枸杞多糖調控Wnt信號通路對子宮肌瘤細胞生物活性的影響

譚建福 饒麗娟 （南華大學附屬長沙中心醫(yī)院婦產科，長沙 410004）

子宮肌瘤是女性高發(fā)的非惡性腫瘤疾病，由子宮平滑肌增生導致，30~50 歲女性是高發(fā)人群，患者臨床主要以腹部疼痛及月經量增多為主［1］。流行病調查顯示，子宮肌瘤發(fā)病率占女性腫瘤的50%以上，被稱為婦科第一瘤［2］。子宮肌瘤影響因素較多，包含雌激素和性激素等，同時受局部多肽類物質影響，在生育期產生，絕經期腫瘤病灶逐漸萎縮。文獻證實，子宮肌瘤雖然不會導致患者死亡，但臨床疼痛及其他癥狀會影響患者身心健康及生存質量［3］。Wnt 信號通路參與子宮肌瘤產生及發(fā)展，主要通過調節(jié)β-catenin 磷酸化和降解，導致β-catenin在細胞核內聚集，與受體結合時，細胞質中的β-catenin移位到細胞核中進而激活靶基因。相關研究表示，Wnt信號通路抑制劑能夠通過減少子宮肌瘤細胞中細胞質和細胞核中β-catenin 表達進而下調與通路相關的靶基因［4］。因此，了解Wnt 信號通路在子宮肌瘤中的作用對臨床研究具有重要意義。

中藥在抗腫瘤研究中發(fā)揮關鍵作用，枸杞歸肝腎經，性微寒無毒，味甘、平，具有滋腎、明目等功效。枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharides，LBP）是枸杞的主要成分，能夠通過增加淋巴細胞功能提高免疫功能，具有抗氧化、抗腫瘤的作用［5］。目前對子宮肌瘤細胞的研究文獻較少，因此，本文以此作為創(chuàng)新點，觀察LBP 對子宮肌瘤細胞生物活性、Wnt信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 選擇2019年1月至2020年1月，在南華大學附屬長沙中心醫(yī)院婦產科室進行子宮肌瘤剔除術的10 例患者，平均年齡（43.50±1.50）歲，術前未經全身治療，將子宮肌瘤組織置于青鏈霉素的預冷D-Hanks 溶液中保存，后進行實驗室分離培養(yǎng)子宮肌瘤細胞。

1.1.2 實驗動物、藥品、主要試劑與儀器 健康SD大鼠30只購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，SPF 級，雌性未孕。LBP（含量50%，批號：2014 1208）購自寧夏宏德生物技術；DMEM 培養(yǎng)基購自中國深圳市百恩維生物；胎牛血清購自加拿大Hy‐clone公司；Wnt5b和β-catenin抗體購自Abcam；MTT試劑盒、二甲基亞砜（DMSO）購自上海研謹生物科技；TRIzol 購自北京柏萊斯特科技。蛋白電泳儀購自北京由萊普特科學儀器；RT-PCR 試劑盒和儀器購自上?？道噬锟萍肌?/p>

1.2 方法

1.2.1 子宮肌瘤大鼠建模及藥物干預 30 只健康SD大鼠，隨機分為5組：對照組、模型組、LBP低劑量組、中劑量組和高劑量組每組6只。除對照組外，其余各組大鼠肌內注射苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/kg，每周3 次，共12 周，繼而肌內注射黃體酮注射液5 mg/kg，每周2 次，共4 周，大鼠子宮重量、子宮系數(shù)明顯提高，子宮平滑肌形態(tài)紊亂，子宮形態(tài)學改變類似于人體子宮肌瘤病理形態(tài)學結構，提示造模成功，對照組在相同時間給予等量生理鹽水。造模結束后，低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠分別給予10、50和100 mg/kg LBP灌胃，1次/d，連續(xù)14 d，對照組和模型組大鼠相同時間內給予相同劑量的生理鹽水灌胃。

