國蘭育種技術(shù)研究進展

王 玲

（長江大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025）

蘭花是蘭科植物的總稱，被分為5個亞科801屬28237種，是單子葉植物中種質(zhì)最多的一種植物[1]。蘭科蘭屬中的地生種類被稱作國蘭，主要包括春蘭(Cymbidium goeringii(Rchb. f.) Rchb. F.)、蕙蘭(C. faberiRolfe)、建蘭(C. ensifolium(L.) Sw.)、墨蘭(C. sinense(Jackson ex Andr.) Willd.)、寒蘭(C. kanranMakino)、蓮瓣蘭(C. tortisepalumFukuyama)、春劍(C. tortisepalumvar.longibracteatum(Y.S.Wu & S.C.Chen) S.C.Chen & Z.J.Liu)等，在我國有2000多年的栽培歷史。國蘭葉片飄逸挺拔，花朵秀麗高雅，幽香沁人心脾，在我國大江南北、海峽兩岸以及受中國文化影響的國家和地區(qū)都被廣泛追捧[2]。近年來，蘭花在年宵花市場上越來越受歡迎，國蘭憑其沁人的幽香，飄逸的姿態(tài)也在年宵花市場中占得一席之地。與洋蘭的工廠化、產(chǎn)業(yè)化相比，國蘭工廠化生產(chǎn)困難，其育種與繁殖技術(shù)較為落后。因此，國蘭育種技術(shù)的開發(fā)對于國蘭經(jīng)濟價值的開發(fā)至關(guān)重要。本文將從國蘭種質(zhì)資源的收集、種質(zhì)資源的鑒定、雜交育種、組織培養(yǎng)、多倍體育種、分子育種等方面介紹國蘭育種研究進展及其發(fā)展趨勢，并提出展望，以期為國蘭的新品種選育和產(chǎn)業(yè)化栽培提供理論依據(jù)。

1 國蘭種質(zhì)資源的收集

種質(zhì)資源是新品種選育和產(chǎn)業(yè)化栽培的基礎(chǔ)。國蘭在我國種植歷史悠久，種質(zhì)資源十分豐富。20世紀(jì)90年代，“蘭花熱”開始興起，不少野生蘭花被過度采挖，生存地被大肆破壞，使得國蘭種質(zhì)資源受到嚴(yán)重威脅[3]。20世紀(jì)90年代末國家開始重視蘭花種質(zhì)資源的保護，并將蘭花列入植物保護名錄，其中，1999年春蘭被列入《中華人民共和國農(nóng)業(yè)植物新品種保護名錄(第一批)》，2001年蘭屬被列入《中華人民共和國農(nóng)業(yè)植物新品種保護名錄(第三批)》，2021年新頒布的《國家重點保護野生植物名錄》第二批中蘭科蘭屬的植物除兔耳蘭(C. lancifoliumHook.)外全部被列為國家重點保護野生植物。此外，蘭圃公園與蘭花種質(zhì)資源庫等的建立也為國蘭種質(zhì)資源的收集與保護起到了重要作用。廣州的蘭圃公園自1951年建成一直致力于蘭花的種質(zhì)資源的遷地保護，共保存蘭花種質(zhì)資源15屬113種，其中國蘭有81種[4]。湖南省園藝研究所國家蕙蘭種質(zhì)資源庫2010年10月開始從事蕙蘭種質(zhì)資源收集和研發(fā)，截至目前，已從湖南、湖北、貴州、福建等地引種和保存不同類型的蕙蘭種質(zhì)資源1000余份，其中梅瓣資源80份，荷瓣資源90份，葉藝資源50份，奇花資源25份[5]。隨著國家的重視及人們保護意識的提高，近年來國蘭野生資源逐漸得到恢復(fù)，這對國蘭優(yōu)良種質(zhì)資源的收集、利用和開發(fā)十分有利。

