lncRNA DLGAP1-AS2靶向miR-1193調(diào)控非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制研究①

曹淑琴 朱朝勇 陳維英 祁永花 張曉媛 徐建國(guó) （青海紅十字醫(yī)院腫瘤二病區(qū)，西寧 810000）

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌總發(fā)病率的85%，分子生物學(xué)技術(shù)和分子靶向治療的發(fā)展及實(shí)體腫瘤靶向治療水平的不斷提高給NSCLC患者帶來(lái)了希望［1-2］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）表達(dá)失調(diào)與NSCLC進(jìn)展有關(guān)，且在多種癌癥類型中發(fā)揮抑癌或癌基因作用［3］。DLGAP1反義RNA 2（DLGAP1 antisense RNA 2，DLGAP1-AS2）是一種胞質(zhì)lncRNA，研究報(bào)道lncRNA DLGAP1-AS2 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中上調(diào)，且與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)；敲低DLGAP1-AS2 不僅在體外抑制細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也在體內(nèi)抑制異種移植神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)［4］。抑制DLGAP1-AS2可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-154-5p甲基化抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲［5］。然而DLGAP1-AS2在NSCLC 中的作用及機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在線軟件預(yù)測(cè)DLGAP1-AS2 的靶基因，發(fā)現(xiàn)DLGAP1-AS2 與miR-1193 存在結(jié)合位點(diǎn)。研究報(bào)道m(xù)iR-1193 通過(guò)直接靶向跨膜9 超家族3（TM9SF3）抑制人T 細(xì)胞白血病細(xì)胞的增殖和侵襲［6］。LINC00963 通過(guò)調(diào)控通過(guò)miR-1193/SOX4 軸抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展［7］。miR-1193 對(duì)NSCLC 的影響也不明確。本實(shí)驗(yàn)旨在研究lncRNA DLGAP1-AS2 和miR-1193 對(duì)NSCLC 的影響及DLGAP1-AS2是否調(diào)控miR-1193。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本 選取青海紅十字醫(yī)院收治的49 例肺癌患者的癌組織及癌旁組織，距離癌組織邊緣2~5 cm 處切除的組織為癌旁組織，所有患者經(jīng)病理診斷確診，有完整的臨床病理資料，均知情同意。49例患者包含男30例，女19例，年齡39~76歲。鱗癌14例、腺癌23 例、大細(xì)胞癌2 例、混合細(xì)胞癌10 例。根據(jù)TNM 分期，Ⅰ期5 例、Ⅱ期9 例、Ⅲ期17 例、Ⅳ期18例。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 NSCLC 細(xì)胞株A549 購(gòu)自美國(guó)ATCC；RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；SYBR Premix ExTaqTM試劑盒自日本TaKaRa 公司；MTT 試劑盒、凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本同仁研究所；全蛋白提取試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞處理與分組 NSCLC 細(xì)胞A549 常規(guī)培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基，將DLGAP1-AS2抑制表達(dá)載體質(zhì)粒及陰性對(duì)照、miR-1193 模擬物基因型及對(duì)照轉(zhuǎn)染至A549 細(xì)胞，記為si-DLGAP1-AS2 組、si-NC組、miR-1193組、miR-NC組；將DLGAP1-AS2抑制表達(dá)載體質(zhì)粒分別與miR-1193 抑制劑及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至A549 細(xì)胞，記為si-DLGAP1-AS2+anti-miR-1193組、si-DLGAP1-AS2+anti-miR-NC組。

1.2.2 RT-qPCR 檢測(cè)DLGAP1-AS2 和miR-1193 的表達(dá)水平 提取癌組織及細(xì)胞總RNA，合成cDNA后以其為模板按SYBR Premix ExTaqTM試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR，以GAPDH 和U6為內(nèi)參。PCR 反應(yīng)體系：2 μl 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μl SYBR Green Mix、正反向引物各0.5 μl、7 μl 無(wú)菌水；循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)；熔解曲線：95 ℃15 s，60 ℃15 s，95 ℃15 s。相對(duì)表達(dá)量采用2?ΔΔCt法計(jì)算。DLGAP1-AS2正向引物：5'-ACACGGTGAAACCCTGTCTC-3'，反向引物：5'-GGAGAACAATGGCGTGATCT-3'；GAPDH正向引物：5'-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3'，反向引物：5'-CAGGTCACATACACGGTTGC-3'；miR-1193正向引物：5'-GGGATGGTAGACCGGTGACGTGC-3'，反向引物：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；U6正向引物：5'-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3'，反向引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3'。

