西蘭花浙青80的高效制種與純度鑒定技術(shù)

王建升，沈鈺森，虞慧芳，盛小光，趙輝，黃志勇，馬存發(fā)，武婷，顧宏輝*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021；2.浙江美之奧種業(yè)股份有限公司，浙江 嘉興 314000)

西蘭花是十字花科蕓薹屬甘藍(lán)類蔬菜，因花球中含有多種芥子油苷組分，特別是蘿卜硫苷而備受關(guān)注[1]。我國(guó)是世界上最大的西蘭花生產(chǎn)國(guó)、出口國(guó)和消費(fèi)國(guó)，種植面積超過8.71 萬hm2[2]。長(zhǎng)期以來，日本、美國(guó)等國(guó)外公司品種壟斷國(guó)內(nèi)西蘭花市場(chǎng)，西蘭花種業(yè)“卡脖子”問題嚴(yán)峻。2018年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部啟動(dòng)了西蘭花國(guó)家良種重大科研聯(lián)合攻關(guān)項(xiàng)目[3]。2022年1月根據(jù)國(guó)家西蘭花良種攻關(guān)組統(tǒng)計(jì)，國(guó)內(nèi)品種市場(chǎng)占有率已從原來的10%提高到25%左右。國(guó)內(nèi)科研單位和種業(yè)公司聯(lián)合攻關(guān)，育成了一系列具有進(jìn)口替代潛力的品種[2,4]。然而，在西蘭花制種過程中，普遍存在制種產(chǎn)量低、成本高等問題，國(guó)產(chǎn)西蘭花品種產(chǎn)量難以滿足市場(chǎng)需求。

目前，國(guó)內(nèi)外西蘭花商品種主要采用Ogura不育源的雄性不育系制種，不育率可以達(dá)到100%[2]，但是仍然存在串粉、機(jī)械混雜、親本混有雜株等問題，從而影響雜交種純度。目前分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于作物種子的純度鑒定，其中KASP標(biāo)記技術(shù)是由英國(guó) LGC公司開發(fā)的新一代高通量自動(dòng)化 SNP檢測(cè)技術(shù)，具有共顯性,顯示 DNA 序列差異，易實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)整合共享、通量高、單位點(diǎn)檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為國(guó)際上SNP分型以及插入缺失變異檢測(cè)的主要方法之一，并在水稻等作物中已得到了大量應(yīng)用[5-6]。

浙青80(浙認(rèn)蔬2019001)是浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所于2019年育成的西蘭花新品種[7]，具有花球高圓、蕾粒勻細(xì)、低溫不易發(fā)紫等優(yōu)點(diǎn)，花球商品性好，已連續(xù)2年被浙江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳推介為農(nóng)業(yè)主導(dǎo)品種，可替代進(jìn)口的中晚熟品種。為滿足市場(chǎng)需求，加快西蘭花國(guó)產(chǎn)化進(jìn)程，本研究在先前制種經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)浙青80父母本的特征特性，開展了浙青80的播種期、父母本比例、疏球整枝等大棚制種技術(shù)研究，實(shí)現(xiàn)了我國(guó)西蘭花雄性不育系雜交制種產(chǎn)量的歷史突破；同時(shí)，建立了浙青80高通量、低成本的KASP分子標(biāo)記純度鑒定技術(shù)，為我國(guó)西蘭花雜交制種和種子純度快速鑒定提供了重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所育成的浙青80的父母本為材料，母本為Ougra雄性不育系，父本為雙單倍體材料，本試驗(yàn)于 2020—2021年在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院楊渡基地進(jìn)行。

1.2 制種方法

1.2.1 主要栽培管理

試驗(yàn)大棚長(zhǎng)40 m，寬8 m，共5畦，每畦定植2行，株距45 cm，行距約50 cm。疏球整枝前的肥水管理、病蟲害防治、移栽條件等方法參考先前西蘭花栽培技術(shù)[8]，疏球整枝后施45%復(fù)合肥一次，每個(gè)大棚約10 kg，并化學(xué)防治病蟲害。花期采用熊蜂授粉，每個(gè)大棚2箱，每箱約100只。授粉結(jié)束后，及時(shí)清理病殘枝葉、化學(xué)防治病蟲。

