重組酶介導(dǎo)的油菜莖基潰瘍病菌熒光核酸擴(kuò)增檢測(cè)體系的建立

陳吳健，張巧琦，魏曉潔，朱青青，郭利川，應(yīng)清界，梅高甫，曹棟棟*

(1.杭州海關(guān)技術(shù)中心，浙江 杭州 310016；2.江蘇奇天基因生物科技有限公司，江蘇 無錫 214000；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所 浙江省數(shù)字旱糧重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021)

油菜莖基潰瘍病是油菜上最嚴(yán)重的真菌病害之一，油菜莖基潰瘍病菌(Leptosphaeriamaculans)是全世界油菜產(chǎn)區(qū)廣泛分布的一種危害嚴(yán)重的病原菌，屬真菌界(Fungi)，子囊菌門(Ascomycota)，座囊菌綱(Dothideomycetes)，格孢腔菌目(Pleosporales)，格孢腔菌科(Pleosporaceae)，小球腔菌屬(Leptosphaeria)。油菜莖基潰瘍病菌不僅侵染油菜，還危害白菜、甘藍(lán)和芥菜等近30種十字花科植物，引起莖基潰瘍、植株倒伏和死亡。據(jù)估計(jì)，全世界每年因油菜莖基潰瘍病菌所造成的油菜籽經(jīng)濟(jì)損失超過3億歐元[1-2]。目前該病菌在我國尚未發(fā)現(xiàn)，但它可以通過病殘?bào)w，特別是被侵染的種子等進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播；近年來我國進(jìn)口油菜籽主要來源于加拿大、澳大利亞，而我國油菜產(chǎn)區(qū)氣候與歐、美、澳三大洲相似，目前的油菜主要栽培品種高度感病[1]。因此，加強(qiáng)口岸檢疫和監(jiān)管控制是控制該病菌傳入我國的重要手段，是當(dāng)前我國各口岸植物檢疫部門的緊迫任務(wù)[3]，亟需建立一種高效快速檢測(cè)體系來預(yù)防油菜莖基潰瘍病傳入我國。

核酸擴(kuò)增技術(shù)(recombinase aided amplification，RAA)是一種近年來新出現(xiàn)的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)[4]，使用從細(xì)菌或真菌中獲得的重組酶，在37 ℃恒溫下與引物緊密結(jié)合，形成酶和引物的聚合體，當(dāng)模板DNA上搜索到與引物DNA完全互補(bǔ)的序列時(shí)，在單鏈DNA結(jié)合蛋白的共同作用下，使模板DNA解鏈，并在DNA聚合酶的作用下，合成新的DNA互補(bǔ)鏈。反應(yīng)產(chǎn)物以指數(shù)級(jí)增長，一般在15～30 min內(nèi)即能得到可以用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到的擴(kuò)增片段。整個(gè)反應(yīng)簡單快速，不需要高溫循環(huán)，常溫下即可完成所有的反應(yīng)步驟，當(dāng)室溫低于25 ℃時(shí)，只需增加一臺(tái)水浴設(shè)備，所以非常適合在有大量樣品的非實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)場(chǎng)景使用。目前RAA技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在食源性微生物檢測(cè)[4-5]、寄生蟲檢測(cè)[6]、病毒檢測(cè)[7]等方面，本研究建立了一種應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光RAA法檢測(cè)油菜莖基潰瘍病菌的方法，對(duì)進(jìn)境口岸快速檢測(cè)鑒定十字花科種子中攜帶的油菜莖基潰瘍病菌具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究以油菜上常見的病害及其近似菌株為監(jiān)測(cè)對(duì)象，菌株均為杭州海關(guān)技術(shù)中心植檢實(shí)驗(yàn)室分離鑒定(表1)。

表1 供試菌株信息

1.2 序列合成

通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，獲得LMR1-D基因堿基序列，并進(jìn)行多序列比對(duì)，從中選出一段352 bp的保守序列(5′-3′)：TACGCGTAAGAA GCGTGCCTTAGAGTCTATAGGGAGCCGCCTAGGTTG CCCTAACCTAGAATCTATAAGGGGAACCTTAGAGG AGCTAGAGTCCTTATCTTCTAATAAGGAGCTCTAGG CGCCCTTAGCTATAGTATTAGCCTTGCGCGTAAGCT TAGCAGCAGTAGTAGTACCTTTTACTAGCTCCTACT ATTTAGCCTTGCTCTCCTTAAGGAGCACTAAGACCC TCTGCTTCTTATCCTTAAGAAGGTCTTAGCTCTTAC CTGCCTACTTCCTTGCTAGGAAGGATAGCGTAGAAT ATTAGGCAAGCTTAGGGCTATTAGTTTGTTAGTATA GATCTTACTAAGCGTTA。將該序列委托上海生工生物工程有限公司合成，載體Puc57，克隆位點(diǎn)SmaI，宿主菌為DH5α，抗性氨芐。

