消風止癢顆粒中防風薄層鑒別優(yōu)化

龐 威，樊 杰，孫繼澤，王艷娟，林禹欣，郭英俠，魯玉嬌，閆勝楠，紀天一，李 坤，趙理鵬，隋國奇

（吉林紫鑫藥業(yè)股份有限公司·吉林 通化·134000）

消風止癢顆?，F(xiàn)行質(zhì)量標準收載于《部頒標準》中藥成方制劑第十五冊，標準編號：WS3-B-2975-98，處方中包括防風、蟬蛻、地骨皮、蒼術(shù)（炒）、亞麻子、當歸、地黃、木通、荊芥、石膏和甘草十一味藥材。防風為方中君藥，是傘形科植物防風Saposhnikovia divaricata(Furcz.)Schischk的干燥根，辛、甘，微溫。歸膀胱、肝、脾經(jīng)。具有祛風解表，勝濕止痛，止痙的功效。用于感冒頭痛，風濕痹痛，風疹瘙癢，破傷風[1]。主要化學成分包括色原酮、香豆素、多糖以及揮發(fā)油等[2]。其中，色原酮是其主要活性成分，包括3'-O-當歸酰亥茅酚、3'-O-乙酰亥茅酚、亥茅酚、亥茅酚苷、5-O-甲基維斯阿米醇、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷等[3-4]。

原標準中收載了防風的薄層色譜鑒別項，但方法中未明確規(guī)定溶媒量、濾液濃縮體積、對照藥材取樣量及點樣量等參數(shù)，而且供試品溶液的制備存在黏度大、點樣困難等問題。優(yōu)化后的方法可靠，易于操作，可作為消風止癢顆粒中防風薄層鑒別項的質(zhì)量標準。

1 儀器與試藥

1.1 供試品

消風止癢顆粒：吉林省紫鑫藥業(yè)有限公司，批號：E190104、E190110、E190117、E190124、E190130、E190136、E190142、E190148、E190154、E190160。

1.2 對照品及對照藥材

防風對照藥材，批號：120947-201409，升麻素苷對照品，批號：111522－201712；5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品，批號：111523－201610，中國食品藥品檢定研究院。

1.3 試劑與儀器

紫外可見投射反射儀WFH-201BJ，上海精科實業(yè)有限公司；電子天平Y(jié)P1201，1/10，上海良平儀器儀表有限公司；電子天平SQP，1/10000，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；甲醇、正丁醇、氨水、丙酮、乙醇等試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 現(xiàn)行標準方法

取本品5g,加乙醇適量,加熱取5分鐘,放冷,濾過,濾液濃縮至適量作為供試品溶液;另取防風對照藥材,同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法試驗,取供試品溶液、對照藥材溶液分別點于同一含羧甲基纖維素鈉粘合劑的硅膠G薄層板上,以氯仿-醋酸乙酯(15∶4)為展開劑展開,取出,晾干,置紫外光燈(365nm)下檢視。

2.2 消風止癢顆粒中防風薄層鑒別改進方法試驗

2.2.1 薄層色譜條件以三氯甲烷-丙酮-甲醇（4∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，揮干。

2.2.2 供試品溶液制備

取本品10g，研細，加水30ml使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇飽和的氨試液50ml洗滌，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。

2.2.3 對照品溶液制備

取升麻素苷對照品、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品，加乙醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作為對照品溶液。

2.2.4 對照藥材溶液制備

原位雜交結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌組織中，miR-454-3p的表達水平顯著高于正常結(jié)腸組織。我們對原位雜交結(jié)果進行統(tǒng)計分析，分別取了5個高倍視野，計算了miR-454-3p陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例，結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中的miR-454-3p表達水平顯著高于正常結(jié)腸組織中的表達水平組間差異顯著（P＜0.05，圖1）。

取防風對照藥材0.5g，加丙酮30ml，超聲處理30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為對照藥材溶液。

2.2.5 鑒別試驗

按照薄層色譜法（《中國藥典》2020年版四部通則0502）試驗，吸取供試品溶液10μl、對照藥材溶液6μl及對照品溶液2μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，按照2.2.1項下薄層色譜條件進行，置紫外光燈（365nm）下檢視。

結(jié)果顯示：供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。且陰性對照溶液在相應的位置無干擾，詳見圖1。

