miR-935在Notch1介導(dǎo)的兒童T-ALL中的作用機(jī)制研究①

謝淑佩 葉 瑤 陳慶法 李 紅 林媛媛 （江西省兒童醫(yī)院，南昌 330006）

T 淋巴細(xì)胞白血?。═-acute lymphoblastic leuke‐mia，T-ALL）是一種血液腫瘤，由T 細(xì)胞系中未成熟的淋巴細(xì)胞發(fā)展而來，T-ALL患者會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重感染、全身部位出血、呼吸系統(tǒng)衰竭等多種并發(fā)癥，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致死亡，是一類危害巨大的惡性疾病［1］。T-ALL 患者以低齡兒童居多，傳統(tǒng)醫(yī)療手段對(duì)于患兒的毒副作用較大，容易造成其他方面的危險(xiǎn)情況［2］，因此開發(fā)一種高效、少副作用的治療T-ALL 手段，具有重大科學(xué)意義。最新研究發(fā)現(xiàn)，Notch1 的表達(dá)紊亂與T-ALL 的產(chǎn)生擴(kuò)散具有重要聯(lián)系，靶向Notch1 可作為治療T-ALL 的重點(diǎn)研究方向［3］，但就目前的報(bào)道結(jié)果來看，直接通過調(diào)控Notch1 治療T-ALL 仍缺乏高特異性的方法，同時(shí)存在較大的副作用，臨床治療僅停留在理論水平，相關(guān)研究依舊處于探索階段。miR-935 是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種高度保守的miRNA，可參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，已有學(xué)者在食管鱗癌、肝癌、腦膠質(zhì)瘤等腫瘤中進(jìn)行了miR-935 相關(guān)的實(shí)驗(yàn)［4］。研究證實(shí)，miR-935與Notch1 存在結(jié)合位點(diǎn)，二者具有靶向關(guān)系［5］。但關(guān)于miR-935 在T-ALL 中的研究還鮮見報(bào)道，其具體作用機(jī)制和功效尚不十分明確。通過前期小樣本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，T-ALL 患兒血清miR-935 呈低表達(dá)，且miR-935 與Notch1 可能存在結(jié)合位點(diǎn)，二者具有靶向關(guān)系?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，本實(shí)驗(yàn)擬將進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證miR-935 在Notch1 所介導(dǎo)T-ALL 中的作用和機(jī)制，以期為兒童T-ALL 的臨床防治提供有效的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)所用T-ALL 細(xì)胞株為MOLT-4，購自派通生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑與儀器 RPMI1640 培養(yǎng)基購自重慶普立科生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒購自澤葉課件有限公司；MTT 試劑盒購自陜西玉澤實(shí)驗(yàn)器材有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自武漢富鑫遠(yuǎn)科技有限公司；熒光PCR 試劑盒南通艾得爾實(shí)驗(yàn)器材有限公司；Notch1 及β-actin 抗體購自艾博抗貿(mào)易有限公司；GloMax 生物發(fā)光檢測(cè)儀購自江蘇美正有限公司；DR-200BS型酶標(biāo)儀購自鄭州南北儀器有限公司；Apogee 流式細(xì)胞儀購自伯齊科技有限公司；E-Blotter 濕轉(zhuǎn)儀購自美國Wealtec 公司；ABI6000 型熒光定量PCR 儀購自美國Thermo 公司；MJX-50B 型恒溫培養(yǎng)箱購自紹興萬力儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 使用miRWalk 預(yù)測(cè)miR-935 的靶基因，然后結(jié)合基因功能挑選靶基因Notch1并進(jìn)行驗(yàn)證。構(gòu)建野生型（WT-3'-UTR）和突變型（MUT-3'-UTR）PTEN 3'-UTR-熒光素酶表達(dá)載體，并將其和miR-935 inhibitor 轉(zhuǎn)入T-ALL 細(xì)胞中培養(yǎng)48 h。加入100μl的PLB 裂解細(xì)胞。移取裂解液于發(fā)光板中，再加入100μl LARⅡ工作液混勻，讀取1 次測(cè)量熒光值。隨后，每樣品再加入100 μl Stop&Glo?Reagent，淬滅之前的反應(yīng)，再讀取第2 次數(shù)值，以Renilla為內(nèi)參計(jì)算結(jié)果。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 將T-ALL細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS、1%雙抗的RPMI1640 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2，隔天換液。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染并分組，其中對(duì)照組給予等量PBS；miR-935 過表達(dá)組：轉(zhuǎn)染miR-935 模擬物；miR-935沉默組：轉(zhuǎn)染miR-935 抑制體；Notch1 過表達(dá)組：轉(zhuǎn)染Notch1 重組質(zhì)粒；Notch1 沉默組：轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA。轉(zhuǎn)染方法：將400μl 去核酸酶水加入管中，振蕩10 s 加速溶解，脂質(zhì)體體積∶DNA 質(zhì)量（1∶2）混合比例轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染管中無血清培養(yǎng)基，加入MyoD 的DNA，振蕩后再加入轉(zhuǎn)染試劑，再次振蕩。常溫放置15 min，吸取培養(yǎng)液后用PBS清洗，加入混合液，將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱孵育1 h 移去混合液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。免疫熒光確定轉(zhuǎn)染情況。

