新疆阿克蘇地區(qū)奶牛糞源大腸桿菌分型與耐藥性分析

江婉琳，徐雙軍，劉雨欣，平麗瑩，王 靜*，馬 勛*

(1.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.新疆阿克蘇地區(qū)畜牧技術(shù)推廣中心，新疆 阿克蘇 843000)

近年來(lái)的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，牛是大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)病攜菌率最高的動(dòng)物，牛糞便中的大腸桿菌可污染水源及土壤等。與人類(lèi)疾病相關(guān)的致病性大腸桿菌血清型存在于不少動(dòng)物的糞便中。CLERMONT等[1]研究發(fā)現(xiàn)，以PCR技術(shù)為基本，可使用大腸桿菌的不同遺傳發(fā)育標(biāo)記來(lái)快速的鑒定大腸桿菌系統(tǒng)發(fā)育群。多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing,MLST)可追蹤細(xì)菌克隆的演變方式及群體遺傳學(xué)和進(jìn)化分析。大腸桿菌是溫血?jiǎng)游镂锓N腸道中定植的共生細(xì)菌，由于可能經(jīng)常暴露在抗菌治療引起的選擇壓力下，極大地促進(jìn)了抗菌素耐藥菌的出現(xiàn)和抗菌素耐藥性的傳播[2]。同時(shí)，抗菌抗性細(xì)菌可通過(guò)食物鏈轉(zhuǎn)移到人類(lèi)，從而影響人類(lèi)健康[3]。多藥耐藥性菌株的增加可能歸因于大腸桿菌細(xì)菌染色體或質(zhì)粒上編碼抗生素耐藥性基因的積累，對(duì)其耐藥性的調(diào)查和研究就顯得至關(guān)重要[4]。

本試驗(yàn)擬從新疆阿克蘇地區(qū)規(guī)?；膛?chǎng)采集奶牛肛拭子，分離鑒定大腸桿菌，對(duì)分離株的致病性血清型、系統(tǒng)進(jìn)化群、多位點(diǎn)序列進(jìn)行分型，檢測(cè)其耐藥表型及耐藥基因型，為在臨床上抗生素的合理有效使用提供理論依據(jù)，同時(shí)，對(duì)公共環(huán)境衛(wèi)生的安全起一定的預(yù)警作用。

1 材料與方法

1.1 樣品采集2020年7月從新疆阿克蘇地區(qū)荷斯坦奶牛場(chǎng)育成奶牛場(chǎng)區(qū)內(nèi)使用無(wú)菌棉拭子采集肛拭子樣品101份，放入滅菌的5 mL離心管內(nèi)，做好標(biāo)記后將將樣品放入4℃冰盒保存，盡快轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)的分析。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑與儀器NB培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MCA)、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB)均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；致病性大腸桿菌血清型診斷試劑盒購(gòu)自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司；DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；2×Master Mix、DL2000 DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司；瓊脂糖購(gòu)自西班牙 Biowest公司；藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。Labcycler PCR儀(48230V)購(gòu)自廣州市粵行儀器有限公司；全自動(dòng)凝膠成像儀(GEIDOCXR)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(DYY-6B)購(gòu)自杭州雷琪實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.3 大腸桿菌分離鑒定

1.3.1大腸桿菌分離 將肛拭子樣品移入5 mL LB肉湯中，37℃搖床(220 r/min)增菌8～12 h。將增菌液接種于MCA瓊脂培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)18 h。挑選MCA平板上的紅色光滑菌落，接種于EMB平板上37℃培養(yǎng)18 h，選擇呈金屬光澤的單菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢，進(jìn)一步純化。

1.3.2分離株的生化鑒定和PCR鑒定 純化的分離菌株接種于腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管，同時(shí)根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]采用16S rRNA PCR選用特異性引物通過(guò)特異性擴(kuò)增的方式進(jìn)行菌種鑒定(引物序列見(jiàn)表1)。PCR反應(yīng)體系20 μL：DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，Premix溶液10 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃ 延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 大腸桿菌分型

1.4.1致病性大腸桿菌血清分型 采用玻片凝集試驗(yàn)并按照診斷血清試劑盒說(shuō)明書(shū)的標(biāo)注對(duì)大腸桿菌分離株進(jìn)行血清型鑒定。診斷血清試劑盒由腸致病性大腸桿菌(EPEC)診斷血清、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)診斷血清、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)診斷血清、腸出血性大腸桿菌(EHEC)診斷血清組成。

1.4.2系統(tǒng)進(jìn)化群 使用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取分離株DNA，根據(jù)CLERMONT等[6]報(bào)道的三重PCR方法，對(duì)chuA，yjaA和TspE4.C2基因同時(shí)進(jìn)行PCR檢測(cè)(引物序列見(jiàn)表1)，根據(jù)電泳圖譜確定大腸桿菌的系統(tǒng)進(jìn)化群分型。PCR反應(yīng)體系20 μL：DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，Premix溶液10 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見(jiàn)表1)，72℃ 延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

判定標(biāo)準(zhǔn)：三重PCR擴(kuò)增后不出現(xiàn)條帶或僅出現(xiàn)yjaA(211 bp)條帶的菌株屬于A群；只出現(xiàn)TSPE4.C2(152 bp)條帶的菌株屬B1群；同時(shí)出現(xiàn)chuA(279 bp)和yjaA(211 bp)2種條帶，或chuA(279 bp)、yjaA(211 bp)和TSPE4.C2(152 bp)條帶同時(shí)出現(xiàn)的菌株屬于B2群；擴(kuò)增出現(xiàn)chuA(279 bp)條帶或同時(shí)有chuA(279 bp)和TSPE4.C2(152 bp)條帶的菌株屬于D群[6]。

1.4.3MLST及聚類(lèi)分析 根據(jù)MLST網(wǎng)站(https://pubmlst.org/databases/)提供的用于大腸埃希菌MLST試驗(yàn)的7對(duì)管家基因(adk、fumC、gyrB、icdA、mdh、purA和recA)[7]作為目的基因進(jìn)行分型(引物序列見(jiàn)表1)。PCR反應(yīng)體系20 μL：DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，Premix溶液10 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見(jiàn)表1)，72℃ 延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收后送北京六合華大科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，序列在線提交至Sequence query-Escherichiatyping數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_escherichia_seqdef&page=sequenceQuery)，得到每個(gè)管家基因等位基因序列號(hào)，7個(gè)管家基因的等位基因序列號(hào)組成該菌株的等位基因譜；再將各菌株的等位基因譜提交至Pasteur數(shù)據(jù)庫(kù)(http://enterobase.warwick.ac.uk/species/ecoli/allele_st_search)，與數(shù)據(jù)庫(kù)里大腸桿菌的等位基因譜進(jìn)行比對(duì)得到該分離株相應(yīng)的ST型。

根據(jù)ST型之間有5個(gè)或5個(gè)以上管家基因序列號(hào)相同的歸為一群標(biāo)準(zhǔn)，用goeBURST程序(http://www.phyloviz.net/goeburst/)進(jìn)行分離株ST型聚類(lèi)分析[8]。

1.5 致病性大腸桿菌血清型分離株小鼠感染模型根據(jù)致病性大腸桿菌血清型鑒定結(jié)果，對(duì)8個(gè)不同致病性大腸桿菌血清型的菌株進(jìn)行動(dòng)物攻毒試驗(yàn)。取54只健康昆明系小鼠，體質(zhì)量20～25 g，雌雄各半，隨機(jī)分為9組，其中1組為生理鹽水對(duì)照組，其他8組為試驗(yàn)攻毒組，菌株在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)14～16 h，小鼠灌胃前禁水禁食，灌胃濃度為1×109CFU/mL，每只小鼠灌胃0.4 mL，對(duì)照組灌服等量生理鹽水，觀察72 h內(nèi)臨床癥狀。

1.6 大腸桿菌耐藥性分析

1.6.1藥敏試驗(yàn) 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法對(duì)101株大腸桿菌進(jìn)行耐藥性測(cè)定。用抑菌圈直徑來(lái)表示細(xì)菌對(duì)特定藥物的敏感程度，分別用敏感(S)、中度敏感(I)、耐藥(R)表示。

