結(jié)果(10×)

注：雞血藤組為中劑量，柱狀圖縱坐標(biāo)為橫截面積，A、B和C對(duì)應(yīng)正常組、模型組和雞血藤組(20×)。圖2 雞血藤對(duì)AS家兔比目魚(yú)肌病理形態(tài)學(xué)研究結(jié)果

模式具有更高的可信度和優(yōu)化度，因此下文中關(guān)于代謝組學(xué)的研究、討論都是基于正離子模式。得分圖表明中劑量組和模型組能從正常組中分離聚類(lèi)，中劑量組也能從模型組中分離聚類(lèi)。此外，偏最小二乘回歸(PLS-DA)和正交偏最小二乘辨別分析(OPLS-DA)被用來(lái)鑒別三組中差異代謝物(見(jiàn)表3)，所有R2Y值都高于 0.9 cum、所有Q2值都高于0.50 cum，這個(gè)結(jié)果表明模型是穩(wěn)定可靠的。分別從模型組與正常組、中劑量組與模型組及中劑量組與正常組之間鑒別出37、43和36差異代謝物(P<0.05)，22 個(gè)代謝差異物被確定為藥效代謝差異物。通過(guò)MetaboAnalyst 5.0軟件對(duì)藥效代謝差異物進(jìn)行代謝通路富集分析闡明關(guān)鍵的代謝通路。如圖4所示，雞血藤藥效代謝差異物主要參與histidine、sphingolipid、arginine和proline以及glycine、serine和 threonine代謝，代謝異常主要表現(xiàn)在脂質(zhì)和氨基酸代謝。這個(gè)結(jié)果表明雞血藤提取物代謝機(jī)制主要調(diào)節(jié)脂質(zhì)和氨基酸代謝紊亂。Sphingomyelin、sphingosine 和sphinganine參與糖鞘脂(sphingolipid)通路代謝，creatine、creatinine、L-proline及D-proline參與精氨酸-脯氨酸(arginine and proline)通路代謝，L-histidine、histamine和4-imidazoleacetic acid參與組氨酸(histidine)通路代謝(見(jiàn)圖4)。 以上結(jié)果表明sphingomyelin、sphingosine、sphinganine、creatine、creatinine、L-proline、D-proline，L-histidine、histamine和4-imidazoleacetic acid 可被認(rèn)為是潛在的藥效代謝標(biāo)志物。

注：MD、CT和EJ分別代表模型組、正常組和中劑量組，左、右圖分別為陽(yáng)、陰離子模式。圖3 PCA得分圖

表3 多元統(tǒng)計(jì)分析中R2X、R2Y值Q2

圖4 MetaboAnalyst 5.0 對(duì)藥效代謝差異物進(jìn)行富集分析圖

2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析 通過(guò)使用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù) (https://www.genome.jp/kegg/tool/map_pathway2.html)將基因和代謝差異物進(jìn)行衍射分析和Cytoscape軟件構(gòu)建代謝差異物網(wǎng)絡(luò)可以將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和代謝組學(xué)研究結(jié)果融合、相互印證，更準(zhǔn)確地闡明中藥防治疾病藥效機(jī)制。從TCMSP和DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)收集到23個(gè)潛在藥效物質(zhì) (OB≥30%和DL≥0.18)及135 個(gè)潛在藥效物質(zhì)對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，300個(gè)雞血藤藥材靶點(diǎn)；分別從DisGeNET、GeneCards和OMIM-Gene數(shù)據(jù)庫(kù)獲得2044、4481和228個(gè)AS疾病差異表達(dá)基因；通過(guò)OmicShare數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建疾病差異表達(dá)基因和雞血藤潛在藥效靶點(diǎn)子集獲得114個(gè)潛在雞血藤抗AS藥效靶點(diǎn)。在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中找到包含12個(gè)CAD患者和4個(gè)健康人內(nèi)皮祖細(xì)胞樣本的基因芯片集GS-E18608，包含3個(gè)嚴(yán)重肥胖患者和3正常人脂肪干細(xì)胞樣本的芯片集GSE48964，包含13個(gè)健康人和18個(gè)CAD患者T細(xì)胞樣本、13個(gè)健康人和18個(gè)CAD患者單核細(xì)胞樣本和剩余單核細(xì)胞 (rest monocytes)及11個(gè)健康人和12個(gè)CAD患者干細(xì)胞樣本的基因芯片集GSE9820。應(yīng)用 OmicShare數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建這些基因芯片集差異表達(dá)基因(P≤0.05)與雞血藤抗AS藥效靶點(diǎn)子集，分別獲得雞血藤與GSE18608、GSE48964和GSE9820子集數(shù)目分別為7、11和38個(gè)。