圖1 優(yōu)化后防風TLC圖譜

2.3 薄層色譜條件的確定

2.3.1 供試品溶液制備方法

本次研究共篩選了5個供試品溶液制備方法，包括乙醇回流提取法、乙醇超聲提取法、丙酮超聲提取法、水溶解后乙醚-乙酸乙酯-水飽和正丁醇分段萃取法、水溶解后水飽和正丁醇萃取法。因本品含糖量較多，采用乙醇和丙酮直接提取法制備的供試品溶液存在粘度大、點樣量少、斑點顯現(xiàn)不清晰等問題，而采用萃取法，可以很大程度的避免上述問題，且隨著溶劑極性的增加，提取的物質(zhì)亦增多，同時考慮到方法的簡便、快捷及可操作性，最終選擇了水溶解后水飽和正丁醇萃取法作為防風薄層鑒別的供試品溶液制備方法。

2.3.2 展開劑的篩選

根據(jù)確定的供試品溶液制備方法，篩選了如下展開系統(tǒng)：①三氯甲烷-甲醇（4∶1）；②三氯甲烷-丙酮-甲醇（4∶1∶1）；③三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置的下層溶液。

結(jié)果：展開劑①和③分離效果不理想，陰性干擾；展開劑②分離效果好，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾。與此同時，我們對供試品取樣量（10、15、20g）和點樣量（6、8、10μl）進行了篩選，最終確定供試品的取樣量為10g，點樣量為10μl。詳見圖2、3。

圖2 防風鑒別取樣量考察TLC圖譜

圖3 防風鑒別點樣量考察TLC圖譜

2.4 專屬性實驗

按照標準正文方法制備供試品溶液 （批號：E190104、E190110、E190117）、對照藥材溶液、對照品溶液及陰性供試品溶液，并根據(jù)展開劑②的方法進行點樣、展開、顯色、檢視。結(jié)果：3批供試品色譜中，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應的位置上，均顯相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾，詳見圖1。

2.5 耐用性實驗

2.5.1 點樣方式考察

取供試品溶液按照標準正文項下方法進行試驗，考察條帶狀和圓點狀點樣方式對薄層色譜行為的影響。結(jié)果：按照上述不同點樣方式進行試驗，供試品色譜中目標斑點分離效果均較好，無明顯變化，詳見圖1、4。

圖4 耐用性考察試驗（圓形點樣）TLC圖譜

2.5.2 不同廠家薄層板考察

考察了三個不同生產(chǎn)廠家薄層預制板：①青島海洋化工有限公司（批號：20180312）；②青島海洋化工廠分廠（批號：20171225）；③青島鼎康硅膠有限公司（批號：20160322）。結(jié)果：經(jīng)三種不同廠家生產(chǎn)的薄層預制板對比試驗，供試品色譜中目標斑點分離效果均較好，詳見圖1（青島海洋化工有限公司）、圖5（青島海洋化工廠分廠）、圖6（青島鼎康硅膠有限公司）。

圖5 不同廠家薄層板考察TLC圖譜（青島海洋化工廠分廠）

圖6 不同廠家薄層板考察TLC圖譜（青島鼎康硅膠有限公司）

2.5.3 溫濕度條件考察

取供試品溶液按照標準正文項下方法進行試驗，考察下列不同溫濕度組合條件對薄層色譜行為的影響：①常溫常濕T：25℃RH：54%；②高溫高濕T：40℃RH：75%；③低溫低濕T：4℃RH：18%；④常溫高濕T：25℃RH：75%；⑤常溫低濕T：25℃RH：18%。

結(jié)果：按照上述不同溫濕度條件下進行試驗，溫度在4～40℃、相對濕度在18%～75%范圍內(nèi)，供試品色譜中目標斑點分離效果均較好，無明顯變化。詳見圖1、7、8、9、10。

圖7 溫濕度條件考察（高溫高濕）TLC圖譜圖

圖8 溫濕度條件考察（低溫低濕）TLC圖譜

圖9 溫濕度條件考察（常溫高濕）TLC圖譜圖

圖10 溫濕度條件考察（常溫低濕）TLC圖譜

2.6 重復性實驗

取10批供試品，按照標準正文項下方法進行試驗。結(jié)果：10批供試品色譜中，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應的位置上，均顯相同顏色的熒光斑點，詳見圖11。

圖11 防風鑒別重復性考察TLC圖譜

3 討論

以5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷及防風對照藥材為對照，共篩選了5種供試品溶液制備方法、多種展開條件，通過專屬性、耐用性及10批樣品重復性實驗。結(jié)果表明，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，均顯相同顏色的熒光斑點，陰性樣品無干擾。說明本方法具有較好的專屬性、耐用性及重復性，可作為消風止癢顆粒中防風的薄層鑒別方法。