廣西鴨坦布蘇病毒流行株GXQZ01-DTMUV-2020全基因組序列分子特征分析

謝守玉，熊陳勇，施開(kāi)創(chuàng)，李 軍，鄭 敏，韋顯凱，馮淑萍，屈素潔，龍 鳳，楊 蓉，陸文俊，駱永泉，鐘華訓(xùn)，侯慧賢，覃婉婷，韋慧琦，尹彥文*

(1.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530001；2.廣西大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005；3.賀州市水產(chǎn)畜牧站，廣西 賀州 542699)

坦布蘇病毒(Tembusu virus,TMUV)是屬于黃病毒科黃病毒屬恩塔亞病毒群不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒。1955年，首次從馬來(lái)西亞的三帶喙庫(kù)蚊體內(nèi)分離到TMUV。目前，已從鴨、雞、鵝、麻雀及蚊子體內(nèi)發(fā)現(xiàn)該病毒[1]。2010年，上海地區(qū)的麻鴨出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩、高熱、食欲減退、產(chǎn)蛋下降及死亡癥狀。隨后，我國(guó)養(yǎng)鴨主產(chǎn)區(qū)的東南省份，如浙江、江蘇、福建、山東、湖南等地相繼有疫情發(fā)生，發(fā)病率高達(dá)90%，病死率為5%～30%，致病原曾被稱為“鴨產(chǎn)蛋下降綜合征病毒”，后經(jīng)證實(shí)為鴨坦布蘇病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)[2-4]。馬來(lái)西亞和泰國(guó)的蛋鴨養(yǎng)殖場(chǎng)陸續(xù)有DTMUV引發(fā)疫情的報(bào)道[5-6]。

DTMUV基因組全長(zhǎng)約11 kb，包含5′端和3′端非編碼區(qū)(UTR)，以及1個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)。ORF編碼C、prM和E 等3種結(jié)構(gòu)蛋白，以及NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5等7種非結(jié)構(gòu)蛋白。E蛋白是DTMUV主要膜蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白，為宿主的重要保護(hù)性抗原，能夠誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體發(fā)生特異性免疫應(yīng)答，產(chǎn)生中和抗體[7]。NS1蛋白是胞外分泌性蛋白和多效應(yīng)蛋白，也是在病毒復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的重要抗原，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)[8]。E蛋白和NS1蛋白均具有良好的免疫原性，是DTMUV亞單位疫苗研發(fā)的重點(diǎn)對(duì)象。為了解廣西DTMUV流行毒株基因組分子特征，本試驗(yàn)利用已建立的DTMUV檢測(cè)方法[9]，從診斷為DTMUV陽(yáng)性的病料中擴(kuò)增全基因組序列，與國(guó)內(nèi)外參考毒株進(jìn)行相似性比較，對(duì)ORF、E及NS1基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)廣西DTMUV流行毒株呈現(xiàn)遺傳多樣性的特征，以期為廣西DTMUV流行情況調(diào)查提供數(shù)據(jù)支持，為DTMUV有效防控和致病機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑核酸抽提試劑盒(批號(hào)：20120110T015)購(gòu)于天隆科技公司；PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2(批號(hào)：ASF0454A)、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0(批號(hào)：AK11054A)、pMD18-T載體(批號(hào)：AK91481A)、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(批號(hào)：AK71028A)均購(gòu)于寶生物(大連)公司。

1.2 病料檢測(cè)病料來(lái)自2020年廣西欽州某養(yǎng)鴨場(chǎng)發(fā)病的麻鴨。采集患病麻鴨肝臟、脾臟、腎臟、肺臟等組織樣品，剪成小塊后放入2 mL滅菌離心管中，加入適量PBS，經(jīng)磨碎儀研磨至糜狀，離心后取上清提取核酸，作為模板，利用本實(shí)驗(yàn)室已建立的DTMUV檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)[9]。

1.3 病毒全基因組擴(kuò)增測(cè)序與比對(duì)以DTMUV檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的核酸為模板，利用本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的DTMUV全基因組測(cè)序引物(表1)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。建立50 μL反應(yīng)體系：模板2 μL，PrimeScript One Step Enzyme Mix 2 μL，2×One Step Buffer 25 μL，上、下游引物各1 μL(20 μmol/L)，無(wú)RNA酶滅菌水補(bǔ)足體系。反應(yīng)程序：50℃ 30 min；94℃ 2 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物通過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 全基因組測(cè)序引物

