雪梨止咳糖漿中11個(gè)成分的含量測(cè)定及化學(xué)計(jì)量學(xué)分析 Δ

龐茜茜 ，岳威冶 ，劉克勤 ，湯建華 （.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，河北 張家口 07506；.河北北方學(xué)院研究生學(xué)院，河北 張家口 07503）

雪梨止咳糖漿由梨清膏、苦杏仁、桔梗、枇杷葉、前胡、炙紫菀和款冬花組方而成，具有潤(rùn)肺、止咳、化痰的功效，臨床上主要用于支氣管炎、咳嗽、咳痰的治療，尤其對(duì)小兒咳嗽變異性哮喘療效顯著，可有效改善患兒肺功能[1]?，F(xiàn)有的雪梨止咳糖漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)方中白花前胡甲素進(jìn)行了定量分析[2]，相關(guān)文獻(xiàn)也僅限該方中單個(gè)成分的含量檢測(cè)[3—5]，難以保證產(chǎn)品的整體質(zhì)量及療效穩(wěn)定。

近年來(lái)，中藥多指標(biāo)定量控制結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析綜合評(píng)價(jià)模式已廣泛用于中藥材及其制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)中[6]。本研究依據(jù)雪梨止咳糖漿君、臣、佐、使配伍原則，結(jié)合各藥味所含成分特點(diǎn)，選取方中枇杷葉特征成分薔薇酸、委陵菜酸、馬斯里酸和科羅索酸，苦杏仁特征成分苦杏仁苷，桔梗特征成分去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3，前胡特征成分白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡素E為檢測(cè)指標(biāo)，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定了該藥中上述11個(gè)成分的含量，同時(shí)進(jìn)行了化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，旨在為該藥的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有U3000型HPLC儀[賽默飛世爾科技（上海）有限公司]、1200型HPLC儀（美國(guó)Agilent公司）、BP210S型電子天平（德國(guó)Sartorius公司，d＝0.1 mg）、KQ3200DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

雪梨止咳糖漿（批號(hào) 200901、201205、201206、201221、201223、201224、210208、211019、211207、220113、220209、220301，編號(hào)S1～S12，規(guī)格為100 mL/瓶）購(gòu)于葵花藥業(yè)集團(tuán)湖北武當(dāng)有限公司。白花前胡甲素對(duì)照品（批號(hào)111711-201904，純度99.4%）、白花前胡乙素對(duì)照品（批號(hào)111904-202105，純度99.7%）和苦杏仁苷對(duì)照品（批號(hào)110820-202109，純度93.1%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；委陵菜酸對(duì)照品（批號(hào)PRF22021441，純度98.5%）、馬斯里酸對(duì)照品（批號(hào)PRF9082922，純度99.8%）和科羅索酸對(duì)照品（批號(hào)PRF8090101，純度98.2%）均購(gòu)于成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司；去芹糖桔梗皂苷E對(duì)照品（批號(hào)PS010234，純度98.9%）和桔梗皂苷D3對(duì)照品（批號(hào)PS010235，純度98.9%）均購(gòu)于成都普思生物科技股份有限公司；桔梗皂苷E對(duì)照品（批號(hào)18030721，純度98.5%）、薔薇酸對(duì)照品（批號(hào)18052123，純度98.8%）和白花前胡素E對(duì)照品（批號(hào)18031222，純度99.9%）均購(gòu)于上海同田生物技術(shù)股份有限公司。實(shí)驗(yàn)用乙腈和磷酸采用色譜純級(jí)別，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為 Ultimate AQ-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為30 ℃；流動(dòng)相為0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～11 min，8.0%B；11～16 min，8.0%B→12.0%B；16～26 min，12.0%B→26.0%B；26～40 min，26.0%B→30.0%B；40～59 min，30.0%B→75.0%B；59～70 min，75.0%B→8.0%B）；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)分別為210 nm（0～40 min檢測(cè)苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、薔薇酸、委陵菜酸、馬斯里酸和科羅索酸）[7—15]、321 nm（40～70 min檢測(cè)白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡素E）[16—17]；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 取苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、薔薇酸、委陵菜酸、馬斯里酸、科羅索酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E對(duì)照品各適量，用60%甲醇稀釋制成質(zhì)量濃度依次為1.014、0.458、0.232、0.196、1.218、0.530、0.614、0.832、0.696、0.292、0.258 mg/mL的混合對(duì)照品母液，再將該母液用60%甲醇稀釋20倍制得混合對(duì)照品溶液（11種對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度依次為50.7、22.9、11.6、9.8、60.9、26.5、30.7、41.6、34.8、14.6、12.9 μg/mL）。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取雪梨止咳糖漿10 mL，加60%甲醇10 mL，超聲（功率150 W，頻率40 kHz）處理5 min，放冷，以60%甲醇定容至25 mL，搖勻，過(guò)濾，即得。按雪梨止咳糖漿制備工藝[2]分別制備缺苦杏仁、缺桔梗、缺枇杷葉、缺前胡的陰性樣品，再制備相應(yīng)的陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖（圖1）。結(jié)果顯示，供試品溶液中11種成分的色譜峰與相鄰色譜峰的分離度良好，色譜峰峰形尖銳；理論板數(shù)按白花前胡甲素峰計(jì)不低于6 500。

圖1 各溶液的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)HPLC圖

2.4 多指標(biāo)成分的定量檢測(cè)

2.4.1 線性關(guān)系考察和靈敏度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品母液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分別用60%甲醇稀釋至20 mL，搖勻，制得系列混合對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖及峰面積。以各對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，以信噪比10∶1對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限，以信噪比3∶1對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 苦杏仁苷等11種待測(cè)成分的線性關(guān)系考察和靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取同一混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄色譜圖及峰面積。結(jié)果顯示，苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、薔薇酸、委陵菜酸、馬斯里酸、科羅索酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E峰面積的RSD依次為 1.23%、1.31%、1.40%、1.50%、1.52%、1.18%、1.34%、1.47%、1.03%、1.29%、1.37%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份雪梨止咳糖漿（編號(hào)S1）制成的供試品溶液，于制備后0、2、4、7、12、18、24 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖及峰面積。結(jié)果顯示，苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、薔薇酸、委陵菜酸、馬斯里酸、科羅索酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E峰面積的RSD依次為1.33%、1.40%、1.52%、1.57%、1.22%、1.37%、1.48%、1.01%、1.37%、1.28%、1.39%（n＝7），表明供試品溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批雪梨止咳糖漿（編號(hào)S1）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，記錄色譜圖及峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算11個(gè)待測(cè)成分的含量。結(jié)果顯示，苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、薔薇酸、委陵菜酸、馬斯里酸、科羅索酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E含量的RSD依次為1.77%、1.85%、1.92%、1.94%、1.72%、1.80%、1.79%、1.67%、1.73%、1.79%、1.83%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取雪梨止咳糖漿（編號(hào)S1）9份，每份5.0 mL，每3份為1組，分別加入混合對(duì)照品溶液（11個(gè)對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度分別為0.687、0.321、0.159、0.148、0.879、0.374、0.403、0.562、0.489、0.251、0.219 mg/mL）0.8、1.0、1.2 mL，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得加樣供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖及峰面積，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、薔薇酸、委陵菜酸、馬斯里酸、科羅索酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E的平均加樣回收率依次為98.80%、97.65%、97.44%、96.95%、100.01%、97.79%、98.35%、99.70%、98.64%、96.90%、99.34%，RSD依次為0.88%、1.32%、1.28%、1.40%、0.94%、1.55%、0.81%、0.67%、0.99%、1.07%、1.13%（n＝9）。

2.5 樣品含量測(cè)定

取12批雪梨止咳糖漿，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖及峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中苦杏仁苷等11個(gè)待測(cè)成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。表2結(jié)果顯示，11個(gè)待測(cè)成分的含量均有一定的批次間差異，尤其是苦杏仁苷、委陵菜酸、白花前胡素E、薔薇酸、白花前胡甲素等成分的含量差異較為明顯。