1.2.2 大鼠子宮系數(shù)計算 實驗結束后，頸椎脫臼處死大鼠，分離大鼠子宮，稱量，計算子宮系數(shù)，子宮系數(shù)（%）=子宮重量/體質量×100%。

1.2.3 人子宮肌瘤組織分離及子宮肌瘤細胞培養(yǎng) 將保存的子宮肌瘤組織中瘤核去除，預冷DHanks 溶液清洗表層血污，剪切成小塊放入離心管中，15%消化液消化，水浴后搖晃消化，連續(xù)5 次，每隔1 h 收集濾液（200 目過濾），將離心機調整至3 000 r/min離心5 min，棄上清，預冷D-Hanks溶液沉淀檢測存活率。細胞培養(yǎng)：放入培養(yǎng)基中制成細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，生長至85%~90%融合時，1∶3傳代，取對數(shù)細胞進行實驗。

1.2.4 細胞分組及藥物干預 取對數(shù)生長細胞，細胞密度為5×105個/ml，將細胞隨機分為4 組：子宮肌瘤組、低LBP 組、中LBP 組和高LBP 組，每組設置6 個復孔。藥物干預：子宮肌瘤組加入等量的生理鹽水，低、中、高LBP 組分別加入100、200、400 μg/ml的LBP，連續(xù)干預72 h。

1.2.5 MTT 法檢測子宮肌瘤細胞存活率 傳代方法將子宮肌瘤細胞以5×105個/ml 接種至96 孔板，更換含1%牛血清的培養(yǎng)基中同步消化后，每組設6個復孔，均加入5 mg/ml 的MTT 溶液20 μl，培養(yǎng)24 h、48 h 及72 h 后，棄培養(yǎng)液，每孔中加入50μl DMSO，搖勻后放入490 nm 波長下檢測OD 值，取3 次平均值，細胞存活率（%）=［A加藥?A凋零］/［A對照?A凋零］×100%。

1.2.6 流式細胞儀檢測子宮肌瘤細胞凋亡率 5×105個/ml 子宮肌瘤細胞以0.125%胰蛋白酶消化后，置于PBS 溶液，予以洗滌，將離心機調整為3 000 r/min 離心5 min后，收集100μl細胞懸液后進行重懸，5 μl 的FITC AnnexinⅤ與5 μl PI 混合后染色，無光條件下，孵育15 min 后注入400 μl 結合緩沖液混勻，洗滌3次后記錄細胞凋亡情況。

1.2.7 Transwell 小室檢測子宮肌瘤細胞遷移和侵襲 5×105個/ml 子宮肌瘤細胞以50 mg/L 的基質膠稀釋后加入小室上層，37 ℃下呈凝膠狀態(tài)，上室中加入細胞懸液，下室中加入少量胎牛血清培養(yǎng)基，拭去殘留細胞，0.1%結晶紫染色，計算子宮肌瘤侵襲細胞數(shù)。

1.2.8 Western blot 檢測子宮肌瘤細胞Wnt5b 和β-catenin 蛋白表達 5×105個/ml 子宮肌瘤細胞以0.125%胰蛋白酶消化，高速離心后，保留血清樣本。進行電泳，轉至PVDF膜，TBS浸泡10 min，反復PBS 沖洗，5 min/次，分別加入兔抗人單克隆抗體Wnt5b、β-catenin 和GAPDH 抗體（1∶500），二抗（1∶2 000），分別雜交，PBS 沖洗3 次。將膜浸入ECL 工作液進行檢測，獲取圖像。

1.2.9 qRT-PCR 檢測子宮肌瘤細胞Wnt5b 和β-catenin mRNA 5×105個/ml 子宮肌瘤細胞以0.125%胰蛋白酶消化，沖洗后置于無菌試管中，提取RNA，75%乙醇離心，?80 ℃保存。將RNA轉化為cDNA，加入Wnt5b和β-catenin抗體，內參采用β-actin，60 ℃預變性10 min，95 ℃變性，72 ℃退火，各30 s，95 ℃延伸，5 min，循環(huán)次數(shù)以40 次為準，2?ΔΔCt方法計算各組肺組織中Wnt5b 和β-catenin mRNA 相對表達水平，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計學分析 研究數(shù)據(jù)采用SPSS23.0軟件分析，計量資料以±s表示，3 組及以上比較方差分析（單因素方法分析、重復測量方差分析），兩組比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠子宮系數(shù)比較 與對照組相比，模型組大鼠體質量降低，子宮重量、子宮系數(shù)提高（P<0.05），與模型組相比，低、中及高劑量組大鼠子宮重量、子宮系數(shù)均降低，體質量增加，組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠子宮系數(shù)比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of rats uterine coefficients in each group（±s，n=6）

表2 各組大鼠子宮系數(shù)比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of rats uterine coefficients in each group（±s，n=6）

Note：1）P<0.05 vs control group；2）P<0.05 vs model group；3）P<0.05 vs LBP low-dose group；4）P<0.05 vs LBP medium-dose group.

Groups Weight/g Uterine weight/g Control Model LBP low-dose LBP medium-dose LBP high-dose F Pe 332.05±26.35 268.25±18.551）296.33±21.501）2）0.580±0.121 1.478±0.4151）1.350±0.3351）2）Uterine coefficient（%）0.176±0.043 0.580±0.1101）0.430±0.0951）2）290.27±19.661）2）3）1.189±0.3051）2）3）0.383±0.0861）2）3）0.371±0.0901）2）3）4）3.711<0.001 285.20±24.051）2）3）4）4.667 0.006 1.022±0.2261）2）3）4）8.241 0.001

2.2 CCK-8檢測各組子宮肌瘤細胞存活率 CCK-8檢測結果顯示：低、中、高LBP 組24 h、48 h及72 h子宮肌瘤存活率均低于子宮肌瘤組（P均<0.05），子宮肌瘤組在24 h、48 h 及72 h 時差異無統(tǒng)計學意義（P均>0.05），低、中、高LBP 組在24 h細胞存活率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），其余時間點均具有統(tǒng)計學意義（P均<0.05），見表3、圖1。

圖1 各組子宮肌瘤細胞存活率Fig.1 Survival rate of uterine fibroids in each group

表3 各組子宮肌瘤細胞存活率比較（±s）Tab.3 Comparison of cell survival rate of uterine fi?broids in each group（±s）

表3 各組子宮肌瘤細胞存活率比較（±s）Tab.3 Comparison of cell survival rate of uterine fi?broids in each group（±s）

Note：1）P<0.05 vs uterine fibroids group；2）P<0.05 vs low LBP group；3）P<0.05 vs middle LBP group.

72 h 96.21±2.05 48.10±5.011）32.15±2.071）2）19.60±3.571）2）3）583.200<0.001 Groups Uterine fibroids LBP low-dose LBP medium-dose LBP high-dose F P 24 h 95.60±2.33 71.20±3.051）68.02±4.771）66.30±4.401）79.220<0.001 48 h 96.60±2.05 59.02±4.111）50.20±3.661）2）45.04±2.331）2）3）326.800<0.001

2.3 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率 流式細胞術結果顯示：低、中、高LBP 組子宮肌瘤凋亡率分別為（15.48±1.20）%、（26.37±2.33）%及（42.37±4.12）%，均高于子宮肌瘤組［（4.58±0.20）%，F(xiàn)=205.000，P均<0.05］，低、中、高LBP 組兩兩相比子宮肌瘤細胞凋亡率比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖2。

圖2 流式細胞儀檢測子宮肌瘤細胞凋亡率Fig.2 Flow cytometry to detect apoptosis rate of uterine fibroids

2.4 Transwell 檢測各組子宮肌瘤細胞侵襲數(shù)目 Transwell 小室結果顯示：低、中、高LBP 組子宮肌瘤細胞侵襲數(shù)目均低于子宮肌瘤組（均P<0.05），低、中、高LBP 組兩兩相比子宮肌瘤細胞侵襲數(shù)目均有差距（P均<0.05），見圖3。

圖3 各組子宮肌瘤細胞侵襲數(shù)目比較Fig.3 Comparison of number of uterine fibroids cell inva?sion in each group

2.5 各組子宮肌瘤細胞中Wnt5b 和β-catenin 蛋白水平比較 Western blot 結果顯示：子宮肌瘤組細胞中Wnt5b 和β-catenin 蛋白水平表達均高于低、中、高LBP 組（均P<0.05），低、中、高LBP 組Wnt5b 和β-catenin 蛋白水平逐漸降低，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖4。

圖4 各組子宮肌瘤細胞中Wnt5b 和β-catenin 蛋白水平比較Fig.4 Comparison of Wnt5b and β-catenin protein levels in uterine fibroids in each group

2.6 qRT-PCR 檢測各組子宮肌瘤細胞中Wnt5b 和β-catenin mRNA表達 RT-PCR檢測結果顯示：子宮肌瘤組細胞中Wnt5b和β-catenin mRNA相對表達量高于低、中及高LBP 組（P均<0.05），低、中、高LBP組Wnt5b 和β-catenin mRNA 相對表達量逐漸降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖5。

圖5 各組子宮肌瘤細胞中Wnt5b和β-catenin mRNA比較Fig.5 Comparison of Wnt5b and β-catenin mRNA in uterine fibroids in each group

3 討論

既往研究證實能夠通過干擾內源激素水平提高子宮肌瘤細胞凋亡率，改善病情。按照隋·巢元方在《諸病源候論》中記載，中醫(yī)認為子宮肌瘤的產生與“寒濕不調，飲食失節(jié)及臟氣相搏”相關，利用中藥材治療子宮肌瘤已經成為醫(yī)學界研究的熱點［6］。LBP 是一種生物活性物質，為枸杞進行提取純化而獲得，為淡黃色纖維狀固體，可輔助用于多種中藥制劑發(fā)揮作用［7］。本文通過建立子宮肌瘤大鼠模型，采用10、50 和100 mg/kg 的LBP 灌胃，14 d后發(fā)現(xiàn)大鼠子宮腫瘤及系數(shù)降低，體質量增加，說明LBP 能夠通過減少腫瘤體積而降低子宮重量。黃霞等［8］體外培養(yǎng)人肝癌HepG2 細胞株，采用LBP干預72 h 時能夠顯著抑制細胞活性，加快凋亡，且存在濃度依賴性，證實LBP 具有抗腫瘤功效。本研究從子宮肌瘤病理組織中分離和培養(yǎng)子宮肌瘤細胞，無菌操作，制備出重復性好、穩(wěn)定性高的子宮肌瘤細胞。