1.2.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力 取各組細(xì)胞，接種至孔板，調(diào)整密度為2×104個(gè)/ml，每孔100 μl，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，置于溫箱培養(yǎng)，以培養(yǎng)基為校正孔。之后加入20 μl 的MTT 溶液孵育4 h，再加入DMSO 150μl，檢測(cè)490 nm處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力（%）=（A實(shí)驗(yàn)?A校正）/（A對(duì)照?A校正）×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及周期 收集各組細(xì)胞以0.25%胰酶消化，1 500 r/min 離心10 min，去上清，PBS 洗2 次，吸盡上清液，再加70%預(yù)冷乙醇并振蕩，4 ℃固定過夜。用PBS 清洗1 次，室溫條件下每管加30μl碘化丙啶染色20 min，儀器檢測(cè)細(xì)胞周期情況。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)操作前期步驟同上，取細(xì)胞離心并固定，調(diào)整每孔細(xì)胞個(gè)數(shù)，按說明書加入染色劑10 ml，置于4 ℃冰箱中孵育30 min，儀器測(cè)定結(jié)果并分析。

1.2.5 RT-PCR 法檢測(cè)miR-935 表達(dá) 用Trizol 法裂解細(xì)胞并提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。冰上準(zhǔn)備50μl擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×SYBR 25μl，正、反向引物各1μl，cDNA 2μl，雙蒸水20.7 μl，TaqDNAPolymerase 0.3 μl。在RTPCR 儀上反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，45 個(gè)循環(huán)，95 ℃進(jìn)行10 s，65 ℃進(jìn)行60 s，97 ℃進(jìn)行1 s。記錄各孔Ct 值，以U6 為內(nèi)參，采用2?ΔΔCt法計(jì)算，其中ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)?ΔCt對(duì)照，ΔCt=Ct目的?Ct內(nèi)參。引物序列及產(chǎn)物大小見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.6 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 取各組T-ALL細(xì)胞加入細(xì)胞液裂解反應(yīng)15 min，用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。沸水加熱樣品使蛋白變性，拿出樣品冷卻至室溫，移取30μg進(jìn)行電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。常溫下以5%脫脂牛奶封閉2 h，用TBST 清洗3 次，加入Notch1 和β-actin 一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，洗膜，加二抗（1∶2 000）常溫下孵育1 h，洗膜3次后，用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影處理，拍照，Image J（v1.7.0）軟件分析，以β-actin 作為內(nèi)參蛋白，相對(duì)表達(dá)量=目標(biāo)蛋白灰度值/參照蛋白灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析使用SPSS21.0 軟件，結(jié)果以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-935 靶向調(diào)控Notch1 及各組Notch1 蛋白水平比較 miRWalk 靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-935 的靶基因?yàn)镹otch1；雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-935 inhibitor 顯著降低了WT-Notch1 的相對(duì)熒光活性，但對(duì)MUT-Notch1無顯著影響，同時(shí)對(duì)照組、miR-935 過表達(dá)組、miR-935 沉默組、Notch1 過表達(dá)組、Notch1 沉默組的Notch1 蛋白表達(dá)量分別為0.63±0.06、0.24±0.04、0.87±0.11、0.90±0.08、0.21±0.02。與對(duì)照組相比，miR-935 沉默組和Notch1 過表達(dá)組Notch1 表達(dá)顯著增加，miR-935 過表達(dá)組和Notch1 沉默組Notch1 表達(dá)顯著下降（P<0.05）。miR-935過表達(dá)可降低Notch1水平，而miR-935沉默Notch1表達(dá)增加，可推測(cè)Notch1是miR-935的直接靶基因，見圖1、2。

圖1 熒光素酶報(bào)告結(jié)果Fig.1 Luciferase report results

2.2 各組miR-935 水平比較 對(duì)照組、miR-935 過表達(dá)組、miR-935 沉默組、Notch1 過表達(dá)組、Notch1沉默組的miR-935 相對(duì)表達(dá)量分別為1.00、1.78±0.35、0.41±0.07、0.94±0.12、0.97±0.08。與對(duì)照組相比，miR-935 過表達(dá)組miR-935 水平顯著上升，miR-935 沉默組水平顯著下降（P<0.05）；Notch1 過表達(dá)組和沉默組miR-935 相對(duì)表達(dá)量無明顯變化（P>0.05）。見圖3。