2.6 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.6.1 聚類(lèi)分析 聚類(lèi)分析（cluster analysis，CA）是通過(guò)分析事物的內(nèi)在特點(diǎn)和規(guī)律，并根據(jù)相似性原則對(duì)事物進(jìn)行分組的方法。將表2中含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 26.0軟件，以歐氏距離為測(cè)度，采用組間連接法進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2結(jié)果顯示，12批雪梨止咳糖漿樣品呈明顯的分類(lèi)趨勢(shì)，當(dāng)歐氏距離為15時(shí)，12批樣品可聚為3類(lèi)：樣品S10～S12聚為一類(lèi)，樣品S7～S9聚為一類(lèi)，樣品S1～S6聚為一類(lèi)。

圖2 12批雪梨止咳糖漿樣品的聚類(lèi)樹(shù)狀圖

表2 雪梨止咳糖漿中苦杏仁苷等11個(gè)待測(cè)成分的含量測(cè)定結(jié)果（n=3，mg/mL）

2.6.2 主成分分析 將表2中含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 26.0軟件，以特征值與累計(jì)方差貢獻(xiàn)率作為判定依據(jù)，計(jì)算主成分的特征值與方差貢獻(xiàn)率，從而對(duì)主成分進(jìn)行提取。以特征值＞1為提取標(biāo)準(zhǔn)，可得前2個(gè)主成分的特征值分別為7.452和2.286，方差貢獻(xiàn)率分別為67.743%和20.786%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為88.53%，大于85%，可以反映雪梨止咳糖漿的綜合質(zhì)量，故選取前2個(gè)主成分進(jìn)行評(píng)價(jià)。同時(shí)，應(yīng)用SIMCA 14.1軟件對(duì)表2中11個(gè)化學(xué)成分的含量數(shù)據(jù)建立主成分分析（principal component analysis，PCA）模型（圖3），提取出2個(gè)主成分的R2X為0.885，大于0.5，表明所建立的模型穩(wěn)定性較高。從圖3可知，S1～S6、S7～S9、S10～S12分別各自呈現(xiàn)一定的關(guān)聯(lián)性，這與CA結(jié)果相符。

圖3 12批雪梨止咳糖漿樣品的PCA模型得分圖

2.6.3 偏最小二乘法-判別分析 以表2中含量數(shù)據(jù)為變量，運(yùn)用SIMCA 14.1軟件對(duì)12批雪梨止咳糖漿樣品進(jìn)行偏最小二乘法-判別分析（partial least squaresdiscrimination analysis，PLS-DA），得PLS-DA模型（圖4）。結(jié)果顯示，模型擬合度R2Y為0.929，預(yù)測(cè)能力Q2為0.866，二者均大于0.5，表明模型擬合較好、穩(wěn)定可靠、預(yù)測(cè)能力強(qiáng)。對(duì)建立的PLS-DA 模型進(jìn)行200次置換檢驗(yàn)，結(jié)果顯示R2擬合直線在Y軸上的截距為0.097，小于0.3，表明所建立的PLS-DA模型結(jié)果可靠；Q2擬合直線在Y軸上的截距為-0.284，表明所構(gòu)建的PLS-DA模型不存在過(guò)度擬合，可有效判別分析12批雪梨止咳糖漿樣品的質(zhì)量差異。變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）分析結(jié)果顯示，11個(gè)待測(cè)成分對(duì)雪梨止咳糖漿質(zhì)量的影響程度由大到小依次為：薔薇酸＞苦杏仁苷＞白花前胡甲素＞委陵菜酸＞科羅索酸＞去芹糖桔梗皂苷E＞馬斯里酸＞白花前胡乙素＞白花前胡素E＞桔梗皂苷E＞桔梗皂苷D3，其中薔薇酸（VIP＝1.986）、苦杏仁苷（VIP＝1.334）和白花前胡甲素（VIP＝1.115）是影響雪梨止咳糖漿質(zhì)量的差異標(biāo)志物（VIP＞1）。

圖4 12批雪梨止咳糖漿樣品的PLS-DA模型得分圖

3 討論

3.1 含量測(cè)定成分的選擇

雪梨止咳糖漿由梨清膏、枇杷葉、炙紫菀、款冬花、苦杏仁、桔梗和前胡加工而成，方中梨清膏生津潤(rùn)燥、清熱化痰，為君藥；枇杷葉清肺化痰、降氣止咳，炙紫菀和款冬花潤(rùn)肺化痰止咳，共為臣藥；苦杏仁降氣止咳，桔梗宣肺祛痰止咳，前胡宣肺止咳，共為佐藥。諸藥合用，共奏潤(rùn)肺止咳化痰之功[18]。梨清膏由薔薇科植物白梨和秋子梨等栽培品種果實(shí)加工而成，筆者在預(yù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中曾嘗試對(duì)梨清膏所含成分進(jìn)行定量研究，但因梨的品種來(lái)源存在差異，且所含成分含量較低，難以對(duì)其準(zhǔn)確定量；同時(shí)，考慮到款冬花、紫菀主要含槲皮素、山柰酚等黃酮類(lèi)成分，方中多味藥物均含有該類(lèi)成分，成分專(zhuān)屬性不強(qiáng)，綜合考慮最終選取臣藥枇杷葉的特征成分薔薇酸、委陵菜酸、馬斯里酸和科羅索酸，佐藥苦杏仁特征成分苦杏仁苷，桔梗特征成分去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3，前胡特征成分白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡素E為含量測(cè)定的目標(biāo)成分。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)及各對(duì)照品的紫外全波長(zhǎng)（190～400 nm）掃描圖譜，比較了207 nm[7]、210 nm[8—15]、321 nm[16—17]波長(zhǎng)下供試品溶液的色譜曲線，發(fā)現(xiàn)采用210 nm檢測(cè)苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、薔薇酸、委陵菜酸、馬斯里酸、科羅索酸，采用321 nm檢測(cè)白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡素E時(shí)，色譜峰基線較平穩(wěn)，11個(gè)待測(cè)成分與相鄰色譜峰均能完全分離，且響應(yīng)值最大，故選其作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 樣品含量測(cè)定與化學(xué)計(jì)量學(xué)分析結(jié)果評(píng)價(jià)

從12批雪梨止咳糖漿樣品中11個(gè)待測(cè)成分的含量測(cè)定結(jié)果來(lái)看，各成分含量均存在一定的批間差異，這可能與制劑生產(chǎn)原藥材種屬、產(chǎn)地等差異有關(guān)；CA、PCA結(jié)果顯示，12批樣品可分為3類(lèi)，即S1～S6、S7～S9、S10～S12各為一類(lèi)，也證實(shí)了這一點(diǎn)，提示藥企應(yīng)穩(wěn)定原藥材來(lái)源，提升原藥材內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，使制劑質(zhì)量更加穩(wěn)定。PLS-DA結(jié)果顯示，薔薇酸、苦杏仁苷和白花前胡甲素對(duì)制劑質(zhì)量貢獻(xiàn)度較大，是影響雪梨止咳糖漿質(zhì)量的差異標(biāo)志物，提示藥企應(yīng)關(guān)注制劑中上述成分尤其是薔薇酸、苦杏仁苷和白花前胡甲素的含量，建立其質(zhì)量控制體系，以提高制劑質(zhì)量的穩(wěn)定性與一致性，從而確保臨床療效。

綜上所述，本研究采用HPLC法對(duì)雪梨止咳糖漿中苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、薔薇酸、委陵菜酸、馬斯里酸、科羅索酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡素E的含量同時(shí)進(jìn)行了檢測(cè)，建立了雪梨止咳糖漿多指標(biāo)成分定量控制方法，同時(shí)聯(lián)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)含量檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)，挖掘出了影響雪梨止咳糖漿質(zhì)量的差異標(biāo)志物，可為該制劑的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。