子宮肌瘤是主要由平滑肌演變細胞分裂產生的良性腫瘤，細胞增殖是子宮肌瘤形成的影響因素。子宮肌瘤細胞生長受多種生長信號通路調節(jié)，通過改變子宮肌瘤細胞中遺傳因子而降低抑制腫瘤生長信號的活性，子宮肌瘤細胞增殖失控［9-10］。實驗了解到子宮肌瘤細胞孕激素表達上調，能夠抑制線粒體凋亡信號Bcl-2水平，發(fā)現(xiàn)其水平升高可能是子宮肌瘤細胞增殖的主要原因。凋亡是細胞最顯著的生物學特征，細胞受到內在基因調控時主要發(fā)生自殺的現(xiàn)象，但細胞凋亡失控時能夠誘導腫瘤產生［11］。子宮肌瘤細胞存在凋亡抑制，因此，增加其凋亡率對于改善病情具有一定作用。子宮肌瘤細胞侵襲是指從原發(fā)部位將周圍組織浸潤的過程，王一飛等［12］證實子宮肌瘤細胞存在侵襲性，主要由MMPs 激活發(fā)揮細胞外基質降解作用，該過程是腫瘤細胞發(fā)生侵襲的基礎條件。中藥因其來源廣泛的特點在治療子宮肌瘤中發(fā)揮主要作用。LBP能夠顯著改善大鼠子宮組織病理，下調血清性激素水平，證實具有治療子宮肌瘤的作用［13］。本研究表明LBP 能夠降低子宮肌瘤細胞生物活性，凋亡率隨著LBP濃度升高而增加，侵襲數(shù)目降低，存在濃度依賴性，且與LBP 藥物干預子宮肌瘤組細胞存在差異。證實LBP 能夠抑制子宮肌瘤細胞生物活性。王曉麗等［14］表示，在子宮內膜損傷動物模型中，采用LBP干預后，子宮內膜組織損傷改善，雌激素水平降低，證實其具有保護子宮和卵巢作用。本研究表明LBP可抗子宮肌瘤細胞增殖，加快凋亡其機制可能在于通過調節(jié)p53、Bcl-2、Bax 表達而發(fā)揮作用。代海平等［15］表示LBP 在AS 動物模型中具有抑制MMP-2 和血管生成因子的作用。本研究推測LBP 發(fā)揮抗子宮肌瘤細胞侵襲的作用可能是通過改變子宮肌瘤細胞基質降解能力實現(xiàn)。

在正常細胞中，Wnt信號通路表達沉默，當受到癌基因調節(jié)活化，能夠導致腫瘤細胞生長失控而促進腫瘤形成。經典信號通路中Wnt 能夠結合β-catenin 蛋白的核易位活化靶向目標的轉錄活性，而發(fā)揮促癌作用［16］。在子宮肌瘤組織中存在Wnt信號通路表達異常，在對Wnt 信號通路進行關節(jié)基因篩查時發(fā)現(xiàn)，Wnt5b、β-catenin 水平升高而在正常組織中無表達。Wnt5b 存在于細胞質中，參與胚胎發(fā)育及疾病生理發(fā)展。瞿秋紅等［17］和張瀟迪等［18］研究子宮肌瘤組織檢測Wnt5b 呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。β-catenin 是一種存在細胞膜中的蛋白，發(fā)揮細胞信號轉導作用，在子宮肌瘤細胞中能夠激活Wnt信號，游離的β-catenin 表達上調，惡化病情。槲皮素能夠通過下調宮頸癌細胞Wnt5b 和β-catenin 表達水平，從而減少子宮肌瘤細胞生物活性［19］。說明外源性干預能夠通過抑制Wnt5b 和β-catenin 含量而改善病情。LBP對于Wnt/β-catenin信號通路的研究在不同疾病中作用不同，在腦缺血再灌注實驗大鼠空腹注射LBP 后能夠上調Wnt/β-catenin 表達而改善病情［20］。本文研究與之不同，可能與疾病類型及LBP廣泛的藥理作用相關。本文研究發(fā)現(xiàn)低、中及高LBP 組Wnt5b 和β-catenin 含量均低于子宮肌瘤組，說明LBP 能夠降低Wnt5b 和β-catenin 表達改善疾病。研究機制可能在于LBP 能夠上調子宮肌瘤某種抑癌基因，降低性激素水平，對Wnt/β-catenin 信號通路發(fā)揮抑制作用，而降低子宮肌瘤細胞活性。

本研究存在局限性，實驗時間及經費受限，采用的實驗方法較為單一，動物實驗樣本量較小，未采用藥物對照組，結果存在一定的局限性，后期本課題組會加強和其他相關研究單位合作，細化實驗內容，為子宮肌瘤的臨床研究提供參考依據(jù)。綜上所述：LBP能夠降低子宮重量及系數(shù)，抑制子宮肌瘤細胞活性，LBP濃度和凋亡呈正相關，其研究機制可能與抑制Wnt5b/β-catenin信號通路相關。