不同萃取相黃果茄果實(shí)乙醇提取物的生物活性比較分析

李學(xué)玲，樊竹青，羅銀玲，孫體杰，王菲兒，許苑南

(普洱學(xué)院生物與化學(xué)學(xué)院 云南省高校亞熱帶藥用食用生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 普洱 665000)

黃果茄(SolanumxanthocarpumSchrad. et Wendl)，又名黃水茄、大苦果、野茄果等，是一種茄科、茄屬多年生直立草本或匍匐草本植物，果實(shí)為球形漿果，種子近腎形、扁平，冬至夏季為花期，夏、秋季為果熟期[1]。黃果茄主要分布于熱帶、亞熱帶等地區(qū)，喜生長(zhǎng)在路旁、荒涼地帶及干旱沙灘，在中國臺(tái)灣、湖北、四川、貴州、云南等地均可見其分布[2]。黃果茄味苦、辛，性溫，具有清熱利濕、消瘀止痛的作用和功效，也稱為牙痛果，是一種常用的民族藥，可用于治療風(fēng)濕痹痛、睪丸炎、癰癤和牙痛等癥[3]，主要含有生物堿、黃酮、醛類、脂類等成分[4-7]。目前，關(guān)于黃果茄的研究主要集中在滅螺活性和對(duì)貝類、魚類、大鼠等的毒性方面[8-13]，黃果茄在鎮(zhèn)痛、抗炎方面的生物活性研究和獸藥的開發(fā)利用罕見報(bào)道，其在臨床上的應(yīng)用也僅限于一些少數(shù)民族傳統(tǒng)處方。結(jié)合黃果茄來源天然、療效好、資源豐富等特點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行深入研究和開發(fā)利用具有重要意義。而且隨著人們生活水平的提高，對(duì)肉蛋奶的需求量增加，畜禽疾病的預(yù)防和控制在養(yǎng)殖過程中是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。由于市場(chǎng)上獸藥品質(zhì)參差不齊，養(yǎng)殖農(nóng)戶不能科學(xué)合理使用獸藥，造成了畜禽疾病難治愈，蛋奶肉有獸藥殘留等問題。另外，獸藥存在研發(fā)過程粗放、制藥成本高、制備工藝落伍等問題，獸藥的開發(fā)使用面臨新的挑戰(zhàn)和發(fā)展機(jī)遇[14-15]。因此，本試驗(yàn)以黃果茄果實(shí)為原料，對(duì)其乙醇提取物不同萃取部位的抗氧化、抗炎和鎮(zhèn)痛活性進(jìn)行初步探討，以期為后續(xù)黃果茄的藥理機(jī)制研究和產(chǎn)品開發(fā)提供一定理論依據(jù)，為新型綠色無殘留獸藥的開發(fā)提供新的設(shè)想。

1 材料與方法

1.1 原料 黃果茄鮮果，采自云南省景東縣，經(jīng)鑒定為茄科、茄屬黃果茄的果實(shí)，切片，自然曬干，粉碎，過100目篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器 Precision MLG3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；JW-100S超聲波清洗儀，東莞市潔美清洗機(jī)有限公司產(chǎn)品；FA3204B電子分析天平，奧豪斯儀器有限公司產(chǎn)品；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限公司產(chǎn)品；TGL-8高速離心機(jī)，江蘇同君儀器科技有限公司產(chǎn)品；Multiskan FC357-913168酶標(biāo)儀，賽默飛產(chǎn)品；UV2660紫外可見分光光度計(jì)，日本島津有限公司產(chǎn)品；RB-200智能熱板儀，成都泰盟軟件有限公司產(chǎn)品；0114手握式打孔器，得力集團(tuán)有限公司產(chǎn)品。

1.3 主要試劑 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，批號(hào)：B14L696)，合肥博美生物科技有限公司產(chǎn)品；阿司匹林腸溶片(批號(hào)：J20171 021)，拜耳醫(yī)藥保健有限公司產(chǎn)品；鹽酸利多卡因注射液(批號(hào)：H37022147)，山東華魯制藥有限公司產(chǎn)品；吐溫-80(AR)，天津市大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒(批號(hào)：20190308)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號(hào)：20190525)、環(huán)氧合酶2(COX-2)試劑盒(批號(hào)：20190902)，南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；腫瘤壞死因子(TNF-α) ELISA試劑盒(批號(hào)：20190817 J)、白細(xì)胞介素6(IL-6) ELISA試劑盒(批號(hào)：20190306 J)，江蘇酶聯(lián)生物有限公司產(chǎn)品。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 80只SPF級(jí)昆明小鼠，雌雄各半，體重(20±2)g，購自昆明醫(yī)科大學(xué)呈貢校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部實(shí)驗(yàn)室，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滇)K2015—0002。