圖3 各組miR-935相對(duì)表達(dá)量比較Fig.3 Comparison of relative expression levels of miR-935 in each group

2.3 miR-935、Notch1 對(duì)T-ALL 細(xì)胞活性的影響對(duì)照組、miR-935 過表達(dá)組、miR-935 沉默組、Notch1過表達(dá)組、Notch1 沉默組的細(xì)胞抑制率分別為100.00%、（45.92±5.13）%、（104.03±2.11）%、（105.29±1.53）%、（44.63±3.27）%、；miR-935過表達(dá)和Notch1表達(dá)沉默可顯著降低T-ALL 細(xì)胞活力，而miR-935沉默和Notch1 過表達(dá)則會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖（均P<0.05），見圖4。

圖2 各組Notch1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Fig.2 Comparison of relative expression of Notch1 protein in each group

圖4 各組細(xì)胞活力比較（n=5）Fig.4 Comparison of cell viability in each group（n=5）

2.5 miR-935、Notch1 影響T-ALL 細(xì)胞周期 流式細(xì)胞法顯示：與對(duì)照組相比，miR-935 過表達(dá)組和Notch1 過沉默組細(xì)胞處在G0/G1期的細(xì)胞占比顯著上升，處于S 期的細(xì)胞數(shù)目減少，提示T-ALL 細(xì)胞被阻滯在了G0/G1期，增殖受抑制；而miR-935 沉默組和Notch1 過表達(dá)組細(xì)胞的周期情況與上述相反，見圖5。

圖5 各組細(xì)胞周期分布比較Fig.5 Comparison of cell cycle distribution in each group

2.6 miR-935、Notch1 影響T-ALL 細(xì)胞凋亡 對(duì)照組、miR-935 過表達(dá)組、miR-935 沉默組、Notch1 過表達(dá)組、Notch1 沉默組的細(xì)胞抑制率分別為（8.12±1.43）%、（35.13±5.67）%、（4.08±1.25）%、（3.77±0.98）%、（36.08±6.32）%。與對(duì)照組相比，miR-935過表達(dá)組和Notch1 沉默組凋亡率顯著提高，而miR-935 沉默組和Notch1 過表達(dá)組凋亡率顯著降低（P<0.05）。見圖6。

圖6 各組細(xì)胞凋亡結(jié)果比較Fig.6 Comparison of apoptosis results in each group

3 討論

兒童T-ALL擴(kuò)散較快，患者預(yù)后不良率高，同時(shí)會(huì)引發(fā)其他的并發(fā)癥，如中樞系統(tǒng)白血病等，嚴(yán)重危害了患兒的健康［6］。雖然移植手術(shù)配合化療對(duì)于T-ALL 具有較好的療效，但藥物耐藥性及副作用仍是待解決的問題，同時(shí)嚴(yán)重不良預(yù)后的問題也依舊無法忽視［7］。藥物靶向調(diào)控是開發(fā)治療患兒T-ALL手段的關(guān)鍵，而深入探究T-ALL 的發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)有助提升與患兒T-ALL臨床診療水平。在眾多的細(xì)胞因子中，Notch1 被認(rèn)為是治療T-ALL 的重要靶點(diǎn)，Notch1 功能較多，一方面可作為膜蛋白受體接受外源信號(hào)，另一方面Notch1 也作為轉(zhuǎn)錄因子，表現(xiàn)出對(duì)下游基因表達(dá)的調(diào)控作用，在造血前體細(xì)胞向T 細(xì)胞系分化起到重要作用［8-9］。相關(guān)研究報(bào)道，超過半數(shù)的T-ALL 患者存在Notch1 基因的突變，從而表現(xiàn)出與健康個(gè)體不符的表達(dá)紊亂，使得體內(nèi)信號(hào)因子出現(xiàn)異常，誘導(dǎo)了疾病的發(fā)生［10］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)大鼠的造血干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將突變型Notch1 基因?qū)爰?xì)胞中并植入大鼠，所有的實(shí)驗(yàn)體在移植后都出現(xiàn)了T-ALL 癥狀，提示Notch1 是T-ALL的發(fā)生的重要原因，同時(shí)也說明針對(duì)Notch1的靶向治療具有較好的科學(xué)性［11-12］。相關(guān)研究表明Notch1 信號(hào)在T-ALL 中至少存在4 條調(diào)控途徑，分別為：①Notch1/HES1 途徑可以上調(diào)PI3K 水平進(jìn)而啟動(dòng)活化PI3K-AKT-mTOR 通路并介導(dǎo)多種細(xì)胞活動(dòng)，如由細(xì)胞生長因子接觸介導(dǎo)的細(xì)胞發(fā)育與增殖，與抑癌基因PTEN 的作用互為拮抗，可以使T-ALL 細(xì)胞增殖不受抑制［13］；②Notch1/cMYC 途徑與合成代謝有關(guān)，通路活化后會(huì)促進(jìn)下游基因的表達(dá)，使細(xì)胞分裂和代謝加快，并產(chǎn)生協(xié)同作用，誘導(dǎo)更多生長基因的表達(dá)，是T-ALL 密切相關(guān)的中心通路［14］；③通過促進(jìn)CCND3 和CDK6 等蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)T前體細(xì)胞G1/S的分化；另外Notch1對(duì)SKP2的表達(dá)有促進(jìn)作用，與CDKN1B 和CDKN1A 降解共同促使造血細(xì)胞周期提前進(jìn)入S 期［15］；④激活NF-κB通路，通過IL-7R 的α 鏈調(diào)控p53的表達(dá)和活化，p53具有較好的抑癌功效，在T-ALL 內(nèi)高表達(dá)可以誘導(dǎo)凋亡，同時(shí)p53 還具有基因缺陷的修復(fù)功能，Notch1抑制p53 從而促使T-ALL 的發(fā)生［16］。湯煜媛等［17］也通過分析總結(jié)Notch1 通路在T-ALL 治療中的應(yīng)用提出，靶向Notch1 可以治療T-ALL 具有巨大的潛力。