2 國蘭種質(zhì)資源的鑒定

蘭花親本的選擇直接關(guān)系到蘭花優(yōu)良品種的選育，種質(zhì)資源的鑒定有助于快速找到性狀好且雜交率高的親本，對于國蘭的育種具有重要意義。國蘭為典型的蟲媒花，種子結(jié)實自然變異率高[6]，多年來的人工育種在豐富了國蘭品種的同時也使許多國蘭雜交品種遺傳背景復(fù)雜，導(dǎo)致國蘭的種質(zhì)資源鑒定變得十分困難。表型形態(tài)標(biāo)記是利用物種表型特征進行分類的方法，其主要特點為簡便易行。傅巧娟等[7]通過對62份建蘭種質(zhì)表型進行分析，發(fā)現(xiàn)建蘭種質(zhì)表型多樣性豐富，經(jīng)過綜合評價，發(fā)現(xiàn)‘四季紅荷’表現(xiàn)最優(yōu)。雖然傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類能在一定程度上對國蘭種質(zhì)進行鑒定，但存在一定局限性。

分子標(biāo)記技術(shù)是用于植物分類、鑒別的常用手段，能夠精確、快速鑒定物種之間的親緣關(guān)系。前人通過對5種國蘭的38個品種進行ISSR分子標(biāo)記分析，根據(jù)聚類結(jié)果，選擇遺傳相似系數(shù)不同的親本進行雜交。結(jié)果表明，遺傳相似系數(shù)較低的國蘭親本人工授粉后，未長出成形的蒴果；而遺傳相似系數(shù)較高的國蘭親本經(jīng)授粉后均長出了成形的蒴果，證明了利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)輔助國蘭育種的可行性[8]。唐源江等[9]用SRAP標(biāo)記對華南及鄰近地區(qū)的139份國蘭栽培品種和野生種質(zhì)進行分析，并將國蘭種質(zhì)分為4組：一為春蘭組，由春蘭種質(zhì)單獨構(gòu)成；二為建墨蘭組，主要由建蘭和墨蘭種質(zhì)組成；三為寒蕙蘭組，主要由寒蘭、蕙蘭和其雜交系組成；四為劍蓮蘭組，由春劍和蓮瓣蘭種質(zhì)組成。通過聚類分析表明劍蓮蘭組與寒蕙蘭組親緣關(guān)系最近，與建墨蘭組次之，與春蘭組親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。而利用葉綠體基因組非編碼區(qū)序列作為DNA條形碼對春蘭、蕙蘭、建蘭、寒蘭和墨蘭等5種國蘭的親緣關(guān)系進行分析時，發(fā)現(xiàn)寒蘭與墨蘭的親緣關(guān)系最近，其次為建蘭，春蘭和蕙蘭單獨聚為一支[10]。此外，李麗輝等[11]利用RAPD和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對7種國蘭的21個品種資源進行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，研究結(jié)果表明國蘭品種間的親緣關(guān)系與地理位置分布相關(guān)。以上鑒定結(jié)果為國蘭育種親本的選擇奠定了理論基礎(chǔ)。

3 國蘭雜交育種的研究

蘭花是典型的蟲媒花，在自然狀態(tài)下無法自己授粉，需借助特定的昆蟲進行授粉。蘭科植物種子細(xì)小如塵，發(fā)育不完全，僅具尚未分化的原胚，自然條件下需與合適的菌根真菌共生才能萌發(fā)[12]。國蘭雜交育種通過人為地將擁有優(yōu)良性狀的國蘭親本進行人工授粉，再結(jié)合種子無菌萌發(fā)選育性狀優(yōu)良、穩(wěn)定的后代，是目前國蘭育種的主要手段。