1.3 特異性引物、探針的設(shè)計(jì)

以LMR1-D基因序列為模板，根據(jù)RAA方法的引物及探針設(shè)計(jì)要求進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

1.4 主要設(shè)備和試劑

質(zhì)粒提取試劑盒(天根)；恒溫核酸擴(kuò)增檢測(cè)儀(RAA-F1620，江蘇奇天基因生物科技有限公司)；球磨儀(萊馳MM400)；恒溫振蕩混勻儀(RAA-B6100，江蘇奇天基因生物科技有限公司)；核酸提取試劑盒(天根)；RAA核酸擴(kuò)增試劑盒(江蘇奇天基因生物科技有限公司)；RAA核酸擴(kuò)增試劑盒(江蘇奇天基因生物科技有限公司)；引物和探針(上海生工生物工程有限公司合成)。

1.5 RAA反應(yīng)體系和條件

按RAA核酸擴(kuò)增試劑盒使用說明進(jìn)行反應(yīng)體系的配制，總體積為50 μL，其中反應(yīng)緩沖液25 μL，超純水16.7 μL，10 mmol·L-1正向引物2.1 μL，10 mmol·L-1反向引物2.1 μL，10 mmol·L-1探針0.6 μL，DNA模板1 μL(陰性對(duì)照為水)，充分混合；將混好的緩沖液加到RAA反應(yīng)單元凍干粉中，使之溶解均勻，瞬時(shí)離心；將2.5 μL 280 mmol·L-1醋酸鎂溶液加入到干粉管管蓋上，放入到恒溫振蕩混勻儀(RAA-B6100)，設(shè)置溫度為39 ℃，按短振鍵，結(jié)束后放入恒溫核酸擴(kuò)增檢測(cè)儀(RAA-F1620)中，設(shè)置溫度為39 ℃，反應(yīng)20 min。

1.6 菌株和樣品DNA的提取

用PDA平板培養(yǎng)供試菌株，3 d后刮取菌絲加液氮研磨后，稱取0.1～0.2 g，用核酸提取試劑盒提取DNA。油菜籽用球磨儀充分粉碎，稱取0.1～0.2 g，用核酸提取試劑盒提取DNA。

1.7 特異性驗(yàn)證

在8個(gè)反應(yīng)體系中分別加入1 μL陰性質(zhì)控品、油菜莖基潰瘍病菌、油菜黑脛病菌、蕓苔鏈格孢、鏈格孢、富氏葡萄孢盤菌、蕓苔生尾孢、葡萄莖枯病菌、核盤菌的DNA各1 μL為模板，充分混勻，每管總體積為50 μL，按照RAA熒光擴(kuò)增體系檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.8 靈敏度的確定

將5 μL 1.0×1010拷貝·mL-1油菜莖基潰瘍病菌DNA質(zhì)粒10倍梯度分別稀釋成1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101拷貝·mL-14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品；在5個(gè)反應(yīng)體系中分別加入1 μL陰性質(zhì)控品、4個(gè)梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品為模板，充分混勻，每管總體積為50 μL，按照RAA熒光擴(kuò)增體系檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.9 油菜籽樣品的檢測(cè)

在8個(gè)反應(yīng)體系中分別加入1 μL陰性對(duì)照、2份澳大利亞油菜籽、2份加拿大油菜籽(經(jīng)過實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)為陽性)、2份經(jīng)檢測(cè)為陰性的本地青菜籽和青花菜籽的DNA各1 μL為模板，充分混勻，每管總體積為50 μL；按照RAA熒光擴(kuò)增體系檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物和探針

探針和引物的序列設(shè)計(jì)如表2。

2.2 方法特異性檢測(cè)

用表1中的菌株DNA對(duì)方法進(jìn)行特異性檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。只有油菜莖基潰瘍病菌樣本DNA出現(xiàn)明顯擴(kuò)增信號(hào)，其他樣本及陰性對(duì)照均未檢測(cè)到擴(kuò)增。表明本方法具有良好的特異性，可以區(qū)分油菜莖基潰瘍病菌與其近似種和油菜上常見的病害。

表2 根據(jù)LMR1-D基因保守序列設(shè)計(jì)的引物和探針

圖1 RAA檢測(cè)方法特異性驗(yàn)證結(jié)果

2.3 靈敏度驗(yàn)證

用實(shí)時(shí)熒光RAA檢測(cè)油菜莖基潰瘍病菌DNA質(zhì)粒制成10倍梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，如圖2所示，最快1 min就可見明顯擴(kuò)增信號(hào)，10 min內(nèi)所有標(biāo)準(zhǔn)樣品均有擴(kuò)增。以熒光增加量為熒光起始量的30%為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，可以判定該檢測(cè)方法的檢測(cè)底限可以達(dá)到1.0×101拷貝·mL-1。