miRNA 是一類長度為19~23 nt 的內(nèi)源性單鏈非編碼微小RNAs 分子，miRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)為A 型雙螺旋，可通過與下游靶基因的3'-UTR 相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，進(jìn)而參與細(xì)胞活動(dòng)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程［18］。每個(gè)miRNA 可以有多個(gè)靶基因，而幾個(gè)miRNAs 也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過1 個(gè)miRNA 調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，也可以通過幾個(gè)miRNAs 的組合精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)［19］。雖然對(duì)miRNA 的研究還處于探索階段，但miRNA 表達(dá)或功能異?？山閷?dǎo)T-ALL 發(fā)生發(fā)展的觀點(diǎn)已得到普遍認(rèn)同［20-21］。miR-935 是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種高度保守的mi-RNA［22-23］。YAN 等［24］通過雙熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Notch1是miR-935 的靶基因；而何彩等［23］通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，miR-935 通過Notch1 可以調(diào)控胃癌細(xì)胞的生命活動(dòng)。因此通過miR-935 靶向治療T-ALL 具有一定的理論基礎(chǔ)。

由本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，Notch1 為miR-935 的靶基因，miR-935 可靶向調(diào)控Notch1 表達(dá)，與上述學(xué)者的研究結(jié)果一致。本次研究顯示，miR-935 高表達(dá)可以抑制T-ALL 細(xì)胞的增殖；觀察細(xì)胞周期結(jié)果可知，miR-935高表達(dá)會(huì)使腫瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1，令細(xì)胞分裂受阻；后續(xù)的凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-935 過表達(dá)組的細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組，提示miR-935 高表達(dá)可以促進(jìn)T-ALL細(xì)胞的凋亡。由上述結(jié)果分析新發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-935 是通過阻滯細(xì)胞周期來完成，這可能是miR-935過表達(dá)抑制了Notch1的表達(dá)，相鄰細(xì)胞可以通過Notch 受體與配體的結(jié)合傳遞信號(hào)，并最終實(shí)現(xiàn)了促凋亡效果。由RT-PCR和Western blot 實(shí)驗(yàn)可知，和對(duì)照組相比，miR-935 過表達(dá)組表達(dá)量顯著增加，miR-935 沉默組表達(dá)量顯著下降，Notch1 過表達(dá)組和沉默組miR-935 相對(duì)表達(dá)量無顯著性差異，而miR-935 過表達(dá)組Notch1 蛋白表達(dá)量明顯提升，沉默組Notch1 蛋白表達(dá)量明顯下降，進(jìn)一步證明了miR-935對(duì)Notch1的調(diào)控作用。

綜上所述，miR-935 通過調(diào)控靶基因Notch1 介導(dǎo)兒童T-ALL 細(xì)胞的生命活動(dòng)，miR-935 過表達(dá)可以促進(jìn)Notch1 的表達(dá)，從而使激活相關(guān)的信號(hào)同時(shí)，抑制細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞分裂并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有較好的抗腫瘤作用，miR-935 可作為治療兒童T-ALL 新的靶點(diǎn)。本次實(shí)驗(yàn)僅對(duì)miR-935 與Notch1關(guān)系通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了研究，而后續(xù)作用的相關(guān)信號(hào)通路及作用未進(jìn)行進(jìn)一步的探討，很多機(jī)制尚不明確，將在之后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究闡述。