運(yùn)用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)獲得的潛在藥效靶點(diǎn)和代謝差異物進(jìn)行通路衍射分析獲得重要的信號(hào)通路，利用STRING和GeneMANIA數(shù)據(jù)庫(kù)及Cytoscape軟件構(gòu)建靶點(diǎn)-靶點(diǎn)、靶點(diǎn)-化合物-基因芯片及靶點(diǎn)-代謝物相關(guān)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖5～圖7)。結(jié)果表明有10個(gè)雞血藤抗AS靶點(diǎn)其中有8個(gè)為重點(diǎn)關(guān)注即潛在藥效基因和3個(gè)藥效代謝差異物(sphinganine，sphingomyelin and sphingosine)作用于sphingolipid信號(hào)通路，且半數(shù)以上這些靶點(diǎn)的連接度相對(duì)都較大；此外，代謝組學(xué)研究結(jié)果(見(jiàn)圖4)表明鞘脂(sphingolipid)代謝在雞血藤發(fā)揮藥效的代謝通路中的重要性?xún)H次于組氨酸(histidine)代謝；這就暗示sphingolipid信號(hào)通路是雞血藤防治AS藥效機(jī)制中非常重要的一條信號(hào)通路。此外有23個(gè)雞血藤抗AS靶點(diǎn)，其中16個(gè)為重點(diǎn)關(guān)注即更潛在藥效基因作用于脂質(zhì)-AS(lipid and atherosclerosis)信號(hào)通路且大多數(shù)靶點(diǎn)的連接度都較大，這些靶點(diǎn)大多都作用于LOX-1/Src和LOX-1/AKT這兩個(gè)子通路上，這就提示脂質(zhì)-AS信號(hào)通路中LOX-1/Src和LOX-1/AKT是其重要的子信號(hào)通路；MAPK1、MAPK14、AKT1、TP53、STAT3、CASP3、CASP3、MMP9和JUN是其潛在的、重要的靶點(diǎn)。運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖7)，結(jié)果顯示木犀草素、芒柄花素、鉤藤酮A、8-O-methylreyusi、豆甾醇、驢食草酚、β-谷甾醇、psi-baptigenin和常春藤皂苷元在關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中連接度較大，是雞血藤潛在關(guān)鍵藥效物質(zhì)。

注：深紅色、淺紅色和灰色節(jié)點(diǎn)表示代謝差異物、代謝差異物的鄰居和連接兩個(gè)隨機(jī)節(jié)點(diǎn)的催化酶。圖5 雞血藤提取物抗AS代謝網(wǎng)絡(luò)

注：節(jié)點(diǎn)的大小與連接度成正比。綠色、紅色、藍(lán)色和黑色字體節(jié)點(diǎn)分別為基因芯片GSE18608、GSE9820、GSE48964和其他的靶點(diǎn)，綠色、粉色、紫色和黃色節(jié)點(diǎn)分別為作用于脂質(zhì)-動(dòng)脈粥樣硬化、鞘脂，同時(shí)作用于兩個(gè)信號(hào)通路及其他信號(hào)通路的靶點(diǎn)。

注：橢圓、鉆石、V和三角形節(jié)點(diǎn)分別為靶點(diǎn)、化合物、器官和基因芯片，紅、綠、紫和黃色節(jié)點(diǎn)分別作用于鞘脂、脂質(zhì)-AS、兩個(gè)信號(hào)通路及其它信號(hào)通路靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)大小與連接度成正比。

2.4 分子對(duì)接驗(yàn)證 根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果，根據(jù)潛在靶點(diǎn)和藥效成分連接度及潛在藥效物質(zhì)的結(jié)構(gòu)選擇重要的藥效成分luteolin、aloe-emodin、Formononetin、vestitol、naringenin、psi-Baptigenin和3，9-di-O-methylnissolin及其連接的重要靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如表5和圖8。表明luteolin、 aloe-emodin、Formononetin、vestitol、naringenin是雞血藤作用于A(yíng)S結(jié)合較好的藥效物質(zhì)， MAPK14、TP53、CASP3、JUN、MMP9和IL6是雞血藤作用于A(yíng)S較好的藥效靶點(diǎn)，脂質(zhì)-AS和鞘脂是其重要的信號(hào)通路。

表4 潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)和藥效成分分子對(duì)接模擬結(jié)果