PCR產(chǎn)物膠回收純化后，連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序，每個(gè)片段重復(fù)測(cè)序3次。使用DNAStar軟件包中的SeqMan拼接測(cè)序獲得的片段，最終得到GXQZ01-DTMUV-2020株全基因組序列，并將GXQZ01-DTMUV-2020株全基因組序列同參考毒株進(jìn)行比對(duì)。

1.4 DTMUV全基因組序列分析應(yīng)用BioEdit軟件對(duì)GXQZ01-DTMUV-2020株及參考毒株(表2)全序列進(jìn)行核苷酸和氨基酸相似性分析。應(yīng)用MEGA7軟件對(duì)比對(duì)后的ORF、E及NS1基因序列進(jìn)行最佳核苷酸替換模型評(píng)估：ORF為GTR+G+I；E、NS1基因均為TN93+G。以最佳核苷酸替換模型為基礎(chǔ)，采用最大似然法(maximum likelihood)繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap值設(shè)置為1 000次。應(yīng)用RDP 4(recombination detection program 4)和SimPlot(ver 3.5.1)軟件對(duì)GXQZ01-DTMUV-2020株及參考毒株的全基因組序列進(jìn)行重組分析，檢測(cè)是否有重組現(xiàn)象。應(yīng)用BEAST(ver 1.10.4)軟件包估算ORF、E及NS1基因的遺傳進(jìn)化速率，評(píng)估進(jìn)化的快慢。

表2 DTMUV主要參考毒株信息

2 結(jié)果

2.1 全基因組測(cè)序與比對(duì)結(jié)果應(yīng)用SeqMan程序拼接測(cè)序的片段，得到1株DTMUV，命名為GXQZ01-DTMUV-2020株。結(jié)果顯示，GXQZ01-DTMUV-2020株全長(zhǎng)為10 991 bp，5′端UTR為94 bp，3′端UTR為619 bp，含有1個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)為10 278 bp，編碼3 425個(gè)氨基酸。其中，3種結(jié)構(gòu)蛋白基因C、prM和E長(zhǎng)度分別為360，501，1 503 bp；7種非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B及NS5長(zhǎng)度分別為1 056，681，393，1 857，378，762，2 715 bp。MM_1775和GXQZ01-DTMUV-2020株的E、NS1蛋白氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，E、NS1蛋白分別有14個(gè)和21個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變異(表3)。3′端UTR核苷酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，DTMUV-AH2011株在第82位至155位連續(xù)插入74個(gè)堿基。SD14株在第43位至49位，第71位至73位不連續(xù)插入共10個(gè)堿基。在第60個(gè)核苷酸位置，包括GXQZ01-DTMUV-2020株在內(nèi)共有15株DTMUV插入1個(gè)G堿基。

表3 MM_1775和GXQZ01-DTMUV-2020株的E、NS1蛋白氨基酸序列對(duì)比

2.2 核苷酸與氨基酸相似性分析結(jié)果應(yīng)用BioEdit軟件對(duì)GXQZ01-DTMUV-2020株與參考毒株全序列相似性分析結(jié)果顯示，其與廣西DTMUV流行株的核苷酸相似性為94.1%～98.5%，氨基酸相似性為95.8%～100.0%；與水禽源TMUV參考毒株的核苷酸相似性為85.7%～99.7%，氨基酸相似性為92.0%～100.0%；與蚊蟲(chóng)源TMUV參考毒株的核苷酸相似性為85.8%～99.1%，氨基酸相似性為92.0%～100.0%。E、NS1基因與廣西DTMUV流行株的核苷酸相似性為95.9%～96.4%和96.1%～97.6%，氨基酸相似性為99.0%～99.4%和98.2%～99.1%；與水禽源TMUV參考毒株的核苷酸相似性為89.3%～99.2%和87.4%～99.4%，氨基酸相似性為98.0%～99.8%和94.0%～100.0%；與蚊蟲(chóng)源TMUV參考毒株的核苷酸及氨基酸相似性為88.1%～98.0%和85.8%～99.0%，96.8%～99.4%和93.4%～99.7%；與雞源TMUV(Sitiawan virus)核苷酸及氨基酸相似性為86.8%/96.8%，85.2%/92.6%(表4)。結(jié)果表明，GXQZ01-DTMUV-2020株與廣西DTMUV毒株相似性較高，與水禽源TMUV相似性高于其他宿主源TMUV。

表4 GXQZ01-DTMUV-2020株與部分參考毒株同源性分析 %

2.3 遺傳進(jìn)化樹(shù)繪制應(yīng)用MEGA7對(duì)ORF、E及NS1基因繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)(圖1，2)。ORF遺傳進(jìn)化樹(shù)中(圖1A)，MM_1775株與 Sitiawan virus組成TMUV群，SD14株為3群，DK/TH/CU-DTMUV2007株為1群。GXQZ01-DTMUV-2020株與廣西GX2012，GX2013E株屬于2.2亞群，廣西GX2011，GX2015株與國(guó)內(nèi)主要DTMUV毒株組成2.1亞群。結(jié)果表明，廣西DTMUV流行毒株進(jìn)化方向不完全相同，呈現(xiàn)遺傳多樣性特征。從圖1A 中可以得出，GXQZ01-DTMUV-2020株與參考毒株CHN-YC和DTMUV/Goose/CHN/2019/AQ-19遺傳關(guān)系距離較近，這與相似性分析結(jié)果一致。E基因(圖1B)和NS1(圖2)基因遺傳進(jìn)化樹(shù)分布與ORF相似。

A.ORF;B.E基因。紅色.2.2亞群；橙色.2.1亞群；紫色.1群；藍(lán)色.3群；綠色.TMUV。下同

圖2 DTMUV NS1基因遺傳進(jìn)化樹(shù)

2.4 重組分析結(jié)果應(yīng)用RDP4和SimPlot軟件對(duì)GXQZ01-DTMUV-2020株與參考毒株的全基因組序列進(jìn)行重組分析。結(jié)果顯示，HB2016、HD2-2013、CHN-YC及AH2014株檢測(cè)到重組信號(hào)(圖3)。HB2016株重組的主要親本為GA，相似性為98.9%，次要親本為GX2015株，相似性為100%，重組位點(diǎn)為比對(duì)后的第2 049～4 054位；HD2-2013株重組的主要親本為HD-2015株，相似性為99.3%，次要親本為GDHD2014-3株，相似性為99.9%，重組位點(diǎn)為第5 675～7 237位；CHN-YC株重組的主要親本為DTMUV/Goose/CHN/2019/AQ-19株，相似性為99.2%，次要親本為MC株，相似性為100%，重組位點(diǎn)為第870～1 989位；AH2014株重組的主要親本為HB2010株，相似性為99.9%，次要親本為GX2015株，相似性為99.9%，重組位點(diǎn)為第2 044～4 002位。

A.HB2016;B.HD2-2013;C.CHN-YC;D.AH2014

2.5 遺傳進(jìn)化速率估算結(jié)果應(yīng)用BEAST軟件對(duì)GXQZ01-DTMUV-2020株及參考毒株的ORF、E及NS1基因遺傳進(jìn)化速率估算結(jié)果為1.146×10-3，1.467×10-3，1.319×10-3替換/(位點(diǎn)·年)，表明E基因進(jìn)化速率最快。

