氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考?xì)埩袅?的不確定度分析

謝翠美，姚婉儀，胡浩光，劉少彬，彭家杰

（東莞市動物疫病預(yù)防控制中心，廣東東莞 523000）

酰氨醇類又稱氯霉素類抗生素，是在獸醫(yī)臨床上用于治療畜禽以及水產(chǎn)動物細(xì)菌性疾病的廣譜抗生素，主要包括氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考[1]。在水產(chǎn)品監(jiān)測監(jiān)管中氯霉素（Chloramphenicol，CAP)屬于禁用藥物，而氟苯尼考（Florfenicol，F(xiàn)FC)和甲砜霉素（Thiamphenicol，TAP)屬于限用藥物。這些藥物一旦在水產(chǎn)品或環(huán)境中殘留，不但威脅消費者的健康，還抑制水產(chǎn)行業(yè)的發(fā)展[2]。

相同濃度的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考待測液，在使用液質(zhì)聯(lián)用儀（AB API4000+）與液質(zhì)聯(lián)用儀（Waters）檢測時很容易發(fā)現(xiàn)：選擇前者的負(fù)離子模式檢測時檢測信號好，其穩(wěn)定性更高。為了使檢測結(jié)果更可信，計算其測定不確定度非常有必要，且在表述完整的測量結(jié)果時，應(yīng)包括測量不確定度，測量不確定度是表征合理地賦予被測量值的分散性[3-4]，與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)[5]。本文深入探討使用液質(zhì)聯(lián)用儀（AB API4000+）檢測水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考?xì)埩袅康牟淮_定度的影響因素，并對這些影響因素進行分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（AB API4000+）[7]；氮吹儀；氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品（99.24%±0.77%）、甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品（99.43%±0.5%）、氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品（99.90%± 0.30%）、氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)品（100.0 mg·L-1），均購于Dr.Ehrenstorfer公司；電子天平（精準(zhǔn)至0.001 g與 0.00001g）；乙酸乙酯、正己烷、甲醇等有機試劑均是Fisher品牌；超純水（達(dá)到一級水標(biāo)準(zhǔn)）；氨水（國藥）。

1.2 方法依據(jù)及測定流程

本實驗方法依據(jù)《可食動物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康臏y定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB/T 20756—2006）[6]。測定流程圖見圖1。

1.3 儀器條件

LC-MS（AB API4000+）工作參數(shù)設(shè)置為電噴霧離子源；ESI-；C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速： 0.40 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL；流動相設(shè)置比例為乙腈∶水=25∶75；出峰時間：10 min。

2 不確定度評定

2.1 建立數(shù)學(xué)模型

樣品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考?xì)埩袅康臄?shù)學(xué)模型為

式中：X為使用LC-MS(AB API4000+)檢測氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的殘留量，μg·kg-1；C為回歸直線方程擬合得樣品溶液中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考濃度，ng·mL-1；V為待測溶液的定容體積，mL；m為稱樣量，g；f—r為回收率，%。

2.2 分析確定不確定度來源

影響測量試樣中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考等殘留量的因素有重復(fù)性測量，校準(zhǔn)擬合曲線，樣品復(fù)溶時定容體積，稱樣，配制氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考標(biāo)液，配制氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考內(nèi)標(biāo)，回收率，以及LC-MS自身的校準(zhǔn)因子。

2.3 各種不確定度分量的評定

2.3.1 重復(fù)測量時引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C1)

重復(fù)測量氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考引起的不確定度分量urel(C1)（不確定度A類標(biāo)準(zhǔn)），用標(biāo)準(zhǔn)偏差表示（算術(shù)平均值）。重復(fù)性引入：重復(fù)測量6次未知濃度樣品算出平均值，其標(biāo)準(zhǔn)偏差Sa及urel(C1)見表1。

圖1 測定流程

表1 測定結(jié)果與其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度（n=6）

2.3.2 校準(zhǔn)擬合曲線引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C2)

配制一條8個點的標(biāo)準(zhǔn)系列曲線，標(biāo)曲的濃度成梯度，對各個濃度點測量1次，繪制坐標(biāo)軸，橫坐標(biāo)為標(biāo)液濃度cis，縱坐標(biāo)為標(biāo)液峰面積比Ais，最小二乘法擬合，可得A=a+b×c，線性系數(shù)r。詳見 表2。

