ORAOV1、CD133和KiSS-1在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義*

吳志剛 胡凱 楊東昆 劉暢

2012 年全球新發(fā)口腔癌病例（包括唇癌）估計(jì) 為300 000 例，死亡病例約為145 000 例[1]?？谇击[狀細(xì)胞癌（OSCC）約占所有診斷為口腔癌的90%。在中國(guó)，口腔癌的主要危險(xiǎn)因素有吸煙、飲酒、檳榔及HPV 感染[2-3]?？谇话┻^(guò)度表達(dá)1（oral cancer overexpressed 1，ORAOV1）蛋白，最初被確定為口腔鱗狀細(xì)胞癌中的候選癌基因[3]。該基因位于人類染色體11q13。越來(lái)越多的證據(jù)表明，ORAOV1 與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、血管生成和腫瘤發(fā)生有關(guān)[4]。ORAOV1 的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，應(yīng)被視為預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的生物標(biāo)志物。腫瘤干細(xì)胞由于其在腫瘤細(xì)胞群體中具有自我更新能力和高致瘤性，因此被認(rèn)為在癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起重要作用[5]。造血干細(xì)胞抗體CD133 是腫瘤干細(xì)胞中最常見的一個(gè)標(biāo)志物，其可以抑制癌細(xì)胞凋亡[6]。吻素-1（KiSS-1）基因最初通過(guò)消減雜交分析被確定為人類黑色素瘤的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。該基因位于人類染色體1q32 上，長(zhǎng)度為6 151 個(gè)堿基對(duì)。KiSS-1 可通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）與啟動(dòng)子的結(jié)合來(lái)促進(jìn)上皮性鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)并抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達(dá)。KiSS-1 的正常表達(dá)可以抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移從而抑制其趨化性和侵襲性[7]。一些證據(jù)表明KiSS-1 可以抑制癌癥的轉(zhuǎn)移而不影響致瘤性[7]。KiSS-1 編碼一個(gè)145 個(gè)氨基酸的肽，該肽被進(jìn)一步切割為KiSS-1 家族肽素。然而，KiSS-1抑制轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍不清楚。本研究主要通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)ORAOV1、CD133 和KiSS-1 在OSCC 中的表達(dá)情況，并分析它們之間的相互關(guān)系及臨床病理意義。

1 資料與方法

1.1 一 般資料 選取2012 年1 月-2014 年12 月在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科100 例確診為OSCC 患者的標(biāo)本及相應(yīng)的100 例正常組織作為對(duì)照。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡20～80 歲；（2）病理診斷為OSCC；（3）臨床分期Ⅰ～ⅣA 期。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）選取標(biāo)本前已接受抗癌治療；（2）伴有嚴(yán)重心、肺、腦疾??；（3）合并其他腫瘤。所有組織樣本均在患者書面同意的情況下獲得。該研究得到蚌埠醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。隨訪時(shí)間從患者的手術(shù)日期到他/她的死亡日期或2020 年12 月。