3 討論

廣西壯族自治區(qū)地處沿海亞熱帶，與東南亞國(guó)家接壤，屬于候鳥(niǎo)遷徙過(guò)冬地區(qū)，而TMUV宿主譜廣泛，存在野鳥(niǎo)傳播病毒的潛在風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)報(bào)道，養(yǎng)鴨場(chǎng)從業(yè)人員的血清TMUV陽(yáng)性檢出率高達(dá)71.9%，說(shuō)明TMUV宿主范圍擴(kuò)大，對(duì)公共衛(wèi)生安全可能造成威脅[10]。因此，須加強(qiáng)對(duì)TMUV的流行情況調(diào)查及分子流行病學(xué)研究。本試驗(yàn)從廣西欽州某蛋鴨養(yǎng)殖場(chǎng)采集病死鴨的脾臟、肝臟、腎臟、肺臟及卵巢組織，利用本實(shí)驗(yàn)室已建立的DTMUV病原診斷方法進(jìn)行檢測(cè)[9]，以陽(yáng)性核酸為模板，進(jìn)行DTMUV全基因組序列擴(kuò)增，得到GXQZ01-DTMUV-2020全序列。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，E蛋白氨基酸共有14個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變異，其中第154～157位NYPV變異為NYSA。TMUV E蛋白第156位氨基酸的改變將影響病毒的組織嗜性和在動(dòng)物群體間的傳播能力，以及第154位氨基酸的糖基化修飾作用[11-13]。NS1蛋白有2個(gè)糖基化位點(diǎn)，通過(guò)借助E蛋白疏水信號(hào)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在參與病毒侵襲、組裝、釋放及致病性方面都起到關(guān)鍵作用[14-15]。本研究中NS1有21個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變異，尚需深入探討突變的意義。在3′端UTR區(qū)域，DTMUV-AH2011株連續(xù)插入74個(gè)堿基，SD14株不連續(xù)插入10個(gè)堿基，并且在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上為獨(dú)立的分支(數(shù)據(jù)未列出)，尚未見(jiàn)其他文獻(xiàn)有相關(guān)報(bào)道，至于突變對(duì)毒株的影響需要進(jìn)一步研究。

相似性分析結(jié)果顯示，GXQZ01-DTMUV-2020株基因組結(jié)構(gòu)中，5′UTR、3′UTR、NS1、NS2A及NS4B與CHN-YC株核苷酸相似性最高；prM、E、NS2B、NS3及NS5與DTMUV/Goose/CHN/2019/AQ-19株核苷酸相似性最高。其中，C和NS4A基因核苷酸相似性與CHN-YC和DTMUV/Goose/CHN/2019/AQ-19株并列最高，為99.4%和98.9%，氨基酸相似性均為100%。以上結(jié)果表明，GXQZ01-DTMUV-2020基因組呈現(xiàn)分子遺傳多樣性特征。GXQZ01-DTMUV-2020與國(guó)內(nèi)TMUV參考毒株的核苷酸相似性為85.7%～99.7%，氨基酸相似性為92.0%～100%。E、NS1基因與國(guó)內(nèi)TMUV參考毒株的核苷酸相似性為89.3%～99.2%和87.4%～99.4%，氨基酸相似性為95.4%～99.8%和94.0%～100%。任丹等[16]分離到1株鵝源TMUV全基因組序列與國(guó)內(nèi)DTMUV相似性最高達(dá)97.7%，與鵝源TMUV相似性為96.7% 左右。胡峰等[17]分離的2株水禽源TMUV，與參考毒株的相似性大于95.7%，E基因與參考毒株的核苷酸相似性為95.2%以上。李剛[18]分離的山東DTMUV毒株與2017年分離株的ORF氨基酸相似性為98%以上；與2010―2012年分離株的氨基酸相似性為96.8%～98.6%。農(nóng)海連[19]從廣西分離的4株DTMUV與參考毒株的核苷酸相似性高于96%，氨基酸相似性高于98%。劉烈發(fā)等[20]從江西省某蛋鴨養(yǎng)殖場(chǎng)分離到1株DTMUV，與已報(bào)道的DTMUV參考毒株核苷酸相似性在98.5%以上。李文俊等[21]從鴨組織病料中分離出1株DTMUV，其E基因與DTMUV參考毒株相似性最高達(dá)99.2%，與雞源TMUV毒株相似性為86.7%。以上表明，國(guó)內(nèi)DTMUV毒株之間的相似性普遍較高，與本研究的分析結(jié)果相似，說(shuō)明國(guó)內(nèi)DTMUV毒株遺傳變異較小。