表2 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度-峰面積

氯霉素的線性方程為y=1.36x-0.0119，r=0.996； 甲砜霉素的線性方程為y=0.412x-0.00786，r=0.997； 氟苯尼考的線性方程為y=0.722x-0.000825，r=0.996。

測量1次待測液（P=1），式中樣品濃度ci是峰面積比A，校準(zhǔn)擬合曲線的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。其中各項目標(biāo)液面積比殘差的標(biāo)準(zhǔn)差為；校 準(zhǔn)擬合曲線的斜率：b，截距：a；標(biāo)準(zhǔn)溶液平均濃 度值；配制的是8個點的梯度標(biāo)液，故n=8； 各個標(biāo)準(zhǔn)濃度點只測量了1次：N=1；， 計算結(jié)果見表3。

表3 曲線校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.3.3 定容體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C3)

樣品定容使用5 mL移液搶移取3 mL水溶液定容，檢定證書給出的擴展不確定度U=1.8 μL，k=2，由此得標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。 本試驗在20 ℃進行，溫度對體積的影響可忽略。

2.3.4 樣品稱量引入標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C4)

使用百分之一電子天平稱量樣品，其擴展不確定度U=0.05 g，k=2。稱5.00 g樣品引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

2.3.5 配制氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考標(biāo)液引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C5)

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)自身量值引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C51)。由氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的證書可查其自身量值與其擴展不確定度，則可算出標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

（2）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C52)。由電子天平（精準(zhǔn)至0.00001 g）的檢定證書得知，U= 0.017 mg，k=2。稱標(biāo)準(zhǔn)品時引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（3）配制標(biāo)液定容時引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C53)。 定容需使用容量瓶（100 mL），查該容量瓶檢定證書可知U=0.05 mL，k=2。則

（4）稀釋標(biāo)液，移取與定容引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C54)。稀釋時需用到1.00 mL移液器、100 mL容量瓶各1次，查兩者檢定證書，可計算稀釋引入的不確定度分別為

外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液在配制時引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度如下

氯霉素：

甲砜霉素：

氟苯尼考：

2.3.6 內(nèi)標(biāo)氘代標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C6)

（1）內(nèi)標(biāo)氘代標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（CAP-D5）純度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C61)。氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素的內(nèi)標(biāo)：CAP-D5，其自身量值不確定度見表5。

表5 CAP-D5純度的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

（2）移取CAP-D5引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C62)。使用1000 μL移液器移取內(nèi)標(biāo)物1 mL，查其校準(zhǔn)證書可知U=1.3 μL，k=2，=0.00065。

（3）定容CAP-D5引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C63)。100 mL容量瓶U=0.05 mL，k=2，=0.000025。

（4）稀釋CAP-D5引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C64)。逐級稀釋內(nèi)標(biāo)儲備液，需使用2次1000 μL移液器和容積為10 mL與50 mL容量瓶各1次，稀釋引入的不確定度為

（5）加入CAP-D5引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C65)。加入75 μL CAP-D5工作液，需用100 μL可調(diào)移液器1次，查其校準(zhǔn)證書可知U=0.18 μL，k=2，。

內(nèi)標(biāo)引入的不確定度如下

2.3.7 提取回收率引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C7)

按液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埖暮浚叫袦y試6次加標(biāo)樣，加標(biāo)量是1.00 μg·kg-1，用公式計算加標(biāo)回收的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，按均勻分布，，計算結(jié)果見表6。

2.3.8 LC-MS自身校準(zhǔn)因子引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C8)

根據(jù)儀器校準(zhǔn)證書，U=12%，k=2，則

2.4 評定測量值之間的相互關(guān)系

氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)?個項目的測量值之間無相關(guān)性。

2.5 計算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

將上述各項不確定度分量代入公式(2)，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果如表7所示。

2.6 計算擴展不確定度

取包含因子k=2（95%置信概率），其擴展不確定度用U=k×C×urel(C)表示，結(jié)果見表8。

3 結(jié)論

通過以上不確定度評定分析得知，利用負(fù)離子較穩(wěn)定的AB液質(zhì)聯(lián)用儀對甲砜霉素、氯霉素、氟苯尼考進行測量，影響其測量結(jié)果的因素是其自身的校準(zhǔn)因子，此外回收率與工作曲線的擬合校準(zhǔn)率也不容忽視，因此檢測人員不但要注意檢測過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也要經(jīng)常對儀器進行清洗維護，確保儀器處于最優(yōu)的運行狀態(tài)。

表6 樣品加標(biāo)回收的不確定度

表7 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

表8 不確定度評定結(jié)果