閩楠種子對快速脫水的響應(yīng)

李 娟，林建勇，歐漢彪，梁瑞龍

（廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院 中南速生材繁育國家林業(yè)和草原局重點實驗室 廣西優(yōu)良用材林資源培育重點實驗室，廣西南寧530002）

閩楠（Phoebe bournei）為樟科（Lauraceae）楠屬高大常綠喬木，為國家二級野生保護植物，也是我國特有的珍貴樹種；天然分布于浙江、福建、江西、廣東、廣西、湖南、湖北和貴州等地，垂直分布海拔范圍為100～1 000 m，均為聚集狀零星分布[1-2]。閩楠素以材質(zhì)優(yōu)良聞名于國內(nèi)外，但由于長期對該樹種資源的不合理開發(fā)利用，其天然資源已近枯竭。閩楠結(jié)實有明顯的大小年現(xiàn)象，種子具有休眠特性，采收后不能直接萌發(fā)，也不耐儲藏，給閩楠苗木繁育和造林帶來諸多不便。種子是育苗造林的物質(zhì)基礎(chǔ)。影響種子壽命的重要因素是種子含水量和貯藏溫度[3]。脫水是種子在貯藏或環(huán)境脅迫中存活、保證物種更好繁衍的適應(yīng)性策略。Roberts根據(jù)低溫、脫水反映及儲藏行為，將種子分為正常性和頑拗性兩類[4]，還發(fā)現(xiàn)介于正常性和頑拗性之間存在第3種類型,即中間型[5]。不同類型的種子脫水敏感性不同，直接影響種子儲藏和種質(zhì)資源的保存[6-11]。

吳大榮等[12]、周佑勛等[13]、李鐵華等[14]和李娟等[15]分別從種子生態(tài)學、休眠和萌發(fā)特性、種子活力及形態(tài)特征等方面對閩楠種子進行研究，但對閩楠種子的脫水耐性鮮有研究。本研究以閩楠種子為試驗材料，分析脫水對閩楠種子活力和萌發(fā)率的影響，確定閩楠種子脫水耐性及適宜貯藏的含水量，并從代謝作用、抗氧化酶系統(tǒng)的角度探討閩楠種子脫水敏感性機制，為解決閩楠種子的貯藏問題，保證生產(chǎn)用種安全及長期保存閩楠種質(zhì)資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

閩楠種子采自重慶江津。2018年12月14日，采收閩楠成熟果實，將果皮去除后得到新鮮種子，立即進行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子脫水處理

將新鮮種子裝入尼龍網(wǎng)袋，按照20∶1的體積比放入裝有變色硅膠的密閉干燥器中，硅膠變紅即更換。在第0、12、24、48、72、96、120、144和168 h分別取樣。每次取樣時，將用于測定酶活性和電導(dǎo)率等指標的種子樣品放入液氮速凍，置于-80℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2 種子含水量測定

烘干前，采用電子天平（精確至0.001 g）將每個處理的種子稱重1次；隨后置于已烘干且稱過重的鋁盒中，于105℃烘至恒重，稱量種子重量。每處理10粒種子，3次重復(fù)。含水量（%）計算公式為[16]：

1.2.3 種子生活力測定

將閩楠種子剝?nèi)ネ夥N皮，采用0.4%的2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液浸泡，在25℃水浴鍋中水浴8～12 h，倒出TTC溶液，用蒸餾水沖洗種子3次，觀察著色情況。整個胚被染成紅色，表示有活力；胚僅有一小部分被染成紅色或完全呈白色，表示無活力。以新鮮種子為對照（CK），每處理20粒種子，3次重復(fù)。

1.2.4 種子萌發(fā)試驗

在種子解除休眠后，在直徑9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)鋪墊0.5 cm厚的河沙（125℃高溫滅菌12 h），將種子均勻平鋪于其上，放入自動光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為25℃，14 h光照/10 h黑暗。胚根突破種皮5 mm記為發(fā)芽，每日觀察、記錄萌發(fā)情況，連續(xù)3天沒有新種子萌發(fā)，結(jié)束試驗。試驗過程中適時澆水，保持沙子濕潤。每處理20粒種子，3次重復(fù)。