國蘭雜交育種分為種內(nèi)、種間和屬間雜交育種。由于國蘭在自然條件下易產(chǎn)生變異，每個種類都有許多不同的品種，品種之間有時存在巨大差異，利用不同品種進行雜交能夠選育出優(yōu)良的新品種，如春蘭雜交新品種‘宋蝴蝶’、‘大宋梅’、‘福娃梅’、‘賽牡丹’等就是通過種內(nèi)雜交選育而來[3]。此外，在種內(nèi)雜交育種的研究中，王俊萍等[13]通過將不同的春蘭進行種內(nèi)雜交，進而探究春蘭遺傳規(guī)律及蒴果生長過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)成果率與花粉受精后栽培養(yǎng)護的關(guān)系很大，幼果在受精后40 d左右容易受損；研究進一步發(fā)現(xiàn)8—9月是春蘭雜交育種的關(guān)鍵期，在這個時期，春蘭植物易染病導(dǎo)致蒴果夭折。種間雜交育種是國蘭雜交育種的重要方法。2010年《散氏蘭花新雜種登記目錄》公布的以6種國蘭直接為親本進行種間雜交所獲得登錄的雜交種有224個，其中墨蘭有86個，建蘭有57個，春蘭有56個，寒蘭有14個，蕙蘭有10個，蓮瓣蘭有1個[14]。福建省林業(yè)科技試驗中心的李秀娟以建蘭‘冠年’為父本、蓮瓣蘭‘白雪公主’為母本，選育出了蘭花新品種‘玉女丹心’[15]。大花蕙蘭(C. faberi × hybridum)是蘭屬植物通過人工雜交培育出的品種統(tǒng)稱[16]，具有植株強健、花大花多、花色艷麗、花期長等優(yōu)點[17]，常作為國蘭種間雜交育種的重要親本。將大花蕙蘭與國蘭品種的優(yōu)良性狀相結(jié)合，有望培育出花大色艷、株型緊湊美觀且極具幽香的蘭花新品種[18]?！n國桃花’為大花蕙蘭與墨蘭雜交獲得的雜交蘭，花中型、色艷、清香、雅致，集大花蕙蘭的花大、色艷、花期長及國蘭的幽香、典雅和韻味為一體，具有很高的觀賞價值和市場前景[19]。關(guān)于國蘭屬間雜交的研究較少，張志勝等[20]以墨蘭為母本，蝴蝶蘭和文心蘭為父本雜交不結(jié)果，而以建蘭為母本，蝴蝶蘭為父本進行屬間雜交時，結(jié)實率極低，這說明國蘭屬間雜交育種還需解決屬間遺傳不親和性的問題。

近年來，圍繞著國蘭雜交育種影響因素的研究開展了大量的研究。其中，花粉活力與柱頭可授性是雜交育種的重要依據(jù)。楊小丹等[21]探究了花粉活力與柱頭可授性對國蘭雜交結(jié)莢率影響，發(fā)現(xiàn)國蘭花朵開放后0～20 d的花粉活力處于增長期，之后花粉活力隨花朵開放時間的增加而降低。此外，花朵開放相同天數(shù)的不同國蘭品種間的花粉活力差異較大。對于蘭花柱頭可授性而言，大花蕙蘭花朵開放后20～25 d時柱頭都具可授性，不同品種間有差異。花粉活力、柱頭可授性的強弱對結(jié)莢率有一定的影響，一般表現(xiàn)為花粉活力與柱頭可授性越強結(jié)莢率越高。

親本的選擇是雜交育種能否成功的重要依據(jù)。傅巧娟等[22]對春劍、春蘭、墨蘭、蕙蘭、大花蕙蘭和雜交蘭進行不同組合的雜交實驗，發(fā)現(xiàn)國蘭種間雜交結(jié)實率較高，國蘭與大花蕙蘭雜交結(jié)實性明顯較低。不同雜交組合正反交結(jié)實性差異明顯，以大花蕙蘭為母本的雜交組合，其結(jié)實率極低或未結(jié)實，但反交時均有不同程度結(jié)實，同一雜交類型不同雜交組合間結(jié)實性也存在較大區(qū)別。此外，李玉萍等[23]將3個國蘭品種和2個大花蕙蘭品種進行了不同組合的雜交實驗，發(fā)現(xiàn)以春蘭‘綠萼’為母本，以大花蕙蘭‘月影’為父本時雜交效率較高，其雜交后子房膨大率為100%，結(jié)果率為90%。目前國內(nèi)關(guān)于國蘭雜交育種的研究不少，但大都停留在親本雜交結(jié)實率、雜交種子的萌發(fā)及組培體系的建立上，加上雜交育種所需時間長，雜交后代性狀沒有可預(yù)見性，導(dǎo)致真正通過雜交育種選育出具有可推廣性、性狀優(yōu)良的雜交種較少。