1.6.2耐藥基因的檢測(cè) 按照參考文獻(xiàn)[9]設(shè)計(jì)blaTEM、blaSHV、blaOXA、sul1、sul2、aac(3)-Ⅱ、cmlA、tetA、tetB、qnrB等針對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)、磺胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、氯霉素類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)和喹諾酮類(lèi)抗生素的24種耐藥基因的引物(引物序列見(jiàn)表1)，引物由北京睿博興科生物科技有限公司合成。

用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌株的基因組DNA，PCR反應(yīng)體系20 μL：DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，Premix溶液10 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見(jiàn)表1)，72℃ 延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌分離鑒定101份樣品經(jīng)過(guò)分離純化鑒定(圖1)，共分離到51株大腸桿菌，分離率為50.50%(51/101)。

M.DL2000 DNA Marker;1～7.隨機(jī)挑選的分離株

2.2 致病性大腸桿菌血清型51株大腸桿菌分離株中有32株檢測(cè)為致病性大腸桿菌血清型(表2)。檢出率最高的是EPEC，占33.33%(17/51)；其次是EIEC，占23.53%(12/51)；ETEC，占5.88%(3/51)；未發(fā)現(xiàn)EHEC。優(yōu)勢(shì)血清型為O125:K70(B15)，在致病性大腸桿菌血清型中占15.69%。

表2 大腸桿菌血清型鑒定結(jié)果

2.3 大腸桿菌分離株的系統(tǒng)進(jìn)化群根據(jù)三重PCR電泳圖譜，51株大腸桿菌分為B1群(35株)、A群(7株)和D群(7株)和B2(2株)群4種類(lèi)型(圖2，表3)。

M.DL2000 DNA Marker；1,2.chuA(279 bp)；3,4.yjaA(211 bp)；5,6.TspE4.C2(152 bp)；7.chuA(279 bp)和yjaA(211 bp)

2.4 MLST結(jié)果51株大腸桿菌分離株具有41種不同的ST型，其中24種可在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)獲得，占57.54%(24/41)；本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)新ST型(STn)17種，分別是STn-1～17，占41.46%(17/41)(表3)。41種ST型中，優(yōu)勢(shì)ST型為ST-154和ST1727，均占5.88%(3/51)；其次為ST278、ST2425、ST10、ST58、ST2035及ST1611，均占3.92%(2/51)；其他ST型均僅1株。

表3 大腸桿菌MLST、血清型和系統(tǒng)進(jìn)化群的多樣性分布

通過(guò)goeBURST程序?qū)?1株大腸桿菌分離株進(jìn)行ST聚類(lèi)分析，結(jié)果顯示51株分離株分成4個(gè)克隆群和19個(gè)單獨(dú)型，其中克隆1群包括3個(gè)ST型，占分離株的5.88%(3/51)；克隆2、3和4群均包括2個(gè)ST型，分別占分離株的7.84%(4/51),3.92%(2/51),5.88%(3/51)；其余ST型均為單獨(dú)型(Separate type)，占分離株的76.47%(39/51)(圖3)。

Group 1～4為4個(gè)克隆群

2.5 小鼠攻毒試驗(yàn)結(jié)果8個(gè)不同致病性大腸桿菌血清型的分離菌株接種小白鼠后，試驗(yàn)組小鼠背毛光亮、反應(yīng)靈敏，食欲正常，無(wú)明顯臨床癥狀，無(wú)死亡現(xiàn)象，與生理鹽水對(duì)照組相比沒(méi)有明顯差異。

2.6 藥敏試驗(yàn)51株大腸桿菌分離株耐藥率:對(duì)青霉素耐藥率達(dá)96%以上；對(duì)頭孢噻60%以上；對(duì)頭孢吡肟、頭孢西丁、慶大霉素、環(huán)丙沙星最為敏感?？傮w來(lái)看，51株大腸桿菌沒(méi)有出現(xiàn)對(duì)所有抗菌藥物完全耐藥的菌株，對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥最為普遍，而對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素有較高的敏感性。

2.6.1多重耐藥分析 51株大腸桿菌分離株對(duì)抗生素產(chǎn)生多重耐藥，占78.43%(40/51)；對(duì)2種抗生素耐藥的最多，占37.25%(19/51)；其次是對(duì)3種抗生素耐藥的，占13.73%(7/51)。