1.5 試驗(yàn)方法 稱取10 g黃果茄鮮果，按料液比1∶20加入80%乙醇浸泡超聲萃取1 h，減壓過濾濃縮，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水按體積比1∶1萃取，減壓濃縮各萃取相并干燥至恒重，分別得黃果茄石油醚萃取相(Petroleum ether fraction ofSolanumxanthocarpum，PFSX)、黃果茄二氯甲烷萃取相(Dichloromethane fraction ofSolanumxanthocarpum，DFSX)、黃果茄乙酸乙酯萃取相(Ethyl acetate fraction ofSolanumxanthocarpum，EFSX)、黃果茄正丁醇萃取相(N-butanol fraction ofSolanumxanthocarpum，NFSX)和黃果茄水萃取相(Water fraction ofSolanumxanthocarpum，WFSX)浸膏。

1.5.1 抗氧化活性檢測(cè) 通過測(cè)定各萃取相黃果茄果實(shí)乙醇提取物的DPPH·清除率和對(duì)小鼠血清T-AOC、SOD的活性的影響探究其體外和體內(nèi)抗氧化活性。

1.5.1.1 體外抗氧化活性檢測(cè) 參照參考文獻(xiàn)[16-18]的方法，將PFSX、DFSX、EFSX、NFSX、WFSX浸膏用無水乙醇配制成0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 mg/mL和1.00 mg/mL的樣品溶液；分別取樣品溶液和0.20 mmol/L DPPH溶液各2.00 mL，搖勻，避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)定吸光度(A1)；按同樣的方法測(cè)定樣品溶液與無水乙醇反應(yīng)的吸光度(A2)、無水乙醇與DPPH溶液反應(yīng)的吸光度(A0)。以維生素C(Vitamin C，VC)為陽性對(duì)照，平行測(cè)定3次，按公式(1)計(jì)算樣品對(duì)DPPH·的清除率：

(1)

1.5.1.2 體內(nèi)抗氧化活性檢測(cè) 參照參考文獻(xiàn)[19]的方法，將70只雄性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為7個(gè)組：空白組、模型組、試驗(yàn)組(PFSX組、DFSX組、EFSX組、NFSX組、WFSX組)。模型組和試驗(yàn)組小鼠以200 mg/(kg·bw·d) 劑量頸背部皮下注射D-半乳糖構(gòu)建糖基化模型，空白組注射等體積生理鹽水，連續(xù)注射28 d。造模同時(shí)，試驗(yàn)組按400 mg/(kg·bw·d) 劑量灌胃給藥，空白組和模型組灌胃等體積水，連續(xù)給藥28 d。每7天稱體重1次，觀察記錄各組小鼠活動(dòng)狀況和體重變化。末次灌胃后，小鼠禁食不禁水12 h，稱重后摘眼球取血，3 000 r/min離心10 min，分離血清。按照試劑盒說明書操作測(cè)定小鼠血清的T-AOC和SOD活性。

1.5.2 小鼠熱板法鎮(zhèn)痛試驗(yàn) 參照參考文獻(xiàn)[20]的方法，以熱板儀(55.0±0.5)℃測(cè)定雌性小鼠痛閾值，挑選出痛閾值在5～30 s的合格雌性小鼠70只，按體重隨機(jī)分為7個(gè)組：空白組、利多卡因組、試驗(yàn)組(PFSX組、DFSX組、EFSX組、NFSX組、WFSX組)?？瞻捉M按1%吐溫-80/d劑量灌胃給藥，利多卡因組按5 mg/(kg·bw·d)劑量腹腔注射給藥，試驗(yàn)組(PFSX組、DFSX組、EFSX組、NFSX組、WFSX組)按400 mg/(kg·bw·d)劑量灌胃給藥，連續(xù)給藥7 d，末次給藥前一夜禁食不禁水，給藥后30 min和60 min測(cè)定各組小鼠的痛閾值，在60 s時(shí)仍無明顯痛覺反應(yīng)的小鼠應(yīng)立即取出，按60 s計(jì)，以免燙傷。按公式(2)計(jì)算痛閾提高率。

痛閾提高率(%)=

(2)

1.5.3 抗炎活性檢測(cè) 參照參考文獻(xiàn)[21]的方法，將80只健康雄性小鼠隨機(jī)分為8個(gè)組：空白組、模型組、阿司匹林組、試驗(yàn)組(PFSX組、DFSX組、EFSX組、NFSX組、WFSX組)。阿司匹林組以400 mg/(kg·bw·d)劑量給藥，試驗(yàn)組(PFSX組、DFSX組、EFSX組、NFSX組、WFSX組)按400 mg/(kg·bw·d)劑量給藥，空白組給等體積純水,模型組給等體積1%吐溫-80，各組小鼠連續(xù)灌胃給藥7 d，除空白組外，其余各組小鼠在每日給藥30 min后將40 μL二甲苯均勻涂抹在小鼠右耳建立小鼠耳廓腫脹模型，左耳作為對(duì)照，末次致炎30 min后，摘眼球取血，脫頸處死小鼠，沿耳廓線剪下雙耳，用8 mm打孔器在小鼠雙耳同一部位取下耳片并稱重，按公式(3)、公式(4)分別計(jì)算腫脹度和腫脹抑制率。

腫脹度(mg)=致炎耳片質(zhì)量-非致炎耳片質(zhì)量

(3)

腫脹抑制率(%)=

(4)

將上述所得血液3 000 r/min離心10 min，取上清液并按ELISA試劑盒說明書檢測(cè)小鼠血清中的COX-2、TNF-α 和 IL-6水平。

2 結(jié)果

2.1 抗氧化活性檢測(cè)

2.1.1 體外抗氧化活性 由圖1所示，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，不同萃取相黃果茄果實(shí)乙醇提取物對(duì)DPPH·的清除率均隨濃度的增大而增大，呈一定的量效關(guān)系，說明黃果茄各萃取相均具抗氧化作用。當(dāng)樣品濃度小于0.60 mg/mL時(shí)，隨著濃度的增加，各相清除率也隨之增強(qiáng)；當(dāng)樣品濃度大于0.60 mg/mL時(shí)，各相清除率增加速度逐漸減緩。當(dāng)樣品濃度為1.00 mg/mL時(shí)，EFSX、DFSX和NFSX的清除率相近，但均小于維生素C的清除率。結(jié)果表明，黃果茄各萃取相對(duì)DPPH·的清除能力由大到小依次為EFSX>NFSX>DFSX>WFSX>PFSX，各相在選取濃度范圍內(nèi)最大清除率分別為93.04%、90.49%、90.19%、31.84%、12.39%，EFSX對(duì)DPPH·的清除率在0.40 mg/mL之后接近維生素C。

圖1 各相對(duì)DPPH·的清除能力Fig.1 DPPH· scavenging effects of different phases

2.1.2 體內(nèi)抗氧化活性檢測(cè)

2.1.2.1 不同萃取相黃果茄果實(shí)乙醇提取物對(duì)小鼠體重變化的影響

如表1所示，各組體重第1周無明顯差異。第2周末，與空白組比，模型組小鼠體重明顯減輕(P<0.01)，表現(xiàn)為食量減小、進(jìn)食不積極、毛色暗淡無光澤、眼球暗紅無神、體力差、容易抓取，表明模型組造模成功；與模型組相比，各萃取相組小鼠體重顯著增加(P<0.05)。第3～4周，與模型組相比，PFSX組、DFSX組、EFSX組、NFSX組和WFSX組小鼠體重呈現(xiàn)不同程度增加(P<0.05或P<0.01)，表明5種萃取相黃果茄果實(shí)乙醇提取物有明顯增加D-半乳糖致糖基化模型小鼠體重的作用。

表1 不同組別小鼠的體重變化Table 1 Body weight changes of mice from different groups (g,n=10)

2.1.2.2 不同萃取相黃果茄果實(shí)乙醇提取物對(duì)小鼠血清T-AOC和SOD的影響 如表2所示，與空白組相比，模型組小鼠血清T-AOC、SOD活力顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，EFSX組和NFSX組小鼠血清T-AOC活力極顯著升高(P<0.01)，PFSX組、DFSX組和WFSX組小鼠血清T-AOC活力顯著升高(P<0.05)；所有試驗(yàn)組均能顯著提升小鼠血清的SOD活性(P<0.05)。試驗(yàn)組均可以顯著提升T-AOC和SOD活性(P<0.05或P<0.01)。

2.2 小鼠熱板法鎮(zhèn)痛試驗(yàn) 如表3所示，各組小鼠給藥前痛閾值無顯著差異(P>0.05)。給藥后，與空白組比較，利多卡因組小鼠痛閾值極顯著提高(P<0.01)，30 min痛閾提高率為200%；與空白組相比，給藥30 min后，DFSX組、NFSX組和WFSX組小鼠的痛閾值均顯著提高(P<0.05或P<0.01)；給藥60 min后，PFSX組、DFSX組、NFSX組和WFSX組小鼠的痛閾值均顯著提高(P<0.05或P<0.01)。

表2 不同組別小鼠血清T-AOC和SODTable 2 T-AOC and SOD in serum of mice from different groups (U/mL,n=10)

表3 小鼠熱板致痛反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of hot plate-induced pain test in mice (n=10)

2.3 抗炎活性檢測(cè) 涂布二甲苯后的各組小鼠與空白組小鼠對(duì)比，右耳很快出現(xiàn)不同程度的紅腫，部分血管清晰可見。如表4所示，模型組二甲苯涂布側(cè)小鼠耳朵與空白組比較有明顯的腫脹(P<0.01)；阿司匹林組、PFSX組、DFSX組、EFSX組、WFSX組與模型組相比，小鼠耳腫脹得到明顯緩解(P<0.05或P<0.01)。

表4 小鼠耳廓腫脹試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of auricle swelling test in mice (n=10)

如表5所示，模型組血清中COX-2、TNF-α 和 IL-6含量均極顯著高于空白組(P<0.01)；阿司匹林組、DFSX組、EFSX組與模型組相比，小鼠血清中COX-2、TNF-α和IL-6含量極顯著降低(P<0.01)。

3 討論

黃果茄作為一味傳統(tǒng)民族藥物，在少數(shù)民族地區(qū)常用于治療頭痛、牙痛等疾病。傳統(tǒng)民族醫(yī)藥獨(dú)具地方特色，其藥物用法用量與現(xiàn)代藥物有所區(qū)別。越來越多的傳統(tǒng)中藥及中藥制劑用于動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療，具有療效好、副作用少、殘留少等特點(diǎn)[22]。因此，傳統(tǒng)民族藥可以開發(fā)作為獸用藥物。獸藥在動(dòng)物養(yǎng)殖和救治中占據(jù)著不可或缺的地位，合格優(yōu)質(zhì)的獸藥能夠預(yù)防控制動(dòng)物疾病，是保證肉蛋奶及相關(guān)制品食品安全的前提。

本試驗(yàn)檢測(cè)了不同萃取相黃果茄果實(shí)乙醇提取物的抗氧化、鎮(zhèn)痛與抗炎活性，體外DPPH·清除試驗(yàn)結(jié)果表明EFSX萃取相在0.40 mg/mL以上濃度的抗氧化性與維生素C的抗氧化性趨近。D-半乳糖在醛糖還原酶的作用下生成半乳糖醇，半乳糖醇在體內(nèi)積累會(huì)引起自由基損傷，造成機(jī)體的衰老或疾病發(fā)生[23]。體內(nèi)抗氧化試驗(yàn)在小鼠頸背部皮下注射D-半乳糖使其處于高糖基化狀態(tài)，模擬自然衰老的行為學(xué)和糖基化產(chǎn)物水平的變化，建立小鼠衰老模型。結(jié)果顯示各相黃果茄果實(shí)乙醇提取物，尤其是EFSX和NFSX能顯著提升由D-半乳糖致衰老模型小鼠的T-AOC和SOD活性，體現(xiàn)出一定的體內(nèi)抗氧化活性。

表5 小鼠血清中炎癥因子含量的測(cè)定結(jié)果Table 5 Results of inflammatory factors content test in serum of mice (pg/mL,n=10)

疼痛是因組織損傷或者潛在的組織損傷產(chǎn)生的痛覺，是許多疾病伴隨的癥狀，疼痛還會(huì)導(dǎo)致患者情緒緊張、機(jī)體生理功能紊亂等現(xiàn)象[24]。常用的止痛藥包括阿片受體止痛藥和非甾體抗炎藥[25]，其中阿片受體鎮(zhèn)痛藥物存在一定的成癮性和不良反應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同萃取相黃果茄果實(shí)乙醇提取物PFSX、DFSX、NFSX和WFSX能夠不同程度延長(zhǎng)小鼠舔足時(shí)間，PFSX在60 min時(shí)才發(fā)揮對(duì)疼痛的抑制作用，而DFSX、NFSX和WFSX隨時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)疼痛的