4 國蘭組織培養(yǎng)技術(shù)的研究

組織培養(yǎng)作為植物無性繁殖的常用手段，是單倍體育種、多倍體育種、分子育種等的必要環(huán)節(jié)，對于國蘭的育種具有重要意義。關(guān)于蘭花組培的研究主要有兩個方面，一是通過組織培養(yǎng)使種子無菌播種萌發(fā)獲得無菌苗，二是莖尖、側(cè)芽、腋芽、花芽等外植體的離體培養(yǎng)[24]。1920年Knudosn發(fā)現(xiàn)可將蘭花種子用無菌發(fā)芽法獲得幼苗，這對蘭花栽培起到了極大的作用，而后1960年Morel以大花蕙蘭莖尖為外植體誘導(dǎo)形成原球莖并分化成完整植株，自此組織培養(yǎng)技術(shù)逐步在蘭花生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用[25]。

國蘭組織培養(yǎng)技術(shù)的研究起步相對較晚，1973年中國科學(xué)院上海植物生理研究所利用組織培養(yǎng)技術(shù)成功獲得建蘭的無菌植株[26]，此后逐步建立了寒蘭、墨蘭、春蘭、蕙蘭等國蘭的組培體系。在國蘭種子的無菌培養(yǎng)中，劉祥[27]以春蘭和墨蘭的雜交種子為材料，成功獲得了質(zhì)量性狀優(yōu)良的雜種幼苗。而蘇妍[28]以寒蘭和建蘭所得種子為材料，成功的建立了寒蘭和建蘭種子萌發(fā)的組培體系，具體培養(yǎng)基配方為1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭+2.0 g/L蛋白胨+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L瓊脂。此外，付秀芹等[29]等以蕙蘭種子為材料探究蕙蘭組培快繁體系，表明蕙蘭種子萌發(fā)最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭。在國蘭外植體離體培養(yǎng)中，張?zhí)煜鑋30]以寒蘭莖尖為外植體，建立了寒蘭的組培快繁體系，移栽成活率可達(dá)93.33%。

國蘭及其雜交種的中間繁殖體有根狀莖和原球莖或類原球莖兩種類型，中間繁殖體的增殖與分化是國蘭工廠化繁殖的關(guān)鍵，目前國蘭組織培養(yǎng)中關(guān)于中間繁殖體的研究較多。其中，蘇妍[28]和付秀芹等[29]等分別建立了寒蘭和建蘭以及蕙蘭的根狀莖增殖培養(yǎng)、根狀莖分化的組培體系。而龍薔宇等[31]等針對培養(yǎng)基配方對雜交國蘭根狀莖分化的影響進行了系統(tǒng)的研究。此外，謝娟等[32]等的研究結(jié)果表明適宜雜交墨蘭根狀莖增殖的培養(yǎng)基為MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.2 mg/L TDZ+1.5 g/L活性炭+35.0 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂。吳正景等[33]和姚金澳等[34]分別經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加100 mL/L的椰汁或100 g/L香蕉泥能夠顯著提高根狀莖增殖和分化效率。

國蘭組織培養(yǎng)現(xiàn)在雖已取得了一定進展，但其中還存在許多問題，如種子萌發(fā)率低、污染率高、外植體褐化嚴(yán)重、增殖分化及移栽困難等。近年來，圍繞著這些不足開展了大量的研究，取得了長足的進展。其中，羅尚華[35]發(fā)現(xiàn)不同的外植體耐消毒劑的能力不同，如在培育蕙蘭種子的過程中，75%乙醇45 s+0.1%升汞消毒8 min的效果最佳，而在培育春蘭新芽的過程中，75%乙醇45 s+0.1%升汞消毒5 min的消毒效果最佳。此外，李菲菲等[36]認(rèn)為蘭花外植體材料的基因型對褐變的發(fā)生頻率、程度都存在著關(guān)鍵影響，不同種類的蘭花之間褐化程度差異很大。在國蘭組培過程中，為減輕褐化現(xiàn)象，應(yīng)選取褐變較輕的種類或品種，對材料進行消毒、沖洗、熱燙（或熱激）、抗褐化劑浸泡等預(yù)處理。并且，通過在培養(yǎng)初期進行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入檸檬酸、抗壞血酸、聚乙烯吡咯烷酮和活性炭等抗褐化劑，以及勤換瓶和切除愈傷組織褐變部分等措施能夠顯著提高國蘭的組培效率。