2.6.2耐藥基因的檢測(cè) 對(duì)51株大腸桿菌分離株進(jìn)行耐藥基因的檢測(cè)，結(jié)果顯示blaTEM、qnrS、oqxA、aac(6′)-Ib-cr、sul1、sul2及sul3 這7種耐藥基因檢出目的條帶，與預(yù)期大小吻合；blaSHV、qnrA、aac(3)-I、tetA、cmlA等17個(gè)基因未檢測(cè)出條帶(圖4)。blaTEM耐藥基因檢出率最高，為100%；其次為qnrS耐藥基因檢出率為25.49%；sul2耐藥基因檢出率為11.76%；其余耐藥基因的檢出率均低于10%；未檢測(cè)到blaSHV、qnrB、aac(3)-I、ant(2”)、tetA、tetB及cmlA等耐藥基因。

A.aac(6’)-Ib-cr;B.sul2；C.blaTEM;D.qnrS；E.oqxA；F.sul1；G.sul3。M.DL2000 DNA Marker；1～5.為部分大腸桿菌菌株

3 討論

3.1 大腸桿菌分離株分型本試驗(yàn)在新疆阿克蘇地區(qū)采集了101份肛拭子樣品，分離獲得大腸桿菌分離株51株，分離率為50.50%。該試驗(yàn)結(jié)果與楊斯琴等[10]對(duì)內(nèi)蒙古呼和浩特健康奶牛糞便樣品中大腸桿菌50%的檢出率相一致。51株大腸桿菌分離株中有32株檢測(cè)出致病性大腸桿菌血清型，檢出率最高的是EPEC血清型，其次是EIEC血清型和ETEC血清型。優(yōu)勢(shì)血清型為O125:K70(B15)。翟淑榮等[11]自腹瀉幼兒患者中檢出EPEC O125:K70(B15)，該菌常引起嬰幼兒頑固性腹瀉，部分菌株甚至能引起食物中毒的暴發(fā)流行。本試驗(yàn)對(duì)EPEC血清型(O125:K70(B15)、O86:K61(B7)、O142:K86(B)分離株)、EIEC血清型(O164:K?、O124:K72和O143:K?分離株)、(ETEC血清型O25:K19(L)、O15:K?分離株)共8個(gè)分離株進(jìn)行致病性大腸桿菌血清型菌株的小鼠致病試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)小鼠死亡，因此推測(cè)本研究中分離的菌株對(duì)小鼠致病性不強(qiáng)。51株大腸桿菌分離株有2株B2群和7株D群。研究發(fā)現(xiàn)，共生大腸桿菌A和B1群為條件致病菌；腸外大腸桿菌B2和D群，則可由環(huán)境入侵機(jī)體而致病。由此可知B2和D群大腸桿菌具有較強(qiáng)的致病性和適應(yīng)性[12]。本研究對(duì)B2群和D群大腸桿菌進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，B2群和D群優(yōu)勢(shì)血清型均為O164:K?，而O164:K？在臨床上常引起類(lèi)似痢疾的癥狀[13]，符合EIEC的典型致病特點(diǎn)。綜上，牛糞源大腸桿菌中存在致病性大腸桿菌，對(duì)環(huán)境存在潛在威脅。

系統(tǒng)進(jìn)化群結(jié)果顯示，51株大腸桿菌分離株，B1群大腸桿菌占68.63%，A群占13.73%。張星星等[14]自新疆7個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)(石河子、五家渠等)得到的健康犢牛肛拭子樣品大腸桿菌分離株，發(fā)現(xiàn)A群占44.2%，B1群占23.1%；而張星星等[14]和蘇戰(zhàn)強(qiáng)等[15]自新疆博樂(lè)犢牛腹瀉肛拭子和糞便樣品獲得的大腸桿菌分離株中A群占83.3%，未分離出B1群。以上研究結(jié)果與本試驗(yàn)不太一致，表明雖然B1群和A群均大多屬于共生型大腸桿菌[12,16]，但B1群較多存在于健康牛糞源大腸桿菌中，而A群則同時(shí)存在于健康牛及腹瀉牛中的可能性更大，有致病性風(fēng)險(xiǎn)。