1.2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后每孔加入MTT 溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄去各孔液體，再加入200μl二甲基亞砜反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度（OD）值。

1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)克隆形成數(shù) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/ml，將其接種于6 孔板，培養(yǎng)2 周出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)終止培養(yǎng)，甲醇固定后采用吉姆薩染色30 min，于低倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的集落。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 洗滌2 次，加入300μl 結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，然后加入5 μl Annexin V-FITC 和PI，混勻，避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 Western blot 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，取部分蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉，加入cleavedcaspase3、cleaved-caspase9 一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜，加入二抗在室溫下孵育2 h，曝光顯影、定影，分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 使用PCR 擴(kuò)增包含miR-1193 結(jié)合位點(diǎn)的DLGAP1-AS2 序列片段，并構(gòu)建至熒光素酶表達(dá)載體中，獲得DLGAP1-AS2 野生型載體（WT-DLGAP1-AS2），將DLGAP1-AS2 序列AUUUCCAGAACAUACCAUCC 突變?yōu)镚UUGUAAU‐AAUAGCUAGGAU，獲得DLGAP1-AS2 突變型載體（MUT-DLGAP1-AS2），將WT-DLGAP1-AS2、MUTDLGAP1-AS2 分別與miR-NC、miR-1193 共轉(zhuǎn)染至A549 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，兩組間比較行t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DLGAP1-AS2 和miR-1193 在NSCLC 組織中的表達(dá) NSCLC組織中DLGAP1-AS2表達(dá)水平高于癌旁組織，miR-1193 表達(dá)水平低于癌旁組織（P<0.05，表1）。

表1 DLGAP1-AS2 和miR-1193 在NSCLC 組織中的表達(dá)（±s，n=49）Tab.1 Expressions of DLGAP1-AS2 and miR-1193 in NSCLC tissues（±s，n=49）

表1 DLGAP1-AS2 和miR-1193 在NSCLC 組織中的表達(dá)（±s，n=49）Tab.1 Expressions of DLGAP1-AS2 and miR-1193 in NSCLC tissues（±s，n=49）

Note：Compared with adjacent tissues，1）P<0.05.

miR-1193 1.00±0.06 0.34±0.031）68.871 0.000 Groups Adjacent tissues NSCLC tissues t P DLGAP1-AS2 1.00±0.08 4.52±0.311）76.962 0.000

2.2 抑制DLGAP1-AS2 表達(dá)對(duì)NSCLC A549 細(xì)胞增殖的影響 與si-NC 組相比，si-DLGAP1-AS2 組DLGAP1-AS2 表達(dá)水平降低，A549 細(xì)胞活性降低，克隆形成數(shù)減少（P<0.05，表2）。

表2 抑制DLGAP1-AS2 表達(dá)對(duì)A549 細(xì)胞增殖的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of inhibiting expression of DLGAP1-AS2 on proliferation of A549 cells（±s，n=9）

表2 抑制DLGAP1-AS2 表達(dá)對(duì)A549 細(xì)胞增殖的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of inhibiting expression of DLGAP1-AS2 on proliferation of A549 cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05.

Cell clone formation 107.59±11.59 43.77±4.591）15.359 0.000 Groups DLGAP1-AS2 si-NC si-DLGAP1-AS2 t P 1.00±0.07 0.34±0.041）24.559 0.000 OD value（490 nm）0.83±0.06 0.43±0.041）16.641 0.000

2.3 抑制DLGAP1-AS2 表達(dá)對(duì)NSCLC A549 細(xì)胞凋亡的影響 與si-NC 組相比，si-DLGAP1-AS2 組A549 細(xì)胞凋亡率及cleaved-caspase3、cleaved-cas‐pase9蛋白表達(dá)水平均升高（P<0.05，圖1、表3）。

圖1 抑制DLGAP1-AS2表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effect of inhibiting expression of DLGAP1-AS2 on apoptosis of A549 cell

表3 抑制DLGAP1-AS2 表達(dá)對(duì)A549 細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of inhibiting expression of DLGAP1-AS2 on apoptosis of A549 cell（±s，n=9）

表3 抑制DLGAP1-AS2 表達(dá)對(duì)A549 細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of inhibiting expression of DLGAP1-AS2 on apoptosis of A549 cell（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05.