水禽源、雞源及蚊蟲(chóng)源TMUV的ORF遺傳進(jìn)化樹(shù)可分為4個(gè)進(jìn)化群，GXQZ01-DTMUV-2020株與GX2012、GX2013E株等組成2.1亞群；GX2011、GX2015株與國(guó)內(nèi)主要DTMUV組成2.2亞群，這是國(guó)內(nèi)DTMUV優(yōu)勢(shì)群體；馬來(lái)西亞毒株組成TMUV群；山東SD14株為3群；泰國(guó)DK/TH/CU-DTMUV2007株為1群。廣西DTMUV有3株位于2.1亞群，2株位于2.2亞群，從毒株分離年份上尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。GXQZ01-DTMUV-2020株與DTMUV/Goose/CHN/2019/AQ-19和CHN-YC處于同一進(jìn)化分支上，遺傳關(guān)系距離最近，這與相似性分析結(jié)果一致。GX2012、GX2013E株和重慶CQW1株處于相鄰進(jìn)化分支上，GX2011、GX2015株與廣東FS-2011株處于同一進(jìn)化分支。并且，GXQZ01-DTMUV-2020株與廣西其他4株DTMUV遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，呈現(xiàn)不同的進(jìn)化趨勢(shì)。E基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)中，GXQZ01-DTMUV-2020株與2.2亞群的優(yōu)勢(shì)毒株遺傳距離比GX2012、GX2013E更遠(yuǎn)，這與ORF和NS1不同。NS1遺傳進(jìn)化趨勢(shì)與ORF相似。PENG等[22]對(duì)國(guó)內(nèi)外TMUV毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，其中廣西毒株的分群結(jié)果與本研究一致。NINVILAI等[23]對(duì)2015―2017年分離的泰國(guó)DTMUV毒株進(jìn)行遺傳特征分析，GX2013E處于2.1亞群，絕大多數(shù)中國(guó)DTMUV毒株位于2.2亞群。農(nóng)連海[19]分離的4株廣西DTMUV毒株，遺傳進(jìn)化分支上與CQW1遺傳關(guān)系最近，這與本研究結(jié)果一致。綜上，廣西DTMUV毒株呈現(xiàn)不同的遺傳進(jìn)化趨勢(shì)，表現(xiàn)遺傳多樣性的特征。

DTMUV全基因組序列重組分析發(fā)現(xiàn)，共有4株存在重組現(xiàn)象。其中，HB2016和AH2014重組的位點(diǎn)相似，位于E、NS1及NS2A基因，CHN-YC重組的位點(diǎn)位于E基因，HD2-2013重組的位點(diǎn)位于NS3、NS4A和NS4B基因。E蛋白作為宿主的重要保護(hù)性抗原，在病毒復(fù)制過(guò)程中，對(duì)病毒的吸附、融合及受體結(jié)合等發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[7,24]。非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒核酸的復(fù)制、蛋白的合成加工與病毒粒子組裝等方面起關(guān)鍵性作用[25]。因此，這些基因發(fā)生重組，須引起密切關(guān)注。DAI等[26]利用RDP 4軟件檢測(cè)到一株DTMUV發(fā)生重組，重組位點(diǎn)位于prM和E基因。本研究對(duì)ORF、E及NS1基因遺傳進(jìn)化速率估算的結(jié)果為1.146×10-3，1.467×10-3，1.319×10-3替換/(位點(diǎn)·年)。NINVILAI等[23, 27]對(duì)亞洲D(zhuǎn)TMUV毒株的ORF、E基因遺傳進(jìn)化速率估算結(jié)果為1.113×10-3，1.507×10-3替換/(位點(diǎn)·年)。YU等[28]對(duì)DTMUV的E基因進(jìn)化速率評(píng)估結(jié)果為5×10-4替換/(位點(diǎn)·年)。DAI等[27]對(duì)TMUV全基因組序列遺傳進(jìn)化速率估算結(jié)果為5.9×10-4替換/(位點(diǎn)·年)。

綜上，同一個(gè)基因或片段的進(jìn)化速率估算結(jié)果有差異，可能與選擇的參考毒株種類、數(shù)量及軟件參數(shù)設(shè)置等因素有關(guān)。因此，須進(jìn)一步加強(qiáng)DTMUV流行情況調(diào)查及基因組分子結(jié)構(gòu)分析，為DTMUV的有效防控提供數(shù)據(jù)支持。