5 國蘭多倍體育種的研究

多倍體育種是植物育種的重要方法。多倍體植物具有植株粗壯、花朵碩大、花色艷麗、葉質(zhì)增寬增厚、適應(yīng)性增強及次生代謝物積累量高等特點[37]。多倍體誘導(dǎo)的主要途徑有物理誘導(dǎo)、化學(xué)誘導(dǎo)和2n配子途徑[38]。在國蘭的多倍體育種中，應(yīng)用方法最多的是化學(xué)誘導(dǎo)法。國蘭的多倍體育種是通過化學(xué)誘變劑對材料進行處理并結(jié)合組織培養(yǎng)從而誘導(dǎo)國蘭多倍體的形成，其中，秋水仙素是最常用的化學(xué)誘變劑。在國蘭的多倍體育種中，秋水仙素的處理濃度和處理時間根據(jù)材料的不同和處理的方式而異，其中，處理方式主要分為浸泡法和混培法。王木桂等[39]采用混培法系統(tǒng)的研究了秋水仙素處理時間和處理濃度對墨蘭‘企劍白墨’多倍體誘導(dǎo)效率的影響，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.01%秋水仙素誘導(dǎo)3 d的效果最佳。并且通過表型分析發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)出的四倍體比二倍體更加粗壯，頂端更圓，四倍體植株株型緊湊，葉片質(zhì)地變硬，根明顯增粗。而宋蓮等[40]發(fā)現(xiàn)雜交蘭原球莖在0.03%秋水仙素中浸泡72 h的誘導(dǎo)效率最佳。秋水仙素毒性大且價格昂貴，因此尋找一種毒性小成本低的化學(xué)誘導(dǎo)劑來開發(fā)國蘭的多倍體誘導(dǎo)育種是亟待解決的問題。李涵等[41]以‘黃金小神童’根狀莖為材料，采用安磺靈和甲基磺酸乙酯(EMS)兩種誘導(dǎo)劑進行多倍體誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)根狀莖經(jīng)過0.002%的安磺靈中浸泡48 h后轉(zhuǎn)入含有50 mg/L EMS的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)誘導(dǎo)效果最佳，其多倍體誘導(dǎo)率為52%，誘導(dǎo)出的四倍體株系表現(xiàn)出植株粗壯，葉片增厚帶革質(zhì)、葉色深綠、葉片扭曲等特征。

蘭花在減數(shù)分裂過程中會產(chǎn)生2n配子，因此可以利用2n配子與正常配子受精進行多倍體育種。在此基礎(chǔ)上，徐仕英[42]對不同雜交蘭的2n雄配子發(fā)生率進行了研究并進行雜交實驗，發(fā)現(xiàn)有性三倍體雜交蘭在株寬、花朵數(shù)、株高、假鱗莖直徑、葉片數(shù)等方面顯著高于其對照組二倍體蘭花。多倍體育種作為國蘭育種的一種新型方式，擁有巨大的開發(fā)潛力。但國蘭多倍體育種目前還存在許多問題，如誘變劑濃度難以掌握、嵌合體現(xiàn)象和植株生長緩慢等。2n配子途徑通過將多倍體育種與傳統(tǒng)雜交育種相結(jié)合，可以有效獲得國蘭多倍體植株。在今后的研究中，可以通過尋找易產(chǎn)生2n配子的親本與其它親本進行雜交進而選育性狀優(yōu)良的多倍體國蘭。

