Maresin 1激活Nrf2信號通路減輕低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷

楊 光，鐘妮爾，王 瑞，李 煒，安慧仙(陜西省人民醫(yī)院心血管內(nèi)二科，西安 70068；西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院心內(nèi)二科；通訊作者,E-mail:anhuixian6789@63.com)

急性心肌梗死是一個常見的心血管疾病，其發(fā)病率、死亡率和致殘率都很高[1,2]。急性心肌梗死是由冠狀動脈供血阻斷引起的，其產(chǎn)生持續(xù)性的缺血和缺氧，繼而引起嚴重的心肌損傷和心肌功能障礙[3,4]。目前，恢復(fù)冠狀動脈供血是治療急性心肌梗死的重要手段。但是，血流再灌注會導(dǎo)致心肌的第二次損傷，臨床上稱之為心肌缺血再灌注損傷[5,6]。氧化應(yīng)激是心肌缺血再灌注損傷進展的重要因素，活性氧(reactive oxygen species，ROS)的持續(xù)積累，會導(dǎo)致心肌細胞凋亡和壞死等一系列不良反應(yīng)[7-9]。雖然細胞本身具有抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)，但并不能完全有效地抵抗氧化應(yīng)激產(chǎn)生的損傷。因此，探尋新的抗氧化應(yīng)激防治手段和藥物，對治療心肌缺血再灌注損傷具有十分重要的意義。

核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是氧化應(yīng)激的主導(dǎo)調(diào)節(jié)因子[10,11]。當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時，細胞質(zhì)中的Nrf2蛋白與抑制分子分離，并向細胞核內(nèi)遷移。當(dāng)進入細胞核后，Nrf2蛋白與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，激活下游基因血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)和醌氧化還原酶1(quinone oxidoreductase 1，NQO1)的表達，從而發(fā)揮抗氧化和細胞保護等生物學(xué)效應(yīng)。越來越多的研究表明，增強Nrf2的激活可以有效地保護心肌缺血再灌注損傷[12-14]。Nrf2通路的激活受多種機制的調(diào)控，許多藥物對Nrf2都具有潛在的調(diào)控作用[15,16]。因此，探尋可增強Nrf2激活的藥物，對心肌缺血再灌注損傷的治療具有十分重要的意義。

Maresin-1(MaR1)是二十二碳六烯酸的衍生代謝產(chǎn)物，具有良好的抗氧化和抗凋亡活性[17]。研究表明，MaR1對多種組織和器官的損傷具有保護作用[18-21]。有趣的是MaR1對一些器官的缺血再灌注損傷也具有保護作用，包括腦、肝、腎和肺的缺血再灌注損傷[22-25]。目前，關(guān)于MaR1是否對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用，還沒有相關(guān)研究。本研究通過心肌細胞的低氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxyge-nation，H/R)模型來模擬體內(nèi)心肌缺血再灌注損傷，來檢測MaR1對低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響，并探討其可能的分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

MaR1購自美國Cayman Chemical公司(純度>98%)；HL-1小鼠心肌細胞購自北京BeNa Culture Collection公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自武漢Procell生命科技有限公司；CCK-8、LDH、TUNEL和SOD檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；ROS和MDA檢測試劑盒購自西安萬類生物科技有限公司；Lab-Tek載玻片小室購自美國Thermo Fisher Scientific公司；兔抗鼠Nrf2抗體、Lamin B1抗體、α-actin抗體、HO-1抗體、NQO1抗體和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Nrf2抑制劑ML385購自上海Selleck公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和低氧/復(fù)氧模型的建立 HL-1細胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中，并添加10%的胎牛血清，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將心肌細胞置于厭氧培養(yǎng)箱中(1% O2、5% CO2和94%N2)，于37 ℃條件下孵育6 h；將細胞轉(zhuǎn)移至常氧培養(yǎng)箱中(5%CO2和95%空氣)，于37 ℃條件下孵育12 h，進行低氧/復(fù)氧模型建立。