1.2.5 相對電導(dǎo)率測定

不同處理的種子各取10粒，稱重后，用清水沖洗3次，再用去離子水沖洗兩次，放入燒杯，加入30 mL蒸餾水浸沒種子，在25℃條件下浸種23 h，用電導(dǎo)率儀測定電導(dǎo)率（S1）；之后用塑料薄膜封瓶口放入沸水浴中15 min，取出后冷卻至25℃，測定其電導(dǎo)率（S2），以不加種子的去離子水作為空白對照，設(shè)3次重復(fù)。相對電導(dǎo)率（L，%）計算公式為[17]：

1.2.6 種子抗氧化酶活性測定

采用氮藍四唑（NBT）法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性，采用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶（CAT）活性[17]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)和制作圖表，采用SPSS 18.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子含水量和生活力變化

新鮮閩楠種子的含水量為35.53%，種子失水速率呈現(xiàn)“快-慢-快”的趨勢（圖1）。0～24 h，含水量從35.53%降至32.17%；24～48 h，失水速率變慢；48～120 h，失水速率逐漸加快；120～144 h，失水速率最快。

圖1 閩楠種子含水量Fig.1 Moisture content of P.bournei seeds

不同含水量種子生活力和發(fā)芽率差異顯著（P＜0.05）（圖2）。隨含水量下降，種子發(fā)芽率呈先升后降的趨勢；含水量為33.72%（T2）時，種子發(fā)芽率最高（40.00%），與CK（T1）差異顯著（P＜0.05）。隨含水量下降，種子生活力呈先升后降的趨勢；含水量低于31.22%（T4）時，種子生活力與CK差異顯著（P＜0.05）。含水量降至16.09%（T9）時，種子完全失活。

圖2 閩楠種子生活力、發(fā)芽率和含水量的關(guān)系Fig.2 Relationships among seed viability,germination rate and moisture content of P.bournei

2.2 種子電導(dǎo)率變化

在閩楠種子脫水過程中，電導(dǎo)率呈現(xiàn)不規(guī)則波動變化（圖3）。不同含水量種子的電導(dǎo)率差異顯著（P＜0.05）。含水量從35.53%（T1）降至31.22%（T4）時，電導(dǎo)率最大（52.46%）；含水量從31.22%（T4）降至29.12%（T5）時，電導(dǎo)率急劇下降，此后又逐漸上升。

圖3 脫水對種子電導(dǎo)率的影響Fig.3 Effect of dehydration on seed conductivity

2.3 種子SOD活性變化

在脫水前期，種子SOD活性呈波動變化（圖4）。不同含水量種子SOD活性差異極顯著（P＜0.01）。含水量為33.72%（T2）和31.22%（T4）時，SOD活性極顯著高于其他含水量（P＜0.01）；含水量低于31.22%（T4）時，隨含水量下降，SOD活性呈下降趨勢。

圖4 脫水對SOD活性的影響Fig.4 Effect of dehydration on SOD activity

2.4 種子POD活性變化

POD活性在閩楠種子脫水過程中整體呈上升趨勢（圖5）。不同含水量種子POD活性差異極顯著（P＜0.01）。含水量從35.53%（T1）降至32.17%（T3），POD活性急劇增加，之后變化較平緩，其活性一直保持在較高水平。

圖5 脫水對POD活性的影響Fig.5 Effect of dehydration on POD activity

2.5 CAT活性變化

CAT活性在閩楠種子脫水過程中呈波動變化（圖6）。不同含水量種子CAT活性差異極顯著（P＜0.01）。含水量為33.72%（T2）時，CAT活性最大（145.86 nmol·min-1·g-1），極顯著高于CK（P＜0.01）；此后，CAT活性下降，到脫水中后期有較大幅度上升；含水量為19.64%（T8）時，CAT活性達到第2個峰值（179.01 nmol·min-1·g-1）；含水量降至16.09%（T9）時，CAT活性降至最低（39.02 nmol·min-1·g-1），此時種子完全失活。

圖6 脫水對CAT活性的影響Fig.6 Effect of dehydration on CAT activity

2.6 MDA含量變化

不同含水量種子MDA含量差異顯著（P＜0.05）（圖7）。含水量從35.53%（T1）降至31.22%（T4）時，MDA含量呈“降-升-降”的趨勢；含水量低于31.22%（T4）時，隨含水量下降，MDA含量不斷上升；含水量為16.09%（T9）時，MDA含量高于其他處理。

圖7 脫水對MDA含量的影響Fig.7 Effect of dehydration on MDA content

2.7 相關(guān)性分析

種子含水量與其他生理指標具有一定的相關(guān)性（表1）。種子含水量與生活力、發(fā)芽率均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），表明含水量下降對種子萌發(fā)產(chǎn)生極大影響。SOD活性與種子生活力、發(fā)芽率均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；POD活性與種子含水量、生活力均呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01），與發(fā)芽率呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）。