不同地區(qū)的優(yōu)勢(shì)血清型、ST型均有所不同。本試驗(yàn)中51株大腸桿菌分離株優(yōu)勢(shì)血清型為O125:K70(B15)。本試驗(yàn)結(jié)果與其他地區(qū)報(bào)道的牛源大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)血清型不同，如山東泰安健康奶牛糞便中大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)血清型為O128:K67(B12)和O143:K？，南京地區(qū)犢牛腹瀉源糞便及病料(脾臟等)中大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型為 O15、O26、O36 和 O78，新疆呼圖壁、石河子及奎屯報(bào)道的犢牛腹瀉糞便中優(yōu)勢(shì)血清型為 O6、O78、O101 和 O114[5,17-18]。這些結(jié)果表明，同一個(gè)地區(qū)牛源大腸桿菌存在多種血清型，且多數(shù)地方有本地的優(yōu)勢(shì)血清型。不同地區(qū)的優(yōu)勢(shì)大腸桿菌和優(yōu)勢(shì)血清型存在差異，且同一區(qū)域不同養(yǎng)殖場(chǎng)的優(yōu)勢(shì)大腸桿菌和優(yōu)勢(shì)血清型也可能表現(xiàn)不同，這給畜禽大腸桿菌病的防控帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)，提示大腸桿菌的防控要因地制宜。

奶牛糞源大腸桿菌分離株在不同的地區(qū)也有其特有的ST型。本試驗(yàn)MLST分型結(jié)果顯示，51株大腸桿菌分離株分為41個(gè)ST型，優(yōu)勢(shì)ST型ST-154和ST1727，均占5.88%；其中有17種是新型ST型。這與郭銳[19]對(duì)我國(guó)華中地區(qū)93株自牛源肛拭子、牛奶中EHEC分離株的分析不同，ST297是華中地區(qū)常見(jiàn)的ST型，93株分屬13種ST型，無(wú)新型ST型。吳少鵬等[20]研究山東地區(qū)171株健康奶牛源糞便大腸桿菌獲得8個(gè)ST型，無(wú)新型ST型。張欣[21]在研究來(lái)自雞源肝臟、雞舍空氣及肛拭子65株大腸桿菌分離株中發(fā)現(xiàn)，有32個(gè)ST型，ST21為優(yōu)勢(shì)ST型，其中發(fā)現(xiàn)19種新ST型。羅魁[22]研究人源Ex PEC 324株大腸桿菌分離株時(shí)發(fā)現(xiàn)其分為68種ST型，ST1193為優(yōu)勢(shì)血清型，有3種新ST型。這提示不同地區(qū)大腸桿菌的ST型多樣性不同，新疆大腸桿菌的多樣性可能更豐富；且新ST型目前僅出現(xiàn)在雞源和人源大腸桿菌中，牛源大腸桿菌中暫未分離出新ST型。ST聚類(lèi)分析顯示，51株大腸桿菌分離株有8個(gè)ST克隆群，占分離株的50%，提示新疆地區(qū)奶牛糞源大腸桿菌菌株之間有一定克隆關(guān)系。

本試驗(yàn)出現(xiàn)17個(gè)新ST型，從新ST型的基因譜來(lái)看，adk、gyrB、icdA、mdh和recA這5個(gè)基因序列均在數(shù)據(jù)庫(kù)里有相應(yīng)的序列號(hào)，只有purA和fumC基因序列在數(shù)據(jù)庫(kù)里無(wú)相應(yīng)序列號(hào)，說(shuō)明purA和fumC管家基因不穩(wěn)定，發(fā)生了變異，導(dǎo)致新ST型。

3.2 大腸桿菌耐藥性分析本試驗(yàn)中51株大腸桿菌分離株對(duì)青霉素、頭孢噻吩的耐藥率分別為96.1%和60.8%，多重耐藥率為78.43%，而張偉等[23]對(duì)中國(guó)北方腹瀉犢牛大腸桿菌研究發(fā)現(xiàn)其多重耐藥率為19.66%，遠(yuǎn)低于本試驗(yàn)多重耐藥率。新疆北疆犢牛源肛拭子大腸桿菌對(duì)氨芐西林耐藥性最強(qiáng)[24]，河北省秦皇島地區(qū)腹瀉犢牛大腸桿菌卻對(duì)諾氟沙星的耐藥性最強(qiáng)[25]，黑龍江腹瀉犢牛和本試驗(yàn)?zāi)膛＜S便大腸桿菌青霉素耐藥率均為為100%[26]。這種耐藥性差異可能是由于不同地區(qū)的飼養(yǎng)、治療過(guò)程中所使用抗生素的種類(lèi)不同造成的。

