轉(zhuǎn)移因子聯(lián)合La Sota株免疫對(duì)NDV F48E9株強(qiáng)毒重復(fù)感染雞的保護(hù)作用

徐 磊，余勛信，廖惠珍，劉毅發(fā)，鐘云欽，蔣 鈴，謝杼倢，閆麗萍，曾亮明，杜 君，宋素泉*，張淵魁*，黃 瑜

(1.福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350119；2.派生特(福州)生物科技有限公司，福建 福州 350500；3.福州市長(zhǎng)樂區(qū)鄉(xiāng)村振興發(fā)展中心，福建 福州 350200；4.福州眾為生物科技有限公司，福建 福州 350012；5.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；6.兆豐華生物科技(南京)有限公司，江蘇 南京 211102；7.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所 福建省禽病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350013)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由ND病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的急性敗血性、高度接觸性傳染病，嚴(yán)重影響禽業(yè)健康發(fā)展，在我國(guó)被列為一類動(dòng)物疫病，也是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織法定報(bào)告的動(dòng)物疫病[1]。NDV屬于副黏病毒科、正禽腮腺炎病毒屬，為單股、負(fù)鏈RNA病毒，只有1個(gè)血清型，但有多種基因型(基因Ⅰ～Ⅸ型)，不同基因型毒株的生物學(xué)特性存在較明顯的差異[2]，如：分離自1946年的NDV La Sota株，屬于基因Ⅱ型，仍是最常用的NDV弱毒疫苗株[3]；同年流行于我國(guó)的NDV F48株，屬于基因Ⅸ型，感染雞出現(xiàn)呼吸困難、神經(jīng)癥狀等ND典型臨床癥狀以及呼吸道、消化道黏膜出血等ND典型剖檢病變[4-5]，至今仍是進(jìn)行疫苗效力評(píng)價(jià)的經(jīng)典強(qiáng)毒株[6]。目前，我國(guó)主要以疫苗免疫防控ND，但是臨床免疫雞群仍時(shí)有ND流行。因此，NDV疫苗免疫機(jī)理研究及其免疫增強(qiáng)佐劑研發(fā)，是ND防控中的重要研究方向[7-8]。

轉(zhuǎn)移因子(transfer factor，TF)屬于細(xì)胞因子，具有較好的免疫增強(qiáng)作用[9]。本實(shí)驗(yàn)室建立了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的TF制備及檢驗(yàn)方法[10-12]，并初步驗(yàn)證了TF可以緩解雞免疫抑制、增強(qiáng)雞免疫功能和提高雞疫苗免疫效果[13-16]，但是，缺少TF提高NDV疫苗免疫雞對(duì)NDV強(qiáng)毒株感染的攻毒保護(hù)效果及作用機(jī)理研究?；诖?，本研究參考了《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015年版雞NDV活疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中La Sota株活疫苗的效力檢驗(yàn)方法(La Sota株活疫苗免疫后以F48E9株進(jìn)行攻毒，觀察攻毒保護(hù)情況，用于評(píng)價(jià)La Sota株活疫苗效力)[17]，圍繞TF與NDV La Sota弱毒疫苗株聯(lián)合免疫對(duì)NDV F48E9株強(qiáng)毒攻毒雞的保護(hù)作用及機(jī)理進(jìn)行了研究，應(yīng)用T淋巴細(xì)胞增殖率測(cè)定法、B淋巴細(xì)胞增殖率測(cè)定法、血凝抑制(hemagglutination inhibition，HI)試驗(yàn)測(cè)定La Sota弱毒株免疫后雞T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平、ND HI抗體效價(jià)(log2X)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，并采用熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)F48E9強(qiáng)毒株攻毒雞的病毒血癥、泄殖腔排毒、口咽排毒與肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、法氏囊、盲腸扁桃體、腦等主要組織的F48E9株感染情況，為后續(xù)開展TF對(duì)不同基因型NDV疫苗免疫效力的影響及機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 疫苗與病毒株NDV La Sota株弱毒疫苗由兆豐華生物科技(南京)有限公司提供，病毒含量為107.17EID50/羽份；NDV F48E9株強(qiáng)毒由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供，病毒含量分別為105.0ELD50/mL和109.4ELD50/mL。

1.2 主要儀器及試劑動(dòng)物飼養(yǎng)隔離器購(gòu)自蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀和CFX96型熒光定量PCR儀均購(gòu)自BioRad公司；植物血凝素P(PHA-P)、脂多糖(LPS)和四甲基偶氮唑鹽(MTT)均購(gòu)自Sigma公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊锕こ坦荆煌耆玆PMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；犢牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；標(biāo)準(zhǔn)NDV HI抗原(La Sota株)購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；RNA提取試劑盒購(gòu)自凱杰生物工程(深圳)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自GE公司；Taq DNA聚合酶購(gòu)自Promega公司；SPF雞與SPF雞胚均購(gòu)自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司。

