黔產(chǎn)太子參中多糖含量測(cè)定*

孫恒燦，張麗艷，馬四補(bǔ)，晉海軍，唐曉琴，董 賀，李 軍

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

0 引言

太子參是石竹科植物孩兒參[Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.]的干燥塊根，具有益氣健脾、生津潤肺的功效[1]。太子參為多年生草本植物，適宜生長在溫暖濕潤的環(huán)境，于砂質(zhì)土壤中生長良好，主要栽培地有貴州、福建、安徽、山東等，其中山東是太子參傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)之一[2]。經(jīng)現(xiàn)代研究表明，多糖是太子參主要化學(xué)成分之一，其具有抗炎[3]、抗糖尿病[4]、抗應(yīng)激[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]和保護(hù)心肌[7]等多方面的藥理作用。

近年來，我國經(jīng)濟(jì)蓬勃發(fā)展，國民生活水平穩(wěn)步提升，養(yǎng)生保健被高度重視。自太子參被國家批準(zhǔn)列入可用于保健食品以來，其保健食用功能的適用性已在不斷的研究應(yīng)用中得到社會(huì)人群的廣泛認(rèn)可，市場(chǎng)需求量也與日俱增[8]。目前，近幾版《中國藥典》中太子參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有水分、灰分和浸出物檢查標(biāo)準(zhǔn)，并沒有反應(yīng)太子參質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉和苯酚-硫酸顯色法，用紫外-可見分光光度儀測(cè)定太子參中多糖含量，旨在為太子參藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供一定的參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

UV-2501PC紫外分光光度儀(日本島津公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市三和儀器有限公司)；ST-16R高速冷凍離心機(jī)(賽默飛公司)；電子天平(瑞士梅特公司)。

無水乙醇(分析純，批號(hào)：20211101)、苯酚(分析純：20190801)、濃硫酸(分析純，批號(hào)：20210701)；純水；葡萄糖對(duì)照品(批號(hào)：20200110)，15批黔產(chǎn)太子參來源見表1。

表1 太子參藥材來源Tab.1 Sources of Pseudostellariae radix

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

取恒重后葡萄糖對(duì)照品10 mg，精密稱定，加水制成每1 mL中含0.1 mg的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

取本品粉末0.8 g(過三號(hào)篩)，精密稱定，加水200 mL，加熱回流2小時(shí)，放冷，轉(zhuǎn)移至250 mL量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液2 mL，置15 mL離心管中，精密加入無水乙醇10 mL，搖勻，冷藏1小時(shí)，取出，離心(轉(zhuǎn)速為每分鐘4000轉(zhuǎn))20分鐘，棄去上清液，沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次8 mL，離心，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，放至室溫，加水至刻度，搖勻。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察

精密量取對(duì)照品溶液0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL，分別置10 mL具塞試管中，各加水至1.0 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL(臨用配制)，搖勻，再精密加濃硫酸5 mL，搖勻，置沸水浴中加熱20分鐘，取出，置冰浴中冷卻5分鐘，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(通則0401)，在488 nm的波長處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，可得回歸方程為：y=8.8376x+0.0041(n=7)，r2=0.9997。表明葡糖糖濃度在0.02～0.08 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表2。

2.2.2 精密度試驗(yàn)

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5 mL，加水至1 mL，照“2.2.1”方法進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)6次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，RSD為0.2%，表明儀器精密度較好。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Precision test results

2.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液1 mL，照“2.2.1”方法分別在0 min，30 min，60 min，90 min，120 min，150 min測(cè)定其吸光度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，RSD為2.01%，確定150 min內(nèi)供試品溶液較穩(wěn)定。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Stability test results

2.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取本品6份，按照“2.1.2”方法制備待測(cè)液，按照“2.2.1”方法測(cè)定吸光度值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。結(jié)果表明，6份樣品多糖含量均值為22.18%，RSD為2.37%，重復(fù)性良好。

表5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Repeatability test results

2.2.5 加樣回收實(shí)驗(yàn)

取本品粉末0.4 g(過三號(hào)篩)和對(duì)照品0.09 g，精密稱定，后續(xù)方法同“2.1.2”和“2.2.1”。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6，結(jié)果表明，回收率均值為97.27%，RSD為1.36%，方法較好。

表6 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Spiked recovery test results

2.3 多批次太子參藥材中多糖含量測(cè)定和計(jì)算

精密量取供試品溶液1 mL，置10 mL具塞試管中，加入5%苯酚溶液1.0 mL(臨用配制)，搖勻，再精密加入硫酸5.0 mL，搖勻，置沸水浴中加熱20 min，取出后置冰浴中冷卻5 min，以相應(yīng)試劑為樣品空白，依法測(cè)定吸光度，依標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品溶液中葡萄糖的濃度，按公式(1)計(jì)算樣品中多糖百分含量，結(jié)果見表7。

(1)

式中：A—測(cè)定用樣品溶液中的葡萄糖絕對(duì)含量(μg)；W—取樣量(g)。

表7 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.7 Content determination results of the samples

3 討論

多糖是太子參的主要有效成分之一，多糖含量的差異可能是太子參藥效參差不齊的原因[9]。目前，常用提取多糖的方法有水提醇沉法、超聲波(輔助)提取和超高壓技術(shù)提取等，其中水提醇沉法最為常用[10]。雖然超聲波和超高壓技術(shù)提取率高于水提醇沉法，但超聲波功率過高會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)、超高壓提取會(huì)影響蛋白質(zhì)和淀粉等大分子結(jié)構(gòu)，且兩種方法都需要特定的提取設(shè)備，提取成本較高[11-13]。查閱文獻(xiàn)可知，苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法是測(cè)定多糖含量的常用方法。楊勤等[14]采用兩種方法測(cè)定地參多糖含量，結(jié)果表明苯酚-硫酸法在穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性上均優(yōu)于蒽酮-硫酸法，苯酚-硫酸法測(cè)定地參多糖的含量更加準(zhǔn)確。朱佳敏[15]等亦采用兩種方法測(cè)定核桃青皮多糖含量，結(jié)果顯示苯酚硫酸法測(cè)定的多糖含量比蒽酮硫酸法高約50 mg/g。因此，本實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉法和苯酚-硫酸顯色法測(cè)定太子參中多糖的含量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，15批黔產(chǎn)太子參多糖含量存在較大差異，RSD則高達(dá)15.38%，多糖含量最高的是鎮(zhèn)遠(yuǎn)②，多糖含量為27.40%，多糖含量最低的是施秉牛大場(chǎng)②，多糖含量為16.96%。15批太子參樣品多糖含量范圍在16.96%～27.40%，平均值為20.43%。宋李桃等[16]測(cè)定了6個(gè)不同省份太子參多糖含量，結(jié)果顯示多糖含量范圍在8.54%～13.56%。羅忠圣等[17]研究顯示，貴陽市商品太子參多糖含量范圍在9.74%～18.43%。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得15批太子參多糖含量平均值是20.43%，高于文獻(xiàn)中報(bào)道的太子參多糖含量，產(chǎn)生這種差異的原因可能與貴州省特殊的地理環(huán)境、濕潤的氣候有關(guān)。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉和苯酚-硫酸顯色法，在488 nm處用紫外-可見分光光度法測(cè)定太子參中多糖的含量，此法提取時(shí)間短、操作簡單、重復(fù)性好，方法學(xué)考察均符合要求。表明本方法適用于太子參中多糖的含量測(cè)定，可為太子參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供參考。