圖2 RAA檢測(cè)方法靈敏度檢測(cè)

2.4 油菜籽樣品的檢測(cè)

實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，陽性對(duì)照和加拿大、澳大利亞油菜籽出現(xiàn)明顯的陽性擴(kuò)增曲線，本地青菜籽、青花菜籽和陰性對(duì)照均無擴(kuò)增信號(hào)，說明該方法不但可以用于監(jiān)測(cè)油菜莖基潰瘍病菌，也可以用于檢測(cè)進(jìn)出境油菜及其產(chǎn)品中是否攜帶油菜莖基潰瘍病菌，而且靈敏度、精確度可以與實(shí)時(shí)熒光PCR相當(dāng)(圖3)。

圖3 油菜籽樣品檢測(cè)結(jié)果

3 討論

油菜是我國種植面積第一的油料作物，自2002年以來一直維持在667 萬hm2左右，產(chǎn)量達(dá)1 000萬～1 300萬t。油菜莖基潰瘍病是油菜上最嚴(yán)重的真菌病害之一，病原菌主要有油菜黑脛病菌和油菜莖基潰瘍病菌，二者的形態(tài)特征相近，但引起油菜莖部感染和基部潰瘍的能力不同。油菜黑脛病菌致病力較弱，一般引起莖中上部為害，造成的損失小，在包括我國在內(nèi)的一些油菜生產(chǎn)國均有分布[8]。油菜莖基潰瘍病菌致病力強(qiáng)，引起莖基部發(fā)病，是導(dǎo)致油菜黑脛病嚴(yán)重流行和油菜產(chǎn)量損失的主要因素，在加拿大、澳大利亞、美國、歐洲等油菜主產(chǎn)國均有分布，而在我國未見報(bào)道[8]。1975—1995年，油菜莖基潰瘍病菌在加拿大大面積擴(kuò)散開來，并從美國傳入墨西哥，接著向東擴(kuò)散，蔓延至大部分歐洲國家[8-10]。因此，隨著國際貿(mào)易的發(fā)展，帶菌的油菜籽以及病殘?bào)w可能隨著大宗的油菜籽進(jìn)口而進(jìn)入中國，一旦傳入我國，將對(duì)我國油菜產(chǎn)業(yè)造成巨大損失。

由于國內(nèi)油菜籽榨油業(yè)產(chǎn)能的擴(kuò)張迅速，我國油菜籽產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足加工需求，且國外價(jià)格較低的油菜籽更加刺激了油菜籽進(jìn)口。據(jù)進(jìn)出口數(shù)據(jù)顯示，2021年我國油菜籽進(jìn)口數(shù)量為264.64萬t，主要來自加拿大、澳大利亞；因此，油菜莖基潰瘍病菌傳入我國的風(fēng)險(xiǎn)日益增大。上海、廈門以及浙江的多個(gè)口岸曾多次從加拿大、澳大利亞進(jìn)口的油菜籽、青菜籽中截獲到油菜莖基潰瘍病菌[11-13]。為了保護(hù)我國油菜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，2007年我國將油菜莖基潰瘍病菌列入《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》，用檢疫手段嚴(yán)防其傳入。

目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)油菜莖基潰瘍病菌的技術(shù)主要包括傳統(tǒng)方法，如分離培養(yǎng)法[11]；分子生物學(xué)方法，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法[13-15]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)法[12,16]等。分離培養(yǎng)法周期較長，操作繁瑣，較難滿足當(dāng)前快速通關(guān)的要求；PCR技術(shù)具有快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，是目前我國口岸篩檢油菜莖基潰瘍病菌的重要手段之一[2]，但需昂貴儀器，裝備精良的實(shí)驗(yàn)室和專業(yè)的操作人員；LAMP法所需儀器設(shè)備簡單，等溫靈敏、特異性強(qiáng)、操作簡單且易于觀察結(jié)果，但是LAMP技術(shù)要求多對(duì)引物且對(duì)靶基因的要求較高。

本研究建立了油菜莖基潰瘍病菌的實(shí)時(shí)熒光重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增檢測(cè)方法，克服了以上的缺點(diǎn)，并通過樣品的驗(yàn)證表明，該方法方便快捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)，能夠檢測(cè)到1.0×101拷貝·mL-1的DNA，整個(gè)檢測(cè)過程為5～20 min，能夠滿足進(jìn)出境十字花科種子及其產(chǎn)品快速通關(guān)的要求。