1.3 TF制備按照本實(shí)驗(yàn)室已獲得授權(quán)的中國(guó)發(fā)明專利制備豬脾TF[10-12]：以健康豬的脾臟為原料，先后經(jīng)勻漿、細(xì)胞破碎、分離、滅活、微濾和超濾等技術(shù)工藝精制而成。經(jīng)檢驗(yàn)，所制備豬脾TF的pH值為7.0，核糖含量和多肽含量分別為72.0 mg/L和3.5 g/L，脫E受體法效力為15%，D260 nm/D280 nm比值為2.23且在252 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，細(xì)菌內(nèi)毒素含量小于10 EU/mL，熱原檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)、異常毒性檢查、蛋白質(zhì)定性檢驗(yàn)、過敏反應(yīng)檢查和安全檢驗(yàn)均合格。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物SPF雞攻毒前在正壓動(dòng)物飼養(yǎng)隔離器中飼養(yǎng)，30日齡免疫接種，44日齡轉(zhuǎn)至負(fù)壓動(dòng)物飼養(yǎng)隔離器中首次攻毒并飼養(yǎng)，58日齡進(jìn)行二次攻毒并飼養(yǎng)。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)選取SPF雞100羽隨機(jī)分成5組(表1)，每組均有SPF雞20羽，具體如下：?jiǎn)为?dú)免疫1組(點(diǎn)眼免疫105.17EID50La Sota株弱毒疫苗)、聯(lián)合免疫1組(點(diǎn)眼免疫105.17EID50La Sota株弱毒疫苗同時(shí)肌肉注射0.2 mL TF)、對(duì)照1組(非免疫)、對(duì)照2組(非免疫)和空白1組(非免疫)。免疫后14 d，單獨(dú)免疫1組、聯(lián)合免疫1組和對(duì)照1組均肌肉注射0.5 mL 105.0ELD50/mL NDV F48E9株強(qiáng)毒(即：104.7ELD50)進(jìn)行首次攻毒，對(duì)照組2和空白組1沒有進(jìn)行首次攻毒。首次攻毒后第14天，單獨(dú)免疫1組、聯(lián)合免疫1組和對(duì)照2組均肌肉注射0.5 mL 109.4ELD50/mL NDV F48E9株強(qiáng)毒(即：109.1ELD50)進(jìn)行二次攻毒，空白1組沒有進(jìn)行二次攻毒，即空白1組為非免疫非攻毒組。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

觀察各組雞每日臨床癥狀，及時(shí)剖檢病死雞，至二次攻毒后21 d剖檢存活雞，及時(shí)采集各組剖檢雞的肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、法氏囊、盲腸扁桃體、腦等主要組織，進(jìn)行NDV F48E9株在主要組織中感染情況檢測(cè)。此外，各組分別于免疫前3 d、免疫后7,14 d、首次攻毒后1,3,7,14 d以及二次攻毒后1,3,7,14,21 d 隨機(jī)抽取5羽SPF雞，經(jīng)前翅靜脈采血，分離淋巴細(xì)胞進(jìn)行T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平和B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平測(cè)定，分離血清進(jìn)行ND HI抗體效價(jià)和攻毒后NDV F48E9株的病毒血癥檢測(cè)，同時(shí)采集攻毒后SPF雞泄殖腔試子和口咽試子進(jìn)行攻毒后NDV F48E9株的排毒情況檢測(cè)。觀察各組雞臨床表現(xiàn)和剖檢變化，SPF雞發(fā)病即判為不保護(hù)[17]，統(tǒng)計(jì)各組SPF雞的發(fā)病率和病死率。

1.6 T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平測(cè)定經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離并制成淋巴細(xì)胞懸液(含8×106/mL淋巴細(xì)胞的完全RPMI-1640培養(yǎng)液)，按照本實(shí)驗(yàn)室已建立的T淋巴細(xì)胞增殖率測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定[13,18]，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每份雞血樣設(shè)立試驗(yàn)孔(淋巴細(xì)胞懸液150 μL，含50 mg/L PHA-P的完全RPMI-1640培養(yǎng)液50 μL)、對(duì)照孔(淋巴細(xì)胞懸液150 μL，完全RPMI-1640培養(yǎng)液50 μL)、空白孔(完全RPMI-1640培養(yǎng)液200 μL)各3孔，40℃培養(yǎng)68 h后，每孔加入含5 g/L MTT的Hank's液15 μL，40℃培養(yǎng)4 h后，每孔加入100 μL二甲基亞礬，10 min 后測(cè)定D490 nm值。每羽雞T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平用PHA-P刺激指數(shù)(stimulation index，SI)表示，PHA-P SI =(試驗(yàn)孔D490 nm均值-空白孔D490 nm均值)/(對(duì)照孔D490nm均值-空白孔D490 nm均值)。所得數(shù)據(jù)用單因素方差分析和最小顯著性差法(LSD)分析，P<0.05為差異顯著。

1.7 B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平測(cè)定經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定測(cè)定方法，測(cè)定方法與1.6類似，不同點(diǎn)是：制成淋巴細(xì)胞懸液(含6×106/mL淋巴細(xì)胞的完全RPMI-1640培養(yǎng)液)用于試驗(yàn)，并將“含25 mg/L LPS的完全RPMI-1640培養(yǎng)液”替代“含50 mg/L PHA-P的完全RPMI-1640培養(yǎng)液”。每羽雞B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平用LPS SI表示，所得數(shù)據(jù)用單因素方差分析和最小顯著性差法(LSD)分析，P<0.05為差異顯著。