6 國蘭分子育種的研究

花朵是蘭花觀賞價值的主要來源之一。近年來，圍繞著國蘭花朵開展了大量的研究，主要包括花型、花香等多種性狀。MADS-box家族基因是已報道的影響植物花器官發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子[43]。在國蘭中，Sun等[44]對蕙蘭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，在轉(zhuǎn)錄組水平共鑒定出34個MADS-box基因，并發(fā)現(xiàn)在這些MADS-box基因中，至少有28個參與了蕙蘭開花時間的調(diào)控。田云芳等[45]從春蘭中克隆了APETALA1-like(AP1)基因，并指出該基因參與了花器官萼片的形成，可能參與了開花時間的調(diào)控。Fei等[46]從蕙蘭中分離出B類PISTILLATA(PI)基因，通過qPCR分析發(fā)現(xiàn)該基因在花被和合蕊柱中表達(dá)量最高。通過在擬南芥pi-1突變體中異源表達(dá)該基因完全恢復(fù)突變體花瓣的發(fā)育，部分恢復(fù)雄蕊的發(fā)育，證明了CyfaPI基因在蕙蘭花被和合蕊柱發(fā)育中的關(guān)鍵作用。此外，夏勝應(yīng)[47]從春蘭中分離了2個C類MADS-box家族基因CygoAG1與CygoAG2，進一步研究證實了這兩個基因的組織表達(dá)特異性，說明了它們在調(diào)控花器官發(fā)育的潛在功能。在國蘭花香、葉色等性狀的研究中，周銀等[48]發(fā)現(xiàn)CfAOC基因的表達(dá)可能與蕙蘭花香合成有關(guān)。張曉瑩等[49]對雜交蘭的葉色進行轉(zhuǎn)錄組測序和表型分析，鑒定了參與蘭花葉色形成的NAC、MYB和bHLH等調(diào)控因子。此外，李玉霞等[50]克隆了蕙蘭CIN同源基因CfCIN，并通過異源表達(dá)證實CfCIN參與了葉片的形態(tài)建成。以上這些研究為利用分子育種手段進行國蘭觀賞價值的開發(fā)奠定了基因資源和理論基礎(chǔ)。但由于國蘭缺乏高效的轉(zhuǎn)基因體系，導(dǎo)致國蘭分子育種進展緩慢。這主要是蘭科植物對農(nóng)桿菌不敏感，且在遺傳轉(zhuǎn)化過程中缺乏合適的表達(dá)載體[51-52]。在此基礎(chǔ)上，孔凡龍[53]初步建立了一套適合于春蘭的遺傳轉(zhuǎn)化體系，轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)過GUS染色和PCR檢測，證明GUS基因已成功整合到春蘭的基因組中。此外，Tong等[54]建立了蝴蝶蘭的CRISPR-Cas9基因編輯體系，并通過該體系成功獲得了蝴蝶蘭MADS44、MADS36和MADS8的突變株系。盡管如此，但目前利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對國蘭進行品種改良的研究還少有報道。

7 問題與展望

國蘭的育種工作目前還主要以傳統(tǒng)育種為主，包括馴化育種、雜交育種等，但這些育種方式存在著育種時限長、雜交后代性狀不可預(yù)測、對國蘭種質(zhì)資源有破壞性等問題，這在一定程度上制約了國蘭育種的發(fā)展。隨著基因組大數(shù)據(jù)時代的來臨，分子育種在育種技術(shù)中所占比例越來越重，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因編輯技術(shù)對國蘭葉型、葉色、花香、花色以及花型等進行遺傳改良將成為育種發(fā)展的重要方向。我國國蘭種質(zhì)資源豐富，將現(xiàn)有種質(zhì)資源進行收集并采用分子標(biāo)記等技術(shù)進行種質(zhì)鑒定，利用分子育種等現(xiàn)代育種方式對現(xiàn)有種質(zhì)進行性狀改良，并結(jié)合組織培養(yǎng)技術(shù)使其實現(xiàn)快速繁殖必將成為國蘭實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化、商品化的新趨勢。