cleaved-cas‐pase9 protein 0.21±0.02 0.65±0.051）24.512 0.000 Groups si-NC si-DLGAP1-AS2 t P Apoptosis rate（%）7.12±0.68 24.19±2.211）22.119 0.000 cleaved-cas‐pase3 protein 0.31±0.03 0.78±0.061）21.019 0.000

2.4 DLGAP1-AS2 靶向調(diào)控miR-1193 表達(dá) Star‐Base 預(yù)測(cè)顯示DLGAP1-AS2 的序列中含有與miR-1193 互補(bǔ)的核苷酸序列（圖2）；WT-DLGAP1-AS2 與miR-1193 共轉(zhuǎn)染的A549 細(xì)胞熒光素酶活性降低（P<0.05），MUT-DLGAP1-AS2 與miR-1193 共轉(zhuǎn)染的A549 細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)明顯變化（表4）。過(guò)表達(dá)DLGAP1-AS2 后miR-1193 表達(dá)水平降低，抑制DLGAP1-AS2 表達(dá)后miR-1193 表達(dá)水平升高（P<0.05，表5）。

圖2 DLGAP1-AS2與miR-1193互補(bǔ)的核苷酸序列Fig.2 Complementary nucleotide sequence of DLGAP1-AS2 and miR-1193

表4 miR-1193 與DLGAP1-AS2 野生型、突變型載體共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性（±s，n=9）Tab.4 Luciferase activity after co-transfection of miR-1193 with DLGAP1-AS2 wild-type and mutant vector（±s，n=9）

表4 miR-1193 與DLGAP1-AS2 野生型、突變型載體共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性（±s，n=9）Tab.4 Luciferase activity after co-transfection of miR-1193 with DLGAP1-AS2 wild-type and mutant vector（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

WT-DLGAP1-AS2 1.03±0.08 0.55±0.051）15.264 0.000 MUT-DLGAP1-AS2 1.02±0.07 1.00±0.05 0.697 0.496 Groups miR-NC miR-1193 t P

表5 DLGAP1-AS2調(diào)控miR-1193的表達(dá)（±s，n=9）Tab.5 DLGAP1-AS2 regulates expression of miR-1193（±s，n=9）

表5 DLGAP1-AS2調(diào)控miR-1193的表達(dá)（±s，n=9）Tab.5 DLGAP1-AS2 regulates expression of miR-1193（±s，n=9）

Note：Compared with pcDNA group，1）P<0.05；compared with si-NC group，2）P<0.05.

miR-1193 1.00±0.07 0.41±0.031）0.99±0.04 2.58±0.212）606.874 0.000 Groups pcDNA pcDNA-DLGAP1-AS2 si-NC si-DLGAP1-AS2 F P

2.5 miR-1193 過(guò)表達(dá)對(duì)NSCLC A549 細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與miR-NC 組相比，miR-1193 組A549細(xì)胞活性降低，克隆形成數(shù)減少，細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3、cleaved-caspase9 表達(dá)水平升高（P<0.05，圖3、表6）。

表6 miR-1193過(guò)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.6 Effect of miR-1193 overexpression on proliferation and apoptosis of A549 cells（±s，n=9）

表6 miR-1193過(guò)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.6 Effect of miR-1193 overexpression on proliferation and apoptosis of A549 cells（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

cleaved-caspase9 protein 0.22±0.02 0.59±0.051）20.612 0.000 Groups miR-1193 OD value（490 nm）Cell clone formation Apoptosis rate（%）miR-NC miR-1193 t P 1.00±0.06 3.74±0.211）37.637 0.000 0.85±0.07 0.53±0.041）11.907 0.000 109.07±12.68 56.24±4.081）11.898 0.000 6.77±0.64 19.61±1.891）19.304 0.000 cleaved-caspase3 protein 0.29±0.03 0.72±0.051）22.123 0.000

圖3 miR-1193過(guò)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of miR-1193 overexpression on apoptosis of A549 cells

2.6 干擾miR-1193 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制DLGAP1-AS2表達(dá)對(duì)NSCLC A549 細(xì)胞增殖和凋亡的作用 與si-DLGAP1-AS2+anti-miR-NC 組相比，si-DLGAP1-AS2+anti-miR-1193 組A549 細(xì)胞活性升高，A549 細(xì)胞的克隆形成數(shù)增加，細(xì)胞凋亡率及cleaved-cas‐pase3、cleaved-caspase9 表達(dá)水平降低（P<0.05，圖4、表7）。