1.8 ND HI抗體效價(jià)測(cè)定按照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定雞血清ND HI抗體效價(jià)[5]，測(cè)定結(jié)果以log2X表示。HI抗體效價(jià)(log2X)≥4，則判為ND抗體陽(yáng)性；HI抗體效價(jià)(log2X)<4，則判為ND抗體陰性。所得數(shù)據(jù)用單因素方差分析和最小顯著性差法(LSD)分析，P<0.05為差異顯著。

1.9 NDV F48E9株病毒血癥與排毒情況檢測(cè)將采集的攻毒后泄殖腔試子和口咽試子，分別置于盛有磷酸鹽緩沖鹽溶液的采樣管中，分別混合，離心取上清液。將獲得的攻毒后各組雞血清樣品、泄殖腔試子上清液樣品及口咽試子上清液樣品，按照本實(shí)驗(yàn)室已建立的基因Ⅸ型NDV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法[19]，提取病毒核酸，合成特異性引物序列(P1：5′-AGGACACTGACTACTTTG-3′，P2：5′-CCGATAATGGCACCTATA-3′)和TaqMan MGB探針(5′-CGT-CTCTGCCTCCTTCCTCC-3′)，探針5′端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，3′端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為MGB，預(yù)期擴(kuò)增片段113 bp，進(jìn)行攻毒后NDV F48E9株的病毒血癥與排毒情況檢測(cè)。

1.10 NDV F48E9株在主要組織中感染情況檢測(cè)將采集各組雞的肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、法氏囊、盲腸扁桃體、腦等主要組織，按照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織樣品處理、雞胚接種[5]，盲傳3代，收取雞胚尿囊液，按照本實(shí)驗(yàn)室已建立的基因Ⅸ型NDV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法[19]，進(jìn)行NDV F48E9株在主要組織中感染情況檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 攻毒保護(hù)情況攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示(表2)，免疫后，各組雞采食、精神等臨床表現(xiàn)均正常，TF注射部位無炎癥、無腫脹等不良反應(yīng)。首次攻毒后，單獨(dú)免疫1組和聯(lián)合免疫1組發(fā)病率和病死率均為0%(0/20)，首次攻毒保護(hù)率均為100%(20/20)；對(duì)照1組所有雞均出現(xiàn)ND典型臨床癥狀，并分別于首次攻毒后2,3,4 d分別死亡4,10,6羽，均出現(xiàn)ND典型剖檢病變，發(fā)病率和病死率均為100%(20/20)；對(duì)照2組和空白1組均無發(fā)病、無死亡。

表2 各組的保護(hù)效率

二次攻毒后，單獨(dú)免疫1組共有4羽雞臨床表現(xiàn)正常且未發(fā)現(xiàn)剖檢病變，另有16羽雞于二次攻毒2 d后開始出現(xiàn)ND典型臨床癥狀，其中12羽雞分別于二次攻毒后2,3,4 d 各死亡4羽并均出現(xiàn)ND典型剖檢病變，余下4羽雞于二次攻毒13 d后恢復(fù)正常而剖檢病變不典型，即：?jiǎn)为?dú)免疫1組二次攻毒發(fā)病率和病死率分別為80%(16/20)和60%(12/20)，二次攻毒保護(hù)率為20%(4/20)；聯(lián)合免疫1組共有10羽雞臨床表現(xiàn)正常且未發(fā)現(xiàn)剖檢病變，另有10羽雞于二次攻毒后3 d開始出現(xiàn)ND典型臨床癥狀，其中8羽雞分別于二次攻毒后3,4,5,6 d，分別死亡2,2,3,1羽并出現(xiàn)ND典型剖檢病變，余下2羽雞于二次攻毒后10 d恢復(fù)正常且剖檢病變不典型，即：聯(lián)合免疫1組二次攻毒發(fā)病率和病死率分別為50%(10/20)和40%(8/20)，二次攻毒保護(hù)率為50%(10/20)；對(duì)照2組所有雞均出現(xiàn)ND典型臨床癥狀，并分別于二次攻毒后2,3,4 d分別死亡7,12,1羽，均出現(xiàn)ND典型剖檢病變，發(fā)病率和病死率均為100%(20/20)；空白1組均無發(fā)病、無死亡，且未發(fā)現(xiàn)剖檢病變。

2.2 T淋巴細(xì)胞增殖率測(cè)定T淋巴細(xì)胞增殖率測(cè)定結(jié)果見圖1。免疫前，各組PHA-P SI接近且差異不顯著，均值為1.30。免疫后，聯(lián)合免疫1組PHA-P SI于第7 天達(dá)到免疫峰值(1.77)，在7,14 d比單獨(dú)免疫1組分別提高了0.10和0.13，且極顯著高于其他組(P<0.01)；單獨(dú)免疫1組于第7 天極顯著高于對(duì)照2組和空白1組(P<0.01)；對(duì)照1組、對(duì)照2組和空白1組接近且差異不顯著，均值為1.30。

圖1 各組T淋巴細(xì)胞增殖率的變化

首次攻毒后，聯(lián)合免疫1組PHA-P SI于第1 天達(dá)到首次攻毒峰值(1.82)，于攻毒后1,3,7,14 d比單獨(dú)免疫1組分別提高了0.08,0.08,0.10和0.24，且于攻毒后1,3,7,14 d極顯著高于其他組(P<0.01)；單獨(dú)免疫1組于第1 天達(dá)到首次攻毒峰值(1.75)，且于攻毒后1,3,7,14 d極顯著高于對(duì)照1組、對(duì)照2組和空白1組(P<0.01)；對(duì)照1組于第1 天達(dá)到首次攻毒峰值(1.41)且極顯著高于對(duì)照2組和空白1組(P<0.01)；對(duì)照2組和空白1組接近且差異不顯著，均值為1.32。

二次攻毒后，聯(lián)合免疫1組PHA-P SI于第7 天達(dá)到二次攻毒峰值(1.92)，于攻毒后1,3,7,14,21 d 比單獨(dú)免疫1組分別提高了0.16,0.13,0.18,0.25 和0.14，且于攻毒后1,3,7,14,21 d極顯著高于其他組(P<0.01)；單獨(dú)免疫1組于第7 天達(dá)到二次攻毒峰值(1.75)，且于攻毒后1,3,7,14 d極顯著高于對(duì)照2組和空白1組(P<0.01)；對(duì)照2組于第1 天達(dá)到二次攻毒峰值(1.42)，此時(shí)與空白1組接近且差異不顯著；空白1組均值為1.29。

2.3 B淋巴細(xì)胞增殖率測(cè)定B淋巴細(xì)胞增殖率測(cè)定結(jié)果見圖2。免疫前，各組LPS SI接近且差異不顯著，均值為1.10。免疫后，聯(lián)合免疫1組LPS SI于第14天達(dá)到免疫峰值(1.38)，免疫后7,14 d比單獨(dú)免疫1組分別提高了0.04和0.16，其中第7 天極顯著高于對(duì)照1組、對(duì)照2組和空白1組(P<0.01)，且在第14 天極顯著高于單獨(dú)免疫1組、對(duì)照1組、對(duì)照組2和空白1組(P<0.01)；單獨(dú)免疫1組在第7 天達(dá)到免疫峰值(1.26)，在免疫后7,14 d極顯著高于對(duì)照1組、對(duì)照2組和空白1組(P<0.01)；對(duì)照組1、對(duì)照2組和空白1組接近且差異不顯著，均值為1.12。

圖2 各組B淋巴細(xì)胞增殖率的變化

首次攻毒后,聯(lián)合免疫1組LPS SI于第14 天達(dá)到首次攻毒峰值(1.59)，攻毒后1,3,7,14 d比單獨(dú)免疫1組分別提高了0.06,0.06,0.14和0.18，在攻毒后1,3 d極顯著高于對(duì)照1組、對(duì)照2組和空白1組(P<0.01)，且于攻毒后7 ,14 d極顯著高于單獨(dú)免疫1組、對(duì)照2組和空白1組(P<0.01)；單獨(dú)免疫1組在第7 天達(dá)到首次攻毒峰值(1.43)，在第1 天極顯著高于對(duì)照1組、對(duì)照2組和空白1組(P<0.01)，并在攻毒后3,7,14 d極顯著高于對(duì)照2組和空白1組(P<0.01)；對(duì)照1組在第3天達(dá)到首次攻毒峰值(1.20)，且在攻毒后1,3 d極顯著高于對(duì)照2組(P<0.01)；對(duì)照2組和空白1組接近且差異不顯著，均值為1.11。

二次攻毒后,聯(lián)合免疫1組LPS SI在第7 天達(dá)到二次攻毒峰值(1.83)，在攻毒后1,3,7,14,21 d比單獨(dú)免疫1組分別提高了0.08,0.23,0.20,0.22和0.18，其中攻毒后第1 天極顯著高于對(duì)照2組和空白1組(P<0.01)，在攻毒后3,7,14,21 d極顯著高于單獨(dú)免疫1組和空白1組(P<0.01)；單獨(dú)免疫1組LPS SI在第7 天達(dá)到二次攻毒峰值(1.63)，在攻毒后1,3,7,14,21 d極顯著高于對(duì)照2組和空白1組(P<0.01)；對(duì)照2組LPS SI在第3 天達(dá)到二次攻毒峰值(1.15)，與空白1組第1 天接近且差異不顯著；空白1組均值為1.12。

2.4 ND HI抗體效價(jià)ND HI抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果見(圖3)。免疫前，各組均沒有檢出ND HI抗體。免疫后，聯(lián)合免疫1組ND HI抗體效價(jià)在第7 天達(dá)到免疫峰值(8.6)，免疫后7,14 d比單獨(dú)免疫1組分別提高了1.6和1.5，且在免疫后7,14 d極顯著高于其他組(P<0.01)；單獨(dú)免疫1組在第7 天達(dá)到免疫峰值(7.1)，在免疫后7,14 d極顯著高于對(duì)照1組、對(duì)照2組和空白1組(P<0.01)；對(duì)照1組、對(duì)照2組和空白1組均沒有檢出ND HI抗體。