1.2.2 播種期試驗(yàn)

花期父母本同時(shí)播種，播種期為8月15日(播種期1)、8月25日(播種期2)和9月5日3個(gè)播種期(播種期3)。

1.2.3 種植比例試驗(yàn)

根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn)報(bào)道[9]，本試驗(yàn)中選擇2個(gè)父母本比例，父母本種植比例2∶3(比例1)，父母本比例為1∶4(比例2)。

1.2.4 疏球整枝方式試驗(yàn)

由于母本側(cè)枝極少，選擇對(duì)主花球采用2種疏球整枝方式，疏球整枝方式為保留1個(gè)小球(疏球1)或兩個(gè)小球(疏球2)。

1.2.5 性狀測(cè)量與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)處理隨機(jī)選取10株，考察單株枝條數(shù)、單株角果數(shù)、每角果粒數(shù)(統(tǒng)計(jì)10個(gè)枝條)和大棚實(shí)際產(chǎn)量，種子完全收獲后測(cè)定千粒重。用 Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，并通過SPSS16.0軟件進(jìn)行方差分析和多重比較(ANOVAP<0.05,Duncan’s test)。

1.3 雜交種KASP標(biāo)記開發(fā)與純度鑒定

1.3.1 KASP標(biāo)記開發(fā)

根據(jù)先前西蘭花指紋圖譜庫(kù)數(shù)據(jù)中的100個(gè)SNP位點(diǎn)[10]，我們篩選出浙青80父母本的3個(gè)特異SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了特異的KASP引物(表1)。

1.3.2 雜交種子純度鑒定

種子發(fā)芽10 d以后即可提取待測(cè)浙青80的基因組DNA，以提取的DNA為模板，加入特異的引物混合液和通用的KASP預(yù)混合液(通用的FRET cassette熒光引物，ROX內(nèi)參染料，Klear Taq DNA聚合酶，dNTP和MgCl2)，PCR的反應(yīng)體系為：KASP預(yù)混合液5 μL;引物混合液0.14 μL；其中各引物的終濃度均為5 nmol·L-1；20 ng·μL-1模板DNA 5 μL；采用PCR的反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性20 s，61～55 ℃退火延伸60 s，每個(gè)循環(huán)的退火溫度降低0.6 ℃，共10個(gè)循環(huán)；94 ℃變性20 s，55 ℃退火延伸60 s，共26個(gè)循環(huán)。最后采用熒光檢測(cè)儀分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

表1 用于檢測(cè)3個(gè)SNP位點(diǎn)的KASP引物信息及檢測(cè)基因型

每個(gè)大棚隨機(jī)取89株，并加入2株父本，2株母本，2個(gè)對(duì)照品種(炎秀、綠雄90)和水為陰性對(duì)照，根據(jù)基因分型結(jié)果(圖1)，判定待測(cè)樣本為親本、雜交種或異型株。統(tǒng)計(jì)親本、雜交種和異型株的數(shù)目，計(jì)算浙青80的種子純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對(duì)制種產(chǎn)量及產(chǎn)量性狀的影響

播種期在8月25日、父母本比例為1∶4、疏球方式為2時(shí)，折合制種每667 m2產(chǎn)量最高為50.67 kg。實(shí)際最高制種每667 m2產(chǎn)量為33.35 kg，其播種期也是在8月25日，并采用疏球2方式整枝，父母本比例為2∶3(表2)。

單株枝條數(shù)分析結(jié)果表明，采用播種期2、父母本比例2、疏球2組合方式時(shí)母本的單株枝條數(shù)最多，達(dá)到83.36個(gè)。播種期和父母本比例相同條件下，疏球2的單株枝條數(shù)顯著高于疏球1數(shù)量，這表明疏球方式對(duì)單株枝條數(shù)的多少有重要的作用，而且與播種期和比例無關(guān)。播種期和疏球方式相同條件下，比例1和比例2之間的單株枝條數(shù)差異不顯著，表明父母本比例對(duì)單株枝條數(shù)沒有顯著影響。疏球方式和父母本比例相同條件下，疏球2、父母本比例1方式下的單株枝條數(shù)為播種期2顯著高于播種期3，但播種期1和播種期3無顯著差異；疏球1、父母本比例2方式下的3個(gè)播種期之間均存在顯著差異；疏球2、父母本比例2方式下的播種期2均顯著高于播種期1和播種期3，這表明播種期對(duì)單株枝條數(shù)的多少有影響，而且這種影響與疏球方式和父母本比例有關(guān)。

單株角果數(shù)分析結(jié)果表明，播種期2、父母本比例1、疏球2時(shí)最多，播種期2、父母本比例2、疏球2次之。播種期和父母本比例相同條件下，疏球2較疏球1方式的單株角果數(shù)更多，除了播種期1、父母本比例2組合種植管理方式下2種疏球方式的單株角果數(shù)沒有顯著差異，其他條件的2種疏球方式均存在顯著差異，這表明多數(shù)情況下，疏球2相對(duì)疏球1能夠提高單株角果數(shù)。播種期和疏球方式相同條件下，只有播種期2、疏球2組合方式種植比例1與比例2的單株角果數(shù)存在顯著差異，其他比例1和比例2的單株角果數(shù)均沒有顯著差異。而比例和疏球方式相同條件下，播種期2的單株角果數(shù)最多，但只有播種期2、疏球2、父母本比例1和播種期2、疏球2、父母本比例2顯著高于播種期1和播種期3的單株角果數(shù)，這表明播種期對(duì)單株角果數(shù)的影響受限于特定疏球方式，但與父母本比例無關(guān)。

表2 播種期、父母本比例、疏球整枝方式對(duì)浙青80制種產(chǎn)量及產(chǎn)量相關(guān)性狀的影響

每角果粒數(shù)和千粒重的分析結(jié)果表明，每角果粒數(shù)和千粒重在不同方法之間均沒有顯著差異，暗示當(dāng)前的制種方式?jīng)]有影響每角果粒數(shù)和千粒重，也不是造成產(chǎn)量差異的主要因素。

2.2 純度檢測(cè)結(jié)果

收獲的浙青80雜交種與親本以及3個(gè)陰性對(duì)照利用SNP8 001、SNP8 002和SNP8 003 SNP標(biāo)記進(jìn)行KASP基因分型檢測(cè)。結(jié)果表明，雜交種的基因分型結(jié)果分別為GA、CG、CT，父本分別為GG、CC和CC，母本分別為AA、GG和TT(圖1)，不同大棚中的雜交種純度均為100%。

A—引物SNP8 001；B—引物SNP8 002；C—SNP8 003；左上角小圓圈為加入的父本樣品，右下角小圓圈為母本樣品，中間小圓圈為雜交種，左下角灰色、黑色小圓圈為水和對(duì)照樣品。圖1 浙青80雜交種KASP基因分型結(jié)果

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)外西蘭花制種主要采用Ogura不育源的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系雜交制種方式，國(guó)內(nèi)商品種也以雄性不育雜交種為主[1,9,11-12]?？傮w來看，浙青80制種的適宜播種期在8月25日，采用主球保留2個(gè)小球的疏球方式，而父母本的比例可以采用2∶3，也可以1∶4，實(shí)際制種每667 m2產(chǎn)量分別達(dá)到33.35和31.02 kg。根據(jù)先前報(bào)道，自交不親和制種每667 m2產(chǎn)量在25.7～25.9 kg[11]，雄性不育制種產(chǎn)量在15～30 kg[1,9]，浙青80的制種產(chǎn)量明顯高于先前品種的產(chǎn)量，其原因可能是多方面的，主要包括遺傳因素、天氣(尤其是開花期間)、栽培方法、蜜蜂等，而浙青80是否能夠達(dá)到高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)還需要進(jìn)一步研究。