1.2 方法 所有OSCC 標(biāo)本和對(duì)照標(biāo)本均采用4%中性福爾馬林溶液固定后石蠟包埋，4 μm 厚連續(xù)切片，然后用二甲苯及梯度濃度的乙醇溶液連續(xù)脫蠟、脫二甲苯至水洗。ORAOV1、CD133 和KiSS-1蛋白的免疫組化染色步驟根據(jù)試劑盒說(shuō)明書操作，陽(yáng)性對(duì)照采用說(shuō)明書指定的陽(yáng)性切片，空白對(duì)照用PBS 液替代一抗。兔抗人多克隆抗體ORAOV1 購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，鼠抗人單克隆抗體CD133 和KISS-1 購(gòu)自美 國(guó)Santa Cruz 公 司。ElivisionTMPlus和DAB 顯色試劑盒購(gòu)自中國(guó)福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) ORAOV1 主要定位于細(xì)胞核，CD133 主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，KiSS-1主要定位于細(xì)胞漿。陽(yáng)性結(jié)果的判定主要是根據(jù)染色強(qiáng)度和染色范圍分別計(jì)分相乘后得出的。陽(yáng)性強(qiáng)度評(píng)分如下：無(wú)著色為0 分；淡黃色為1 分；黃色為2 分；棕黃色為3 分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比對(duì)陽(yáng)性程度進(jìn)行評(píng)分：≤10%為1 分；11%～50%為2 分；51%～75%為3 分；＞75%為4 分。將染色強(qiáng)度和染色范圍相乘，得出一個(gè)介于0～12 的值。根據(jù)均數(shù)來(lái)計(jì)算，若積分≥3 分為陽(yáng)性表達(dá)，＜3 分為陰性[8]。免疫組化標(biāo)記染色結(jié)果的判定是由兩位高年資病理醫(yī)師通過(guò)獨(dú)立雙盲法得出的。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0 對(duì)本試驗(yàn)中數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用卡方檢驗(yàn)比較臨床病理參數(shù)與ORAOV1、CD133 或KiSS-1 之間的相關(guān)性。ORAOV1、CD133 或KiSS-1 蛋白表達(dá)之間關(guān)系采用列聯(lián)表相關(guān)檢驗(yàn)。患者治療后總的生存時(shí)間利用Kaplan-Meier 法分析，通過(guò)log-rank 法檢驗(yàn)；多因素回歸分析通過(guò)Cox 法分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ORAOV1、CD133 和KiSS-1 的表達(dá) 及其與OSCC 臨床參數(shù)之間的關(guān)系 ORAOV1 結(jié)果在OSCC標(biāo)本中的陽(yáng)性表達(dá)率為60%（60/100），高于相應(yīng)的正?？谇火つそM織的20%（20/100）（χ2=33.333，P＜0.001）。CD133 在OSCC 組織中 的陽(yáng)性表達(dá)率60%（60/100），高于相應(yīng)的正?？谇火つそM織的18%（18/100）（χ2=37.074，P＜0.001）。KiSS-1 表達(dá)在OSCC 組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為46%（46/100），低于相應(yīng)的正常口腔黏膜組織的91%（91/100）（χ2=46.924，P＜0.001）。不同年 齡、性 別、位置、吸煙、酗酒、直徑、分化程度OSCC 患者的ORAOV1、ORAOV1、KiSS-1 蛋白的表達(dá)情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期OSCC 患者的ORAOV1、ORAOV1、KiSS-1 蛋白的表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 ORAOV1、CD133和KiSS-1與OSSC臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系（例）

2.2 OSCC 中ORAOV1、CD133 和KiSS-1 表達(dá)的 相關(guān)性 列聯(lián)表相關(guān)分析顯示，KiSS-1 表達(dá)與ORAOV1、CD133 表達(dá)均 呈負(fù)相 關(guān)（P＜0.001）。ORAOV1 的表達(dá)與CD133 的表達(dá)呈正相關(guān)（P=0.003），見表2～4。

表2 ORAOV1與KiSS-1的關(guān)系分析（例）

表3 CD133與KiSS-1的關(guān)系分析（例）

表4 CD133與ORAOV1的關(guān)系分析（例）

2.3 影響生存時(shí)間的單因素分析 隨訪數(shù)據(jù)顯示，ORAOV1 陽(yáng)性表達(dá)OSCC 患者的總生存時(shí)間（OS）為（43.7±18.4）個(gè)月，低于陰性表達(dá)OSCC 患者的（71.0±14.6）個(gè)月（log-rank χ2=37.015，P＜0.001），見 圖1A。CD133 陽(yáng)性表 達(dá)OSCC 患者的OS 為（43.2±16.9）個(gè)月，低于CD133 陰性表達(dá)OSCC患者的（71.8±15.8）個(gè) 月（log-rank χ2=46.317，P＜0.001），見圖1B。KiSS-1 陽(yáng)性表達(dá)OSCC 患者的OS 為（71.4±13.8）個(gè)月，高于KiSS-1 陰性表達(dá)患者的（40.3±16.1）個(gè)月（log-rank χ2=65.535，P＜0.001），見圖1C。

圖1 ORAOV1、CD133和KiSS-1陽(yáng)性與陰性表達(dá)OSCC患者生存曲線

2.4 影響生存時(shí)間多因素分析 多因素分析顯示，ORAOV1、CD133、KiSS-1 蛋白可能是影響OSCC患者術(shù)后生存時(shí)間的獨(dú)立因素（P＜0.05），見表5。