圖3 各組ND HI抗體的變化

首次攻毒后，聯(lián)合免疫1組ND HI抗體效價(jià)在第7 天達(dá)到首次攻毒峰值(9.7)，攻毒后1,3,7,14 d比單獨(dú)免疫1組分別提高了1.1,1.3,1.2和1.6，在攻毒后1,3,7,14 d極顯著高于其他組(P<0.01)；單獨(dú)免疫1組在第7 天達(dá)到首次攻毒峰值(8.5)，攻毒后1,3,7,14 d極顯著高于對(duì)照1組、對(duì)照2組和空白1組(P<0.01)；對(duì)照1組在第3 天達(dá)到首次攻毒峰值(1.2)且極顯著高于對(duì)照2組和空白1組(P<0.01)，但始終為陰性；對(duì)照2組和空白1組接近且差異不顯著，均沒有檢出ND HI抗體。

二次攻毒后，聯(lián)合免疫1組ND HI抗體效價(jià)在第7 天達(dá)到二次攻毒峰值(12.1)，攻毒后1,3,7,14,21 d比單獨(dú)免疫1組分別提高了0.6,0.9,2.3,0.5和1.2，在攻毒后1,14 d極顯著高于對(duì)照2組和空白1組(P<0.01)，在攻毒后3,7,21 d極顯著高于單獨(dú)免疫1組和空白1組(P<0.01)；單獨(dú)免疫1組在第14 天達(dá)到二次攻毒峰值(9.9)，攻毒后1,3,7,14,21 d極顯著高于對(duì)照2組和空白1組(P<0.01)；對(duì)照2組在第3 天達(dá)到二次攻毒峰值(2.0)，與空白1組第1 天接近且差異不顯著，但始終為陰性；空白1組均沒有檢出ND HI抗體。

2.5 NDV F48E9株病毒血癥攻毒后NDV F48E9株病毒血癥結(jié)果見表3。首次攻毒后，單獨(dú)免疫1組、聯(lián)合免疫1組、對(duì)照2組和空白1組雞均沒有檢出NDV F48E9株，病毒血癥率均為0%；對(duì)照1組始終可以檢出NDV F48E9株，病毒血癥率為100%。

表3 各組病毒血癥情況 %

二次攻毒后，單獨(dú)免疫1組和聯(lián)合免疫1組雞的病毒血癥率在第1 天分別為75%和40%，之后逐漸下降，其中單獨(dú)免疫1組病毒血癥率在二次攻毒后21 d仍有13%，聯(lián)合免疫1組病毒血癥率在二次攻毒后7 d即為0%，聯(lián)合免疫1組病毒血癥率在二次攻毒后1,3,7,14,21 d分別比單獨(dú)免疫1組減少了35%,34%,38%,25%和13%；對(duì)照2組雞始終可以檢出NDV F48E9株，病毒血癥率為100%；空白1組雞沒有檢出NDV F48E9株，病毒血癥率為0%。

2.6 雞泄殖腔NDV F48E9株排毒情況攻毒后雞泄殖腔NDV F48E9株排毒檢測(cè)結(jié)果見表4。首次攻毒后，單獨(dú)免疫1組、聯(lián)合免疫1組、對(duì)照2組和空白1組雞泄殖腔均沒有檢出NDV F48E9株，泄殖腔試子陽(yáng)性率均為0%；對(duì)照1組泄殖腔試子陽(yáng)性率在首次攻毒后第1 天達(dá)到60%，并于首次攻毒后3 d 提高至最高值(100%)。

表4 攻毒后各組雞泄殖腔NDV F48E9株排毒情況 %

二次攻毒后，單獨(dú)免疫1組和聯(lián)合免疫1組泄殖腔試子陽(yáng)性率在第1 天分別為50%和15%，并均在第3 天達(dá)到峰值，此時(shí)泄殖腔試子陽(yáng)性率分別為75%和39%，之后逐漸下降，其中單獨(dú)免疫1組泄殖腔試子陽(yáng)性率在二次攻毒后21 d仍有25%；聯(lián)合免疫1組泄殖腔試子陽(yáng)性率在二次攻毒14 d后即為0%，聯(lián)合免疫1組泄殖腔試子陽(yáng)性率在二次攻毒后1,3,7,14,21 d分別比單獨(dú)免疫1組減少了35%,36%,42%,38%和25%；對(duì)照2組泄殖腔試子陽(yáng)性率在二次攻毒后第1 天達(dá)到75%，并在二次攻毒后第3 天提高至最高值(100%)；空白1組雞泄殖腔各時(shí)間點(diǎn)均沒有檢出NDV F48E9株，泄殖腔試子陽(yáng)性率均為0%。

2.7 雞口咽NDV F48E9株排毒情況攻毒后雞口咽NDV F48E9株排毒檢測(cè)結(jié)果見表5。首次攻毒后，單獨(dú)免疫1組、聯(lián)合免疫1組、對(duì)照2組和空白1組雞口咽均沒有檢出NDV F48E9株，口咽試子陽(yáng)性率均為0%；對(duì)照1組口咽試子陽(yáng)性率在首次攻毒后第1 天達(dá)到80%，攻毒后3 d提高至最高值(100%)。