β-內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、氯霉素類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)和磺胺類(lèi)藥物一直是獸醫(yī)臨床上抗菌的首選藥物，然而由于抗生素濫用致使大腸桿菌的耐藥基因不斷更新[27]。本試驗(yàn)對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、喹諾酮類(lèi)等6類(lèi)藥物的24種耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺類(lèi)TEM占100%。這個(gè)結(jié)果和徐州病鴨源、南寧樹(shù)鼩源及山東乳房炎牛奶源大腸桿菌β-內(nèi)酰胺類(lèi)TEM基因檢出率一致[28-30]，表明大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)TEM基因可能存在固有耐藥。但究竟是由于TEM基因?qū)δ撤N藥物耐藥還是對(duì)所有β-內(nèi)酰胺類(lèi)都發(fā)揮作用還有待進(jìn)一步研究。2016-2018年從新疆石河子、沙灣、奎屯、瑪納斯和伊犁5個(gè)地區(qū)牛源大腸桿菌中檢測(cè)出qnrA和qnrS[24]，與本試驗(yàn)新疆阿克蘇地區(qū)結(jié)果一致，而山東泰安地區(qū)牛源大腸桿菌耐藥基因僅攜帶qnrS[16]，提示qnrS基因可能在喹諾酮類(lèi)藥物耐藥中占主導(dǎo)地位。本試驗(yàn)中tetA、tetB檢出率均為0，與藥敏試驗(yàn)中大腸桿菌對(duì)四環(huán)素耐藥率(23.58%)不一致，這可能與不同地區(qū)的奶牛所攜帶的四環(huán)素耐藥基因的檢出率不同，且容易出現(xiàn)有耐藥表型卻檢測(cè)不出耐藥基因的情況有關(guān)，所以除了tetA、tetB基因外，應(yīng)該探索其他的四環(huán)素耐藥基因。本試驗(yàn)中耐藥表型與基因型存在不一致的現(xiàn)象，可能是由于某些耐藥基因變異或這些耐藥基因需要其他基因協(xié)同作用才能體現(xiàn)耐藥表型。

因此，在新疆阿克蘇地區(qū)應(yīng)有限使用青霉素、頭孢噻吩、卡那霉素、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素等藥物，可通過(guò)一種或多種藥物聯(lián)合使用來(lái)提高療效；優(yōu)先考慮頭孢吡肟、慶大霉素、阿米卡星等抗生素，但應(yīng)避免濫用，注意用藥劑量及時(shí)間，與此同時(shí)更要注重養(yǎng)殖環(huán)境的消毒，加強(qiáng)奶牛飼養(yǎng)管理，從而提高其抵抗力。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，新疆阿克蘇地區(qū)奶牛肛拭子大腸桿菌檢出率為50.50%；51株大腸桿菌分離株存在腸致病性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌及腸產(chǎn)毒性大腸桿菌3種致病性血清型，優(yōu)勢(shì)血清型為O125:K70(B15)。但是，這些致病性血清型的大腸桿菌分離株對(duì)小鼠致病力不強(qiáng)。B1群大腸桿菌是新疆地區(qū)最常見(jiàn)類(lèi)群。分離株中存在41個(gè)ST型，ST-154和ST1727為優(yōu)勢(shì)ST型，發(fā)現(xiàn)新ST型(STn)17種；ST聚類(lèi)分析顯示，分離株有4個(gè)ST克隆群。51株大腸桿菌分離株對(duì)青霉素、頭孢噻吩等表現(xiàn)出一定的耐藥性，耐藥率均在60.0%以上；多重耐藥率為78.43%；PCR檢測(cè)確定耐藥基因?yàn)門(mén)EM、qnrS、oqxA、aac(6′)-Ib-cr、sul1、sul2及sul3 這7種耐藥基因。提示規(guī)?；膛?chǎng)應(yīng)科學(xué)合理處理糞便，避免耐藥菌二次感染動(dòng)物，致使耐藥菌在動(dòng)物間的不斷傳播。