表5 影響生存時(shí)間的多因素分析

3 討論

腫瘤的異質(zhì)性會(huì)干擾生物標(biāo)志物評(píng)估的可重復(fù)性。因此，必須全面評(píng)估候選生物標(biāo)志物的價(jià)值以確認(rèn)其有效性。本研究中，筆者分析了100 例OSCC患者及相對(duì)應(yīng)的正常口腔黏膜組織中ORAOV1 蛋白的表達(dá)，并對(duì)臨床病理特征進(jìn)行了比較。筆者發(fā)現(xiàn)OSCC 組織中ORAOV1 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高于其在對(duì)照組織中的陽(yáng)性率。此外，其陽(yáng)性率與OSCC 浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期有關(guān)。筆者的結(jié)果與之前的研究相似，表明ORAOV1 的過(guò)表達(dá)應(yīng)該促進(jìn)OSCC 浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[4，9]。

CD133 是人類造血干細(xì)胞的細(xì)胞表面生物標(biāo)志物，存在于各種癌癥組織中[4]。在OSCC 中，已經(jīng)證明CD133 與腫瘤的侵襲進(jìn)展相關(guān)，并顯示可預(yù)測(cè)抗癌治療的不良預(yù)后[10]。在本研究中，CD133 其陽(yáng)性率與OSCC 浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期有關(guān)。此外，Kaplan-Meier 生存分析顯示，CD133 陽(yáng)性表達(dá)患者的OS 與陰性表達(dá)的患者相比，生存時(shí)間顯著降低。以上結(jié)果表明CD133 的過(guò)表達(dá)可能參與了OSCC 細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的過(guò)程，預(yù)后較差。筆者結(jié)果與之前的研究一致，包括口腔癌和其他癌癥的研究[4，10-13]。

KiSS-1 被廣泛認(rèn)為是多種癌癥轉(zhuǎn)移的抑制基因[7，14-16]。KiSS-1 可以抑制癌細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。本研究結(jié)果還表明，OSCC 組織中KiSS-1 的陽(yáng)性表達(dá)率低于其在對(duì)照正常組織中的陽(yáng)性率，其陽(yáng)性率還與OSCC 浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期有關(guān)。此外，Kaplan-Meier 生存分析KiSS-1 表達(dá)陽(yáng)性患者的OS 時(shí)間長(zhǎng)于陰性患者。上述結(jié)果表明KiSS-1 的下調(diào)或失控應(yīng)被視為預(yù)測(cè)OSCC 患者轉(zhuǎn)移和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物，這與之前的研究一致[7，14-20]。

TNM 分期為臨床治療OSCC 提供策略，但并不能描述OSCC 生物學(xué)行為的詳盡信息。因此，迫切需要尋找新穎有效的候選生物標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)OSCC 的生物學(xué)行為、轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后。本研究多因素分析表明，ORAOV1 和CD133 蛋白的高表達(dá)及KiSS-1 蛋白的低表達(dá)可能是影響OSCC 患者術(shù)后生存時(shí)間的獨(dú)立因素。以上結(jié)果表明ORAOV1、CD133 和KiSS-1 的表達(dá)可能在一定程度上預(yù)測(cè)OSCC 的轉(zhuǎn)移和預(yù)后方面有重要意義。

OSCC 是主要的常見口腔癌類型。CD133 表達(dá)異常增高可能通過(guò)促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的增生，而參與OSCC 的腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)過(guò)程[18]。腫瘤干細(xì)胞的自我更新和多分化能力促進(jìn)OSCC 細(xì)胞快速生長(zhǎng)。同時(shí)，ORAOV1 的過(guò)表達(dá)也通過(guò)激活一系列細(xì)胞周期蛋白促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和侵襲而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。它還參與血管生成以促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。事實(shí)上，腫瘤干細(xì)胞所在的微環(huán)境主要由微血管或微淋巴管組成。因此，這些微血管支持進(jìn)一步促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。KiSS-1 通過(guò)促進(jìn)E-cadherin 表達(dá)和抑制可降解細(xì)胞外基質(zhì)的基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)來(lái)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。因此，KiSS-1 的下調(diào)或丟失調(diào)節(jié)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，ORAOV1、CD133 和KiSS-1 會(huì)影響OSCC 浸潤(rùn)進(jìn) 展；ORAOV1、CD133 和KiSS-1 的聯(lián)合檢測(cè)可以在一定程度上預(yù)測(cè)OSCC 患者浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。