我們的研究表明，播種期是影響制種的關(guān)鍵因素，由于浙青80父本花期略早母本3～5 d，所以在制種時(shí)選擇同時(shí)播種，但是開花的時(shí)間和植株的發(fā)育會(huì)受到播種期的影響，提前播種會(huì)導(dǎo)致花期提前，我們推測(cè)由于開花前期溫度低，不適宜蜜蜂活動(dòng)和授粉受精，從而導(dǎo)致制種產(chǎn)量偏低；播種延后則植株長(zhǎng)勢(shì)偏弱小，枝條數(shù)偏少且花期短，最終也會(huì)影響制種的產(chǎn)量。

父母本比例也是西蘭花制種中的重要因素，由于西蘭花采用的是雄性不育制種，雜交種由母本上收獲，適當(dāng)增加母本的量是常用的措施，先前檀國(guó)印等[9]對(duì)臺(tái)綠1號(hào)的父母本制種比例為1∶2或1∶1。由于浙青80父本花期長(zhǎng)、花粉量大，我們采用了2∶3和1∶4比例進(jìn)行試驗(yàn)，單從最適播種期且采用疏球2方式來看，比例對(duì)枝條數(shù)沒有顯著影響，但對(duì)角果數(shù)有影響，所以盡管采用1∶4的父母本比例增加了母本的植株數(shù)量，但并沒有增加產(chǎn)量，推測(cè)可能是父本量減少，導(dǎo)致花粉量不足，因此，最終單株角果數(shù)顯著降低。但從最終產(chǎn)量來看，2種比例對(duì)浙青80制種產(chǎn)量的影響不大。

花球高圓緊實(shí)是近年來西蘭花育種的主要目標(biāo)之一[7]，其制種親本往往也多表現(xiàn)高花球圓緊實(shí)，然而高圓緊實(shí)型的花球常表現(xiàn)抽薹短或者細(xì)，開花和角果的數(shù)量少，西蘭花疏球整枝是促進(jìn)抽枝、增加枝條數(shù)量和質(zhì)量的常用手段[9,11]。由于浙青80母本側(cè)枝極少，因此，不適合割除整個(gè)主球保留側(cè)枝的方式制種，我們選擇了保留主球的2個(gè)小花球和1個(gè)小花球2種疏球方式，保留2個(gè)小花球的枝條數(shù)、角果數(shù)、產(chǎn)量均高于保留1個(gè)小花球。

基于前期具有代表性的西蘭花材料的指紋圖譜數(shù)據(jù)[10]，利用高通量的KASP基因分型平臺(tái)，對(duì)100個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行篩選，根據(jù)多態(tài)性指數(shù)、最小等位基因頻率、基因分型的質(zhì)量、結(jié)果的重復(fù)性等指標(biāo)，篩選出適用于浙青80種子純度鑒定的3個(gè)SNP位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)出用于檢測(cè)SNP位點(diǎn)的共9條引物序列。利用這9條引物序列，有效區(qū)分了親本和對(duì)照材料，實(shí)現(xiàn)了種子純度和種子真?zhèn)蔚耐瑫r(shí)鑒別，而且后期田間的表型鑒定也驗(yàn)證了其可靠性。本研究中KASP檢測(cè)方法采用的是96孔板可視化檢測(cè)，具有檢測(cè)通量高、成本低的特點(diǎn)。

國(guó)內(nèi)育種單位育成品種各有其特征，我們認(rèn)為西蘭花制種中需要根據(jù)父母本的特征特性制定合適的制種方案，包括播種期、疏球整枝方式、父母本比例、種植密度等。另外，未來西蘭花育種時(shí)也要將雜交親和性作為一項(xiàng)重要指標(biāo)，從而為制種奠定良好的遺傳基礎(chǔ)。