圖4 干擾miR-1193 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制DLGAP1-AS2 表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞凋亡的作用Fig.4 Interference with miR-1193 expression reverses the effect of inhibiting DLGAP1-AS2 expression on apoptosis of A549 cells

表7 干擾miR-1193表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制DLGAP1-AS2表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡的作用（±s，n=9）Tab.7 Interference with miR-1193 expression reverses the effect of inhibiting DLGAP1-AS2 expression on proliferation and apoptosis of A549 cells（±s，n=9）

表7 干擾miR-1193表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制DLGAP1-AS2表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡的作用（±s，n=9）Tab.7 Interference with miR-1193 expression reverses the effect of inhibiting DLGAP1-AS2 expression on proliferation and apoptosis of A549 cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-DLGAP1-AS2+anti-miR-NC group，1）P<0.05.

cleaved-caspase9 protein 0.67±0.05 0.32±0.041）16.398 0.000 Groups miR-1193 si-DLGAP1-AS2+anti-miR-NC si-DLGAP1-AS2+anti-miR-1193 t P 1.00±0.07 0.26±0.021）30.494 0.000 OD value（490 nm）0.42±0.04 0.75±0.051）15.461 0.000 Cell clone formation 41.92±4.11 84.05±7.381）14.962 0.000 Apoptosis rate（%）26.23±2.18 13.79±1.261）14.822 0.000 cleaved-caspase3 protein 0.79±0.05 0.41±0.041）17.804 0.000

3 討論

靶向治療的出現(xiàn)使NSCLC 的治療方式發(fā)生巨大變化，改善了患者的生活質(zhì)量及生存期，深入研究NSCLC 機(jī)制，開發(fā)新的靶點(diǎn)對(duì)其靶向治療具有重要意義［8-9］。lncRNA 和miRNA 均屬于非編碼RNA，研究表明，非編碼RNA 可作為可靠的生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)，從而促進(jìn)更有效的癌癥治療和更好的患者預(yù)后生存［10］。研究報(bào)道DLGAP1-AS2 與Wilms 患者的生存率顯著相關(guān)，可作為其預(yù)后標(biāo)志物［11］。DLGAP1-AS2 的高表達(dá)與膽管癌患者的不良預(yù)后相關(guān)；DLGAP1-AS2 通過(guò)調(diào)控miR-505 和GALNT10 促進(jìn)膽管癌進(jìn)展［12］。DLGAP1-AS2 在胃癌患者癌組織及血漿中的表達(dá)水平均明顯升高；敲減DLGAP1-AS2 可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NSCLC 組織中DLGAP1-AS2 表達(dá)水平升高，提示DLGAP1-AS2 可能在NSCLC 中發(fā)揮促癌作用。進(jìn)一步抑制DLGAP1-AS2 表達(dá)后，A549 細(xì)胞活性降低，克隆形成數(shù)減少，A549細(xì)胞凋亡率升高，cleaved-caspase3、cleaved-caspase9 蛋白表達(dá)水平升高，表明抑制DLGAP1-AS2表達(dá)可抑制A549細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。提示DLGAP1-AS2 在肺癌中與在其他癌癥中的作用一致?？赡茏鳛榉伟z測(cè)、治療的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。

研究報(bào)道m(xù)iR-1193 的強(qiáng)制表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移［14］。miR-1193 還可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［15］。說(shuō)明miR-1193在不同癌癥中均發(fā)揮抑癌作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NSCLC 組織中miR-1193 表達(dá)水平降低；提示miR-1193 或與NSCLC 的發(fā)生有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)過(guò)表達(dá)miR-1193 后A549 細(xì)胞活性降低，克隆形成數(shù)減少，A549細(xì)胞凋亡率升高，cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表達(dá)水平升高，表明過(guò)表達(dá)miR-1193 可抑制A549 細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；提示miR-1193 在NSCLC 中同樣起抑癌基因作用。且本研究發(fā)現(xiàn)DLGAP1-AS2 可靶向調(diào)控miR-1193；而干擾miR-1193 表達(dá)則減弱了抑制DLGAP1-AS2 表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡的作用。提示DLGAP1-AS2可能通過(guò)調(diào)控miR-1193影響NSCLC細(xì)胞的增殖和凋亡。

綜上所述，抑制lncRNA DLGAP1-AS2表達(dá)可能通過(guò)靶向上調(diào)miR-1193 抑制NSCLCA549 細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡。