沒食子酸對酵母細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用研究

白海娜

（吉林化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，吉林吉林 132022）

沒食子酸（Gallic Acid，GA）是一種天然的多酚化合物，是大多數(shù)植物中存在的次級代謝產(chǎn)物。沒食子酸廣泛存在于堅(jiān)果、茶、葡萄、不同漿果、石榴、芒果和漆樹等植物中，具有抗氧化、抗菌、抗炎和抗癌等作用[1-4]，在醫(yī)藥、食品、涂料、有機(jī)合成等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[5-6]。研究證實(shí)，沒食子酸在生物體內(nèi)能夠有效清除羥基自由基和黃嘌呤氧化酶自由基，從而抑制人肝微粒體細(xì)胞色素P4503A介導(dǎo)的氧化作用，減少組織中活性氧的堆積，發(fā)揮其在體內(nèi)的抗氧化作用[7-8]。沒食子酸在生物體內(nèi)有氧化作用，能抑制小鼠紅細(xì)胞的溶血活性[9]。沒食子酸對大腸桿菌有應(yīng)激抑制作用，XU等[10]通過總結(jié)發(fā)酵特征和轉(zhuǎn)錄分析，闡明了大腸桿菌3110對沒食子酸反應(yīng)的生理機(jī)制。與對照組（無應(yīng)激）相比，在高濃度的沒食子酸應(yīng)激情況下，細(xì)胞生長嚴(yán)重滯后，出現(xiàn)不規(guī)則的細(xì)胞形態(tài)。大腸桿菌的葡萄糖消耗量隨著發(fā)酵培養(yǎng)基中沒食子酸含量的增加而相繼減少。沒食子酸因具有抗氧化作用被作為抗氧化劑應(yīng)用于食品等相關(guān)行業(yè)[11-12]，其兼有的抗菌、抗炎等生理功能使其在提高動(dòng)物生產(chǎn)性能和改善動(dòng)物健康狀況方面已有較多研究[13-16]。本文通過測定酵母細(xì)胞的生長曲線，選取對數(shù)期酵母細(xì)胞進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)，采用平板菌落計(jì)數(shù)法，研究沒食子酸對酵母細(xì)胞的毒性作用及其對紫外氧化損傷酵母細(xì)胞的保護(hù)作用，以期為其在抗氧化劑的應(yīng)用方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

酵母菌，安琪牌高活性干酵母活化而得；沒食子酸，中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；無水葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、瓊脂粉、蛋白胨，阿拉丁試劑有限公司；酵母膏，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司。

1.2 儀器

高壓蒸汽滅菌鍋、電子天平、恒溫水浴搖床、紫外光光度計(jì)、超凈工作臺、離心機(jī)和生物恒溫培養(yǎng)箱。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 YPD或YEPD培養(yǎng)基

①液體培養(yǎng)基配制。將10 g酵母膏，20 g蛋白胨，20 g葡萄糖溶于1000 mL水中，在115 ℃下滅菌 20 min。②固體培養(yǎng)基配制。取部分液體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂粉，在115 ℃下滅菌20 min。

1.3.2 酵母菌生長曲線

（1）酵母菌活化。在無菌條件下，將1%酵母粉末加入滅菌后的5%葡萄糖溶液中。置于28 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)（轉(zhuǎn)速200 r·min-1）活化3 h。

（2）酵母菌的YEPD液體培養(yǎng)。按1%比例將酵母菌液轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基中，置于28 ℃搖床振蕩培養(yǎng)（轉(zhuǎn)速200 r·min-1）5 h，將酵母培養(yǎng)至對數(shù)期，可冷藏保存。

（3）酵母菌的生長曲線。從搖晃均勻后的酵母菌YEPD液體培養(yǎng)基中無菌取出菌液，加入到滅菌過的新鮮YEPD液體培養(yǎng)基中，每間隔2 h測定吸光度數(shù)值，最終測得24 h的吸光度，用稀釋后的混合液吸光度乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)得吸光度數(shù)值。以接種后 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h和24 h為橫坐標(biāo)，以吸光度乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)為縱坐標(biāo)，最終繪制出酵母細(xì)胞24 h的生長曲線。

1.3.3 沒食子酸對酵母細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)

（1）收集菌體。將培養(yǎng)至對數(shù)期的酵母菌菌液置于離心管中，然后用離心機(jī)4000 r·min-1離心5 min，倒掉上清液，收集菌體。用磷酸鹽緩沖液（pH=6.9）洗1～2次，并再次加入磷酸緩沖液得酵母菌懸液。

（2）正常對照組。取最終稀釋搖勻后的菌液 1.9 mL再加入0.1 mL磷酸緩沖液為正常對照組，分別移取100 μL于3個(gè)平行固體YEPD培養(yǎng)基中。

（3）樣品組。取最終稀釋搖勻后的菌液1.9 mL再加入0.1 mL的沒食子酸樣品為樣品組，確定6組沒食子酸終濃度分別為GA-1（6.25 μg·mL-1）、GA-2（12.50 μg·mL-1）、GA-3（25.00 μg·mL-1）、GA-4 （50.00 μg·mL-1）、GA-5（100.00 μg·mL-1）和GA-6（200.00 μg·mL-1）。

（4）細(xì)胞培養(yǎng)。將最終涂布好的所有培養(yǎng)皿放入28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，菌落計(jì)數(shù)。酵母細(xì)胞存活率的計(jì)算公式為

式中：Ai為實(shí)驗(yàn)組酵母單菌落數(shù)；Aj為空白組酵母單菌落數(shù)；A0為對照組酵母單菌落數(shù)。

1.3.4 沒食子酸對紫外損傷酵母細(xì)胞的保護(hù)作用

取正常對照組以及樣品組4種混合溶液各 2 mL，在致死條件（紫外燈的功率20 W，樣品距離光源30 cm，照射時(shí)間60 s）下進(jìn)行紫外照射處理，每種樣品各取100 μL分別涂布于YEPD固體培養(yǎng)基上。將一定濃度的酵母細(xì)胞均勻涂布在平板培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，菌落計(jì)數(shù)。按式（1）計(jì)算酵母細(xì)胞存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的生長曲線

單細(xì)胞微生物的生長過程通常分為4個(gè)階段，即適應(yīng)期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。由圖1知，酵母菌的生長曲線清晰地反映了酵母菌的4個(gè)生長階段，初始階段0～5 h為酵母菌生長的遲滯期； 5～14 h的生長曲線呈大幅上升趨勢，酵母菌經(jīng)過短暫的適應(yīng)期后快速生長，開始大量繁殖，發(fā)酵速度明顯加快，菌種數(shù)量增多，說明酵母菌進(jìn)入了生長對數(shù)期；14～22 h產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物使得pH值下降，酵母菌生長環(huán)境惡劣，此時(shí)生長速度下降，酵母細(xì)胞的對數(shù)生長階段結(jié)束進(jìn)入穩(wěn)定生長階段，活菌數(shù)目變化不大，培養(yǎng)22 h后酵母菌的數(shù)量達(dá)到峰值。22 h以后，酵母菌的生長呈緩慢的下降趨勢，是酵母菌生長的衰亡期。

圖1 酵母菌的生長曲線

綜上可知，此高活性酵母的對數(shù)期在5～14 h。在酵母細(xì)胞穩(wěn)定期，酵母細(xì)胞的生長速率和死亡速率達(dá)到基本平衡，此時(shí)酵母細(xì)胞的總體個(gè)數(shù)保持基本不變，所以不適合測定。而在對數(shù)生長期酵母的生長速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于死亡速率，以最快速度進(jìn)行繁殖，此時(shí)的酵母菌細(xì)胞活性旺盛，細(xì)胞個(gè)體形態(tài)及生理指標(biāo)都較為穩(wěn)定，所以本實(shí)驗(yàn)選取酵母為對數(shù)期酵母。

2.2 沒食子酸對酵母細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)

為了評估沒食子酸對酵母菌細(xì)胞的毒性，采用不同濃度的沒食子酸處理酵母菌。在2.1的基礎(chǔ)上，選取對數(shù)生長期的酵母細(xì)胞，沒食子酸終濃度分別為6.25 μg·mL-1、12.50 μg·mL-1、25.00 μg·mL-1、 50.00 μg·mL-1、100.00 μg·mL-1和200.00 μg·mL-1的6組樣品組以及正常組對照組，在28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，對YEPD固體培養(yǎng)基上酵母菌的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，得出沒食子酸對酵母細(xì)胞的毒性結(jié)果，如表1所示。

表1 沒食子酸對酵母細(xì)胞的毒性作用

由表1可知，沒食子酸處理的樣品組除了最高濃度GA-6（200.00 μg·mL-1），其余組的細(xì)胞相對存活率均超過90%，因此可以判斷GA-6對酵母細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，其余組沒有對酵母菌細(xì)胞的存活率造成影響。且已經(jīng)有大量的研究證明沒食子酸對正 常細(xì)胞沒有毒性。因此，選擇濃度為25.00 μg·mL-1、 50.00 μg·mL-1、100.00 μg·mL-1的沒食子酸進(jìn)行對紫外損傷酵母細(xì)胞的保護(hù)作用研究。

2.3 沒食子酸對紫外損傷酵母細(xì)胞的保護(hù)作用

目前使用紫外線輻照酵母菌細(xì)胞是比較常用的評價(jià)化合物細(xì)胞抗氧化活性的模型之一，紫外線易造成細(xì)胞損傷凋亡，對比模型組與正常組，發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞明顯減少；再將模型樣品組與模型組對照，酵母細(xì)胞有所增加。結(jié)果如表2所示。

紫外線處理過的細(xì)胞存活率明顯降低。與紫外線模型組相比，采用50 μg·mL-1的沒食子酸對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理可以明顯提高酵母菌細(xì)胞的存活率，增加了15.89個(gè)百分點(diǎn)，使用濃 度為100 μg·mL-1的沒食子酸對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，存活率增加了9.58個(gè)百分點(diǎn)。然而，使用濃度為25 μg·mL-1的沒食子酸對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后，其存活率與模型組相比增加了4.38個(gè)百分點(diǎn)，沒有顯著改變紫外線損傷過的酵母菌細(xì)胞存活率。這些結(jié)果表明，沒食子酸可以增強(qiáng)紫外線誘導(dǎo)酵母細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。使用 50 μg·mL-1，100 μg·mL-1的沒食子酸溶液對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，可以有效保護(hù)細(xì)胞抵抗紫外線照射的損傷。

表2 沒食子酸對紫外氧化損傷酵母細(xì)胞的保護(hù)作用

3 結(jié)論

本研究通過建立紫外線誘導(dǎo)酵母菌細(xì)胞氧化損傷模型，研究沒食子酸對酵母細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，先通過繪制酵母菌的生長曲線，確定了酵母菌細(xì)胞的4個(gè)生長階段，確定酵母菌細(xì)胞培養(yǎng)5 h進(jìn)入生長對數(shù)期。此外，50 μg·mL-1沒食子酸溶液預(yù)處理對紫外氧化損傷酵母細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用，為沒食子酸作為抗氧化劑的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。