表5 攻毒后各組雞口咽NDV F48E9株排毒情況 %

二次攻毒后，單獨(dú)免疫1組和聯(lián)合免疫1組口咽試子陽(yáng)性率在第1天分別為60%和25%，攻毒后3 d達(dá)到峰值，此時(shí)口咽試子陽(yáng)性率分別為83%和50%，之后逐漸下降，其中單獨(dú)免疫1組口咽試子陽(yáng)性率在二次攻毒后21 d仍有25%，聯(lián)合免疫1組口咽試子陽(yáng)性率在二次攻毒后21 d下降為0%，聯(lián)合免疫1組口咽試子陽(yáng)性率在二次攻毒后1,3,7,14,21 d分別比單獨(dú)免疫1組減少了35%,33%,30%,42%和25%；對(duì)照2組口咽試子陽(yáng)性率在二次攻毒后第1 天達(dá)到85%，攻毒后3 d提高至最高值(100%)；空白1組雞口咽各時(shí)間點(diǎn)均沒有檢出NDV F48E9株，口咽試子陽(yáng)性率均為0%。

2.8 雞主要組織NDV F48E9株感染情況攻毒后雞主要組織NDV F48E9株感染情況檢測(cè)結(jié)果見表6。首次攻毒后，對(duì)照1組雞肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、法氏囊、盲腸扁桃體、腦等主要組織均有NDV F48E9株感染，陽(yáng)性率均為100%(20/20)。二次攻毒后，聯(lián)合免疫1組雞肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、法氏囊、盲腸扁桃體、腦等主要組織NDV F48E9株感染陽(yáng)性率比單獨(dú)免疫1組分別減少了30%,30%,35%,30%,40%,35%和30%，其中聯(lián)合免疫1組雞主要組織NDV F48E9株感染陽(yáng)性率為50%～60%，單獨(dú)免疫1組雞主要組織NDV F48E9株感染陽(yáng)性率為80%～95%。二次攻毒后，對(duì)照2組雞肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、法氏囊、盲腸扁桃體、腦等主要組織均有NDV F48E9株感染，陽(yáng)性率均為100%(20/20)?？瞻?組雞主要組織未檢出NDV F48E9株。

表6 攻毒后各組雞主要組織NDV F48E9株感染陽(yáng)性率 %

3 討論

TF是活性T淋巴細(xì)胞釋放的由核糖和多肽組成的一類可透析、可超濾的可溶性小分子物質(zhì)，可傳遞免疫信息、激活免疫細(xì)胞活性、增強(qiáng)機(jī)體特異性和非特異性免疫功能，是一種重要的免疫增強(qiáng)佐劑[9-16,20-21]。不同免疫劑量的La Sota弱毒株對(duì)不同攻毒劑量不同基因型NDV強(qiáng)毒的攻毒保護(hù)效果不同[22-23]，為評(píng)價(jià)TF對(duì)La Sota株活疫苗攻毒保護(hù)率的影響，本試驗(yàn)基于《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015年版雞NDV活疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中La Sota株活疫苗的效力檢驗(yàn)方法，采用0.01羽份La Sota株活疫苗點(diǎn)眼免疫14 d后，選擇高于《中華人民共和國(guó)獸藥典》規(guī)定的104.0ELD50F48E9株攻毒劑量，以104.7ELD50F48E9株進(jìn)行攻毒，觀察攻毒保護(hù)情況，結(jié)果顯示點(diǎn)眼免疫105.17EID50La Sota株弱毒疫苗后，單獨(dú)免疫1組和聯(lián)合免疫1組對(duì)104.7ELD50NDV F48E9株強(qiáng)毒的首次攻毒保護(hù)率均為100%。為了進(jìn)一步明確NDV La Sota株弱毒疫苗與TF聯(lián)合免疫的效力，本試驗(yàn)繼續(xù)提高攻毒劑量至109.1ELD50對(duì)單獨(dú)免疫1組和聯(lián)合免疫1組進(jìn)行二次攻毒，結(jié)果顯示單獨(dú)免疫1組和聯(lián)合免疫1組對(duì)109.1ELD50NDV F48E9株強(qiáng)毒的二次攻毒保護(hù)率分別為20%和50%，二次攻毒病死率分別為60%和40%。單獨(dú)免疫1組雞最早出現(xiàn)臨床癥狀的日齡和最早出現(xiàn)死亡的日齡均比聯(lián)合免疫1組提前1 d，病死雞的病程比聯(lián)合免疫1組縮短1 d，而其病愈雞恢復(fù)臨床健康的日齡比聯(lián)合免疫1組推遲3 d。本試驗(yàn)結(jié)果表明，TF可提高NDV La Sota株弱毒疫苗的攻毒保護(hù)率，為后續(xù)開展TF對(duì)不同基因型NDV疫苗免疫效力的影響及機(jī)理研究提供了參考。

TF具有無抗原性、無毒性、不產(chǎn)生對(duì)抗抗體、不引起過敏反應(yīng)及使用安全等優(yōu)點(diǎn)[9-16,20-21]，本試驗(yàn)也驗(yàn)證了TF使用安全，各組雞肌注TF未見不良反應(yīng)。已有研究顯示[24-25]，來源不同動(dòng)物T淋巴細(xì)胞的TF，其免疫增強(qiáng)作用不同，如雞脾TF對(duì)雞疫苗和雞免疫功能的免疫增強(qiáng)作用會(huì)高于豬脾TF。與此結(jié)果類似，本課題組已開展試驗(yàn)也顯示(待發(fā)表)，La Sota弱毒株與雞法氏囊素聯(lián)合免疫效力會(huì)明顯高于與豬脾TF聯(lián)合免疫效力，這是否與2種免疫增強(qiáng)劑來源動(dòng)物種屬差異有關(guān)則需要后續(xù)驗(yàn)證，為疫苗佐劑研發(fā)提供了參考。

NDV F48E9株以不同劑量攻毒導(dǎo)致雞臨床表現(xiàn)不同，相比首次攻毒104.7ELD50劑量時(shí)對(duì)照1組有70%的雞在首次攻毒后 3 d內(nèi)死亡，攻毒劑量提高至109.1ELD50時(shí)對(duì)照2組有95%的雞在二次攻毒后 3 d內(nèi)死亡且臨床發(fā)病癥狀更嚴(yán)重。本試驗(yàn)對(duì)不同毒株不同劑量NDV接種后雞免疫相關(guān)分子的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，其中淋巴細(xì)胞增殖率測(cè)定試驗(yàn)是檢測(cè)機(jī)體免疫功能的一項(xiàng)重要體外試驗(yàn)，T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平和B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平分別反映了機(jī)體的細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能。目前，T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平測(cè)定常用PHA-P或刀豆素A(ConA)作為T細(xì)胞絲裂原，B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平測(cè)定常用LPS、純蛋白衍生物結(jié)核菌素(PPD)或抗球蛋白作為B細(xì)胞絲裂原[13,18,26]。此前，本課題組試驗(yàn)已證實(shí)TF具有增強(qiáng)禽白血病病毒A/B亞群(avian leucosis virus subgroup A/B,ALV-A/B)抗體陽(yáng)性雞群外周血T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平的作用[13]，與此結(jié)果類似，本試驗(yàn)T、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平結(jié)果顯示，聯(lián)合免疫1組的PHA-P SI于免疫后、首次攻毒后、二次攻毒后比單獨(dú)免疫1組分別提高了0.10～0.13,0.08～0.24和0.13～0.25，并于免疫后7,14 d和首次攻毒后1,3,7,14 d及二次攻毒后1,3,7,14,21 d均極顯著高于其他組(P<0.01)；聯(lián)合免疫1組的LPS SI于免疫后、首次攻毒后、二次攻毒后比單獨(dú)免疫1組分別提高了0.04～0.16，0.06～0.18和 0.08～0.23，在免疫后14 d和首次攻毒后7,14 d及二次攻毒后3,7,14,21 d均極顯著高于單獨(dú)免疫1組(P<0.01)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，TF可提高NDV La Sota弱毒株、F48E9強(qiáng)毒株接種后雞外周血T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平。此外，單獨(dú)免疫1組的PHA-P SI在免疫后7 d和LPS SI在免疫后7,14 d極顯著高于對(duì)照1組、對(duì)照2組和空白1組(P<0.01)，表明NDV La Sota弱毒株可增強(qiáng)雞外周血T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平。首次攻毒后對(duì)照1組的PHA-P SI在第1 天、LPS SI在攻毒后1,3 d極顯著高于對(duì)照2組(P<0.01)，而二次攻毒后對(duì)照2組的PHA-P SI、LPS SI均與空白1組接近且差異不顯著，表明NDV F48E9株以不同劑量攻毒導(dǎo)致雞T和B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平不同。

ND HI抗體效價(jià)常用于衡量機(jī)體對(duì)ND免疫或感染的體液免疫反應(yīng)水平[27-28]。本實(shí)驗(yàn)室已有研究結(jié)果顯示[13-14]，TF點(diǎn)眼可將La Sota弱毒株免疫后7,14,21,28,35,42 d SPF雞的ND HI抗體效價(jià)提高1.1～1.4，將La Sota弱毒株免疫后 21 d ALV-A/B抗體陽(yáng)性雞群的ND HI抗體效價(jià)提高1.2左右，與此結(jié)果類似，本試驗(yàn)ND HI抗體效價(jià)結(jié)果顯示，聯(lián)合免疫1組的ND HI抗體效價(jià)于免疫后、首次攻毒后、二次攻毒后比單獨(dú)免疫1組分別提高了1.5～1.6,1.1～1.6和0.5～2.3，免疫后7,14 d和首次攻毒后1,3,7,14 d及二次攻毒后3,7,21 d極顯著高于單獨(dú)免疫1組(P<0.01)，表明TF可提高NDV La Sota弱毒株、F48E9強(qiáng)毒株接種后雞的ND HI抗體效價(jià)。ND HI抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果還顯示，各組雞首次攻毒后7,14 d的ND HI抗體效價(jià)均分別高于其免疫后7,14 d的ND HI抗體效價(jià)，各組雞二次攻毒后1,3,7,14 d的ND HI抗體效價(jià)均分別高于其首次攻毒后1,3,7,14 d的ND HI抗體效價(jià)，表明一定病毒量F48E9株感染后免疫雞的抗體水平會(huì)更高，F(xiàn)48E9強(qiáng)毒株感染的病毒量與感染后雞ND HI抗體效價(jià)具有一定正相關(guān)性，與已有報(bào)道類似[29]。

NDV F48E9株的病毒血癥檢測(cè)結(jié)果顯示，首次攻毒后，單獨(dú)免疫1組和聯(lián)合免疫1組的病毒血癥率均為0%，對(duì)照組1的病毒血癥率為100%，表明點(diǎn)眼免疫La Sota弱毒株可以阻止一定病毒量F48E9株攻毒后的病毒血癥。結(jié)果還顯示，單獨(dú)免疫1組在二次攻毒后1,3,7,14,21 d均有雞可檢出病毒血癥，且至21 d病毒血癥率仍有13%。相比之下二次攻毒后，聯(lián)合免疫1組的病毒血癥時(shí)間更短，于7 d后病毒血癥率即為0%，且聯(lián)合免疫1組病毒血癥率于二次攻毒后1,3,7,14,21 d分別比單獨(dú)免疫1組減少了35%,34%,38%,25%和13%，這些表明TF可降低攻毒后NDV F48E9株的病毒血癥率和病毒血癥時(shí)間。

減少NDV強(qiáng)毒感染后雞群的帶毒與排毒，是防控ND流行的關(guān)鍵[30]。V4、La Sota、MUKTESWAR等NDV疫苗株可誘導(dǎo)雞產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，降低ND的發(fā)病率和死亡率，但是不能有效阻止NDV強(qiáng)毒在體內(nèi)的復(fù)制和對(duì)體外的排毒[31-32]。雞主要組織NDV F48E9株感染情況檢測(cè)結(jié)果顯示，攻毒后對(duì)照1組和對(duì)照2組雞的肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、法氏囊、盲腸扁桃體、腦等主要組織均有NDV F48E9株感染，與其他學(xué)者研究結(jié)果類似[33]，而聯(lián)合免疫1組雞的主要組織NDV F48E9株感染陽(yáng)性率比單獨(dú)免疫1組分別減少了30%～40%，表明TF可降低攻毒后NDV F48E9株在雞體內(nèi)的復(fù)制。

此外，NDV F48E9株排毒情況檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)105.17EID50La Sota弱毒株點(diǎn)眼免疫的各組雞首次攻毒后，其泄殖腔試子和口咽試子均沒有檢測(cè)出排毒現(xiàn)象，表明La Sota弱毒株點(diǎn)眼免疫可以阻止一定病毒量F48E9株攻毒后的泄殖腔排毒和口咽排毒，與其他學(xué)者研究結(jié)果類似[22]。對(duì)比各組雞排毒時(shí)間結(jié)果顯示，單獨(dú)免疫1組雞的泄殖腔試子和口咽試子在二次攻毒后1,3,7,14,21 d均可以檢測(cè)出排毒。相比之下，聯(lián)合免疫1組的排毒時(shí)間更短，其泄殖腔試子僅在二次攻毒后1,3 ,7 d而口咽試子僅在二次攻毒后1,3,7,14 d可檢出NDV F48E9株，表明TF可降低NDV F48E9株攻毒后雞排毒時(shí)間。對(duì)比各組雞試子陽(yáng)性率結(jié)果顯示，二次攻毒后1,3,7,14,21 d相比單獨(dú)免疫1組，聯(lián)合免疫1組泄殖腔試子陽(yáng)性率分別減少了35%,36%,42%,38%和25%,而口咽試子陽(yáng)性率分別減少了35%,33%,30%,42%和25%，表明TF可降低NDV F48E9株攻毒后排毒雞比例。已有研究顯示，雞感染不同NDV強(qiáng)毒株后排毒規(guī)律不同[30,34]，其中，NDV F48E9株強(qiáng)毒感染后雞口咽排毒率比泄殖腔排毒率更高[35]。與此研究類似，在本試驗(yàn)中相比口咽試子陽(yáng)性率，對(duì)照1組雞的泄殖腔試子陽(yáng)性率在首次攻毒后1 d減少了20%，對(duì)照2組雞的泄殖腔試子陽(yáng)性率于二次攻毒后1 d減少了10%，單獨(dú)免疫1組和聯(lián)合免疫1組雞的泄殖腔試子陽(yáng)性率在二次攻毒后1,3,7,14 d均分別減少了8%～13%和8%～25%。結(jié)合各組雞的ND HI抗體和病毒血癥檢測(cè)結(jié)果分析顯示，二次攻毒后單獨(dú)免疫1組和聯(lián)合免疫1組的ND HI抗體效價(jià)均為陽(yáng)性且較高，此時(shí)F48E9強(qiáng)毒株如何在此高抗體水平的體內(nèi)環(huán)境中復(fù)制增殖、產(chǎn)生病毒血癥并通過泄殖腔和口咽排毒，仍需進(jìn)一步研究，這些為ND防控提供了參考。