表1 閩楠種子脫水過程中各指標的相關(guān)性Tab.1 Correlations among different indexes during seed dehydration of P.bournei

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

頑拗性種子成熟時含水量高，對脫水敏感，不耐低溫，難實現(xiàn)長期保存[18]。本試驗結(jié)果顯示，閩楠種子初始含水量為35.53%，種子生活力為55.00%；含水量降至29.12%時，其生活力和發(fā)芽率均降至13.33%，顯著低于初始狀態(tài)；含水量降至16.09%時，種子完全失活，種子變黑變硬。相關(guān)分析結(jié)果表明，閩楠種子含水量與種子生活力、發(fā)芽率均呈極顯著正相關(guān)，這表明其具有明顯的頑拗性特征，也證明含水量是影響閩楠種子活力的重要因素之一，是閩楠種子保存的關(guān)鍵制約因素。

研究表明，輕度脫水可促進種子發(fā)芽，提高種子萌發(fā)率。樟樹（Cinnamomum camphora）[19]、遼東櫟（Quercus wutaishanica）[20]和木奶果（Baccaurea ramiflora）[21]等樹種的種子輕度脫水后，發(fā)芽率顯著提高。本試驗中，閩楠種子具有休眠特性，新鮮種子發(fā)芽率僅為22.33%；含水量降至33.72%時，種子生活力（56.67%）與未脫水前種子生活力無顯著差異，種子發(fā)芽率（40.00%）顯著高于未脫水前，表明輕微脫水能促進閩楠種子萌發(fā)。這可能是由于輕度脫水破壞閩楠種子中抑制種子萌發(fā)的物質(zhì)結(jié)構(gòu)，促使種子解除休眠狀態(tài)，在生產(chǎn)實踐中可以適當通風干燥，促進種子萌發(fā)。

頑拗性種子脫水過程中，膜脂過氧化作用致使膜結(jié)構(gòu)損傷與功能被破壞，抗氧化保護系統(tǒng)活性下降，自由基的積累引發(fā)細胞代謝紊亂；MDA對細胞有毒害作用，會降低抗氧化保護酶的活性[22]。在種子脫水過程中，抗氧化防御系統(tǒng)發(fā)揮著重要作用，其中SOD、POD和CAT能夠清除種子代謝過程中產(chǎn)生的自由基，保護細胞膜[22]。本試驗中，含水量從35.53%降至33.72%時，電導(dǎo)率上升，SOD、POD和CAT活性增加，且SOD和CAT活性達到峰值，MDA含量下降；說明抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)揮作用，在一定程度上清除MDA。含水量從33.72%降至31.22%時，電導(dǎo)率升至最大值，SOD活性先降后升，CAT活性下降，POD活性維持在較高水平，MDA含量先升后降。說明抗氧化酶系統(tǒng)對細胞膜系統(tǒng)有一定程度的修復(fù)作用。含水量低于31.22%時，電導(dǎo)率先降后升，SOD活性持續(xù)降低，POD和CAT活性較高，MDA含量增加?？寡趸冈诿撍捌谀鼙３州^高活性，在一定程度上緩解細胞膜系統(tǒng)的損傷；隨脫水程度增加，閩楠種子膜脂過氧化程度不斷加劇，細胞膜受損愈加嚴重，含水量過低時，抗氧化酶系統(tǒng)不再起作用。相關(guān)分析結(jié)果表明，種子生活力和發(fā)芽率與SOD活性呈顯著正相關(guān)，與POD活性呈極顯著負相關(guān)，CAT活性與種子生活力和發(fā)芽率相關(guān)性不顯著，說明在閩楠種子脫水過程中，SOD對種子的保護作用更大。

3.2 結(jié)論

閩楠種子具有頑拗性，其儲藏的最佳含水量為（33.72±0.69）%，種 子 安 全 含 水 量 為（32.17±0.35）%。在整個脫水過程中，SOD對維持閩楠種子活性作用較大。目前生產(chǎn)實踐中通常采用濕沙儲藏閩楠種子，保存期為3～4個月。雖然在保存過程中嚴格控制沙的濕度，但還有大量種子霉變腐爛。還需對閩楠種子脫水過程中的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化機理進行更深入的研究，為探索其長期保存的方法提供參考。