圖8 雞血藤潛在重要藥效物質(zhì)和藥效靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

雞血藤因其具有活血補(bǔ)血作用而被廣泛應(yīng)用于臨床，AS作為中醫(yī)臨床中最為典型的血瘀證型而被普遍用于中藥活血藥效研究。AS的病理病因并不十分清楚，但高脂血、高黏血、高血壓和炎癥是其主要的病因[20]。另外長(zhǎng)期飲食肥甘厚味食物常常會(huì)同時(shí)誘發(fā)上述多種疾病，這也是近二十年來(lái)CCD發(fā)病率急速升高的重要原因。因此高脂誘導(dǎo)的AS家兔模型被本文用來(lái)研究雞血藤提取物的藥效及作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)中，組間體重差異并不明顯可能是由于家兔的月齡較低尚未完全發(fā)育成熟所致，中劑量組體重增加最為明顯的可能是適量服用雞血藤能通過(guò)活血作用促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和分布。AS的每一個(gè)階段都卷入炎癥，炎癥免疫通路與濾泡樹(shù)突細(xì)胞、Treg、Th1和Th17細(xì)胞凋亡及幾種氧化機(jī)制和促血管生成因子相關(guān)[21]。近年有研究表明CAD致死率與HDL-C水平之間存在“U”關(guān)系，這就表明過(guò)低或過(guò)高的HDL-C水平都會(huì)導(dǎo)致冠心病的死亡率增加；然而大量的臨床數(shù)據(jù)和研究都表明HDL-C在炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡蛋白質(zhì)和血栓形成過(guò)程中都表現(xiàn)出保護(hù)作用，例如他汀類(lèi)藥物的療效就來(lái)源于其升高HDL-C水平和降低致動(dòng)脈粥樣硬化脂蛋白水平[22-23]。因此本實(shí)驗(yàn)中 HDL-C變化趨勢(shì)與TG、TC、LDL-C一致需要更深入研究闡明當(dāng)機(jī)體受到致病因素侵襲時(shí)本身免疫功能增強(qiáng)(HDL-C升高)，還是過(guò)高HDL-C水平是導(dǎo)致本實(shí)驗(yàn)AS發(fā)生的原因之一。LDL-C/HDL-C值常被用來(lái)代表致動(dòng)脈粥樣硬化和保護(hù)性脂蛋白平衡的重要指標(biāo)，在臨床上常被用來(lái)預(yù)測(cè)心腦血管疾病發(fā)生機(jī)率[24]。LDL-C升高是AS發(fā)生的一個(gè)重要因素，有很強(qiáng)的證據(jù)表明其水平的降低是降低心血管疾病發(fā)生和致死率重要舉措之一[25-27]。和中劑量組相比，高劑量組的脂質(zhì)水平、血液流變學(xué)數(shù)據(jù)與低劑量組接近，但主動(dòng)脈弓形態(tài)變化卻與之相反；其原因可能是其LDL-C/HDL-C值更接近與低劑量組的值(低劑量組為0.759，中劑量組為0.506，高劑量組為0.694)和LDL-C值較高(低劑量組為1.01，中劑量組為0.90，高劑量組為1.27)。雞血藤有很好地預(yù)防因高脂誘導(dǎo)的肌肉即運(yùn)動(dòng)功能的損害，這應(yīng)該是雞血藤即具有養(yǎng)血和活血藥效所致。在預(yù)防AS藥效中雞血藤弱于血脂康但在預(yù)防少肌癥方面藥效略強(qiáng)這可能與雞血藤除具活血通經(jīng)作用外還具有養(yǎng)血功效，而血脂康善于活血祛瘀、健脾祛痰而無(wú)補(bǔ)氣養(yǎng)血藥效相關(guān)。

血液中一個(gè)代謝物的表達(dá)常被多個(gè)蛋白質(zhì)支配主導(dǎo)，換句話(huà)說(shuō)產(chǎn)生于其他器官和組織中的蛋白質(zhì)會(huì)自動(dòng)地補(bǔ)償某個(gè)或某些異常蛋白質(zhì)功能，因此本文中網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)被用來(lái)進(jìn)一步闡述代謝組學(xué)研究的結(jié)果。此外，可以研究與AS密切相關(guān)的器官如肝、血管等代謝組學(xué)，進(jìn)一步揭示和證實(shí)其作用機(jī)制。此外，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)并通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證表明研究發(fā)現(xiàn)luteolin、 aloe-emodin、Formononetin、vestitol、naringenin是雞血藤作用于A(yíng)S的藥效物質(zhì)， MAPK14、TP53、CASP3、JUN、MMP9和IL6是雞血藤作用于A(yíng)S的藥效靶點(diǎn)。當(dāng)然，這些藥效物質(zhì)是否存在協(xié)同作用及如何協(xié)同，是否存在更多的藥效物質(zhì)還需要進(jìn)一步開(kāi)展實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，從而為雞血藤質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升、提高臨床用藥指導(dǎo)提供更為科學(xué)、可靠的依據(jù)。