1.2.2 MaR作用研究分組 將細胞分為常氧對照組、低氧/復(fù)氧組、低氧/復(fù)氧+溶劑組和低氧/復(fù)氧+MaR1組。常氧對照組細胞置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。低氧/復(fù)氧組細胞僅進行低氧/復(fù)氧處理。參考文獻報道[18,19]，將MaR1的使用濃度確定為50 nmol/L。將MaR1溶于二甲基亞砜，配置成溶液。低氧/復(fù)氧+溶劑組中，將溶劑二甲基亞砜加入到細胞培養(yǎng)基中，預(yù)處理細胞30 min后，進行低氧/復(fù)氧模型建立。低氧/復(fù)氧+MaR1組中，將MaR1溶液加入細胞培養(yǎng)基中，至終濃度達到50 nmol/L，預(yù)處理細胞30 min后，進行低氧/復(fù)氧模型建立。

1.2.3 Nrf2抑制劑研究分組 將細胞分為常氧對照組、低氧/復(fù)氧組、低氧/復(fù)氧+溶劑組、低氧/復(fù)氧+MaR1組和低氧/復(fù)氧+MaR1+ML385組。常氧對照組、低氧/復(fù)氧組、低氧/復(fù)氧+溶劑組和低氧/復(fù)氧+MaR1組的細胞處理，參考1.2.2分組處理。低氧/復(fù)氧+MaR1+ML385組中，將MaR1和ML385溶液加入細胞培養(yǎng)基中，使MaR1終濃度達到50 nmol/L和ML385終濃度達到5 μmol/L，預(yù)處理細胞30 min后，進行低氧/復(fù)氧模型建立。

1.2.4 CCK-8實驗檢測心肌細胞存活率 制備細胞懸浮液并接種到96孔培養(yǎng)板，按照1.2.2分組進行處理。處理完成后，更換培養(yǎng)基，并加入CCK-8溶液(10 μl/孔)，置于37 ℃、5% CO2的條件下，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。酶標(biāo)儀用于測量細胞溶液在450 nm波長下的吸光度。

1.2.5 LDH細胞毒性實驗檢測心肌細胞上清中LDH的活性 細胞按照1.2.2分組進行處理。處理完成后，收集細胞，進行離心，吸取上清液加入到另一個96孔培養(yǎng)板中(120 μl/孔)。然后，加入LDH檢測液(60 μl/孔)，混合均勻，在室溫黑暗中孵育30 min，然后在490 nm處測量吸光度。

1.2.6 TUNEL實驗檢測心肌細胞的凋亡率 在Lab-Tek載玻片小室上培養(yǎng)HL-1心肌細胞，按照1.2.2和1.2.3分組進行處理。處理完成后，加入4%多聚甲醛固定細胞30 min。PBS洗滌細胞，加入含0.3% Triton X-100的PBS，室溫孵育5 min。PBS洗滌細胞，每孔加入50 μl TUNEL檢測液，于37 ℃避光孵育60 min。去除反應(yīng)液，PBS洗滌細胞，加入DAPI溶液，室溫避光孵育10 min，對細胞核進行染色。PBS洗滌細胞后，用抗熒光淬滅封片液封片，采用熒光顯微鏡進行觀察和拍照。使用激發(fā)/發(fā)射波長488/550 nm，觀察綠色熒光(TUNEL染色陽性細胞)。使用激發(fā)/發(fā)射波長364/454 nm，觀察藍色熒光(DAPI核染色)。

1.2.7 流式細胞術(shù)檢測心肌細胞中ROS的產(chǎn)生水平 細胞按照1.2.2和1.2.3分組進行處理。采用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA探針，使其濃度達到10 μmol/L。待細胞處理完成后，去除舊培養(yǎng)基，加入含有DCFH-DA探針的無血清培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。然后，采用熒光酶標(biāo)儀檢測熒光強度。

1.2.8 MDA實驗檢測心肌細胞中MDA的含量 細胞按照1.2.2分組進行處理。處理完成后，收集細胞，加入PBS進行勻漿，離心后取上清。加入檢測試劑，漩渦混勻，95 ℃沸水浴40 min。取出后，用自來水冷卻，然后離心取上清，在532 nm處測量吸光度值。

1.2.9 WST-8法檢測心肌細胞中SOD的活性 細胞按照1.2.2分組進行處理。處理完成后，收集細胞，加入SOD制備液，充分裂解細胞。吸取20 μl上清，加入160 μl酶工作液和20 μl反應(yīng)啟動液。在37 ℃條件下，反應(yīng)30 min后，在450 nm下測量吸光度。

1.2.10 Western blotting檢測Nrf2、HO-1和NQO-1的蛋白表達 細胞按照1.2.2和1.2.3分組進行處理。處理完成后，收集細胞，采用總蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白。用細胞核蛋白提取試劑盒提取核蛋白。收集樣品，測定蛋白質(zhì)濃度，將蛋白樣品和SDS上樣緩沖液混合，進行煮沸變性處理。取蛋白樣品，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜浸入5%脫脂奶粉溶液中，并在室溫下密封1 h。添加第一抗體(Nrf2抗體的稀釋度為1 ∶2 000；HO-1抗體的稀釋度為1 ∶1 000；NQO-1抗體的稀釋度為1 ∶1 000；α-actin抗體的稀釋度為1 ∶1 000；Lamin B1抗體的稀釋度為1 ∶3 000)，并在4 ℃搖床中培養(yǎng)過夜。清洗膜后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(稀釋度為1 ∶5 000)，室溫孵育1 h。清洗膜后，加入ECL試劑進行顯色反應(yīng)。將膜置于凝膠成像儀內(nèi)，進行曝光和圖像采集。

1.2.11 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和作圖。實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析方法分析數(shù)據(jù)，組間比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MaR1提高低氧/復(fù)氧損傷心肌細胞的存活率

CCK-8實驗結(jié)果顯示，與常氧對照組比較，低氧/復(fù)氧組心肌細胞的存活率顯著降低(P<0.01)；與低氧/復(fù)氧組和低氧/復(fù)氧+溶劑組比較，低氧/復(fù)氧+MaR1組心肌細胞的存活率升高(P<0.01，見圖1)。LDH實驗結(jié)果顯示，與常氧對照組相比，低氧/復(fù)氧組心肌細胞中的LDH活性顯著增加(P<0.01)；與低氧/復(fù)氧組和低氧/復(fù)氧+溶劑組比較，低氧/復(fù)氧+MaR1組心肌細胞中的LDH活性降低(P<0.01，見圖1)。

與常氧對照組比較，**P<0.01；與低氧/復(fù)氧組和低氧/復(fù)氧+溶劑組比較，&&P<0.01圖1 MaR1對低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的影響Figure 1 Effect of MaR1 on H/R-induced cardiomyocyte injury

2.2 MaR1減輕低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡

TUNEL實驗結(jié)果顯示，與常氧對照組比較，低氧/復(fù)氧組凋亡心肌細胞數(shù)量顯著增加(P<0.01)；與低氧/復(fù)氧組和低氧/復(fù)氧+溶劑組比較，低氧/復(fù)氧+MaR1組凋亡心肌細胞數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖2)。

綠色熒光為TUNEL染色細胞，表示凋亡細胞；藍色熒光為細胞核，表示總細胞數(shù)量；與常氧對照組比較，**P<0.01；與低氧/復(fù)氧組和低氧/復(fù)氧+溶劑組比較，&&P<0.01圖2 MaR1對低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的影響 (TUNEL染色，×200)Figure 2 Effect of MaR1 on H/R-induced cardiomyocyte apoptosis (TUNEL staining,×200)

2.3 MaR1減輕低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞的氧化應(yīng)激

ROS實驗結(jié)果顯示，與常氧對照組比較，低氧/復(fù)氧組心肌細胞中ROS水平顯著升高(P<0.01)；與低氧/復(fù)氧組和低氧/復(fù)氧+溶劑組比較，低氧/復(fù)氧+MaR1組心肌細胞中ROS水平降低(P<0.01，見圖3)。MDA實驗結(jié)果顯示，與常氧對照組比較，低氧/復(fù)氧組心肌細胞中MDA含量顯著增加(P<0.01)；與低氧/復(fù)氧組和低氧/復(fù)氧+溶劑組比較，低氧/復(fù)氧+MaR1組心肌細胞中MDA含量減少(P<0.01，見圖3)。SOD實驗結(jié)果顯示，與常氧對照組相比，低氧/復(fù)氧組心肌細胞中SOD活性顯著降低(P<0.01)；與低氧/復(fù)氧組和低氧/復(fù)氧+溶劑組比較，低氧/復(fù)氧+MaR1組心肌細胞中SOD活性升高(P<0.01，見圖3)。

與常氧對照組比較，**P<0.01；與低氧/復(fù)氧組和低氧/復(fù)氧+溶劑組比較，&&P<0.01圖3 MaR1對低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響Figure 3 Effect of MaR1 on H/R-induced oxidative stress in cardiomyocytes

2.4 MaR1增強低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞中Nrf2的激活

Western blotting結(jié)果顯示，與常氧對照組比較，低氧/復(fù)氧組Nrf2蛋白在細胞核中的表達量顯著增加(P<0.05，見圖4)；與低氧/復(fù)氧組和低氧/復(fù)氧+溶劑組比較，低氧/復(fù)氧+MaR1組Nrf2蛋白在細胞核中的表達量增加(P<0.01，見圖4)。另外，與常氧對照組比較，低氧/復(fù)氧組Nrf2下游基因HO-1和NQO1的表達水平顯著上升(P<0.05，見圖4)；與低氧/復(fù)氧組和低氧/復(fù)氧+溶劑組比較，低氧/復(fù)氧+MaR1組HO-1和NQO1的表達水平增加(P<0.01，見圖4)。

與常氧對照組比較，*P<0.05；與低氧/復(fù)氧組和低氧/復(fù)氧+溶劑組比較，&&P<0.01圖4 MaR1對低氧/復(fù)氧處理的心肌細胞中Nrf2激活的影響Figure 4 Effect of MaR1 on Nrf2 activation in H/R-induced cardiomyocytes

2.5 抑制Nrf2逆轉(zhuǎn)MaR1介導(dǎo)的心肌細胞保護作用

為了驗證MaR1通過激活Nrf2來抑制低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷，我們進一步觀察了抑制Nrf2對MaR1介導(dǎo)的心肌細胞保護作用的影響。Western blotting結(jié)果顯示，與低氧/復(fù)氧+MaR1組比較，低氧/復(fù)氧+MaR1+ML38組Nrf2蛋白在細胞核中的表達量降低(P<0.01，見圖5)。TUNEL實驗結(jié)果顯示，與低氧/復(fù)氧+MaR1組比較，低氧/復(fù)氧+MaR1+ML38組凋亡心肌細胞數(shù)量增加(P<0.01，見圖5)。ROS檢測實驗結(jié)果顯示，與低氧/復(fù)氧+MaR1組比較，低氧/復(fù)氧+MaR1+ML38組心肌細胞中ROS水平升高(P<0.01，見圖5)。

與常氧對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與低氧/復(fù)氧組和低氧/復(fù)氧+溶劑組比較，&&P<0.01；與低氧/復(fù)氧+MaR1組比較，△△P<0.01圖5 Nrf2抑制對MaR1介導(dǎo)的心肌細胞保護作用的影響Figure 5 Effect of Nrf2 inhibition on MaR1-mediated cardioprotective effect

3 討論

過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)是心肌缺血再灌注損傷的主要病理變化。探尋新的具有抗氧化活性的藥物，來抑制心肌缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，是目前研究的一個熱點方向。本項目中，我們發(fā)現(xiàn)MaR1在低氧/復(fù)氧心肌細胞模型表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，其可有效減輕低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷和氧化應(yīng)激，并進一步證實了其抗氧化活性與增加Nrf2的激活密切相關(guān)。

據(jù)報道，MaR1對一些器官和組織的損傷，具有良好的保護作用。MaR1可減輕敗血癥或脂多糖在小鼠中誘導(dǎo)的急性腎損傷[19,26]。Zhang等[27]報道，MaR1可減輕伴刀豆球蛋白A誘導(dǎo)的急性肝損傷。Ma等[20]報道，MaR1對創(chuàng)傷失血性休克引起的急性肺損傷也具有保護作用。另外，MaR1對一些器官的缺血再灌注損傷也發(fā)揮保一定的保護作用。在動物模型研究中發(fā)現(xiàn)，MaR1可保護肺、腎、肝和腦受到的缺血再灌注損傷[22-25]。目前，關(guān)于MaR1對心臟的缺血再灌注損傷是否具有保護作用，還沒有相關(guān)研究。本研究中，我們通過構(gòu)建心肌細胞的低氧/復(fù)氧模型來模擬體內(nèi)心肌缺血再灌注損傷，來檢測MaR1對心肌缺血再灌注損傷的可能作用。我們的實驗結(jié)果顯示，采用MaR1處理心肌細胞，可顯著減輕低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷。本研究表明，MaR1對低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷具有保護作用。

MaR1的細胞保護效應(yīng)與其抗凋亡和抗氧化活性密切相關(guān)。MaR1可抑制紫外線引起的角細胞凋亡和氧化應(yīng)激[28]。MaR1可減少脂多糖在肝細胞中誘導(dǎo)的細胞凋亡和ROS的產(chǎn)生[18]。在脂多糖刺激的腎小管上皮細胞中，MaR1處理可抑制細胞凋亡，并且阻斷ROS的產(chǎn)生[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，MaR1可提高低氧/復(fù)氧損傷的心肌細胞的存活率，并且抑制其細胞凋亡。另外，在低氧/復(fù)氧處理的心肌細胞中，MaR1處理可降低ROS水平和MDA含量，而提高SOD活性，表明MaR1對低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激具有顯著的抑制作用。我們的研究結(jié)果表明，MaR1在低氧/復(fù)氧損傷的心肌細胞中發(fā)揮抗凋亡和抗氧化作用。

MaR1可通過激活Nrf2信號通路來發(fā)揮其保護效應(yīng)。在肺、腎和肝器官的缺血再灌注過程中，MaR1可通過提高Nrf2蛋白的核轉(zhuǎn)移和增加下游基因的表達，來減輕組織損傷[24,25,29]。在結(jié)腸炎動物模型中，MaR1可通過增強Nrf2信號通路的激活，來減輕炎癥和氧化應(yīng)激等不良反應(yīng)[30]。另外，MaR1也可通過增強Nrf2信號通路的激活，來抑制肝纖維化引起的氧化應(yīng)激[31]。鑒于Nrf2對低氧/復(fù)氧心肌損傷也發(fā)揮保護作用，本研究進一步驗證了MaR1是否通過調(diào)控Nrf2來減輕低氧/復(fù)氧心肌損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MaR1可增加Nrf2蛋白在低氧/復(fù)氧處理的心肌細胞的細胞核中的表達量，并且增加下游基因HO-1和NQO1的表達。已有研究證實，MaR1可促進Nrf2蛋白的核轉(zhuǎn)移，但其具體分子作用機制并不明確[29,31]。本研究結(jié)果表明，MaR1可增加Nrf2蛋白在細胞核中的表達量，并沒有直觀地顯示核轉(zhuǎn)移水平，因此研究結(jié)果具有一定的局限性。但是，Nrf2在細胞核中的表達量增加，也可以一定程度上表明Nrf2的激活。采用Nrf2抑制劑處理細胞，則顯著逆轉(zhuǎn)MaR1介導(dǎo)的對低氧/復(fù)氧處理的心肌細胞的抗凋亡和抗氧化作用。因此，我們的研究表明MaR1對低氧/復(fù)氧心肌損傷的保護作用與激活Nrf2密切相關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，MaR1可減輕低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡和氧化應(yīng)激，其發(fā)揮心肌保護的機制是通過激活Nrf2信號通路實現(xiàn)的。但是，本項目通過細胞模型得到的體外實驗數(shù)據(jù)，需要通過動物模型來進一步驗證。未來，我們將建立缺血再灌注心肌動物模型，以驗證MaR1對心肌缺血再灌注損傷的保護作用，并進一步闡明其機制，為MaR1的臨床治療應(yīng)用提供更堅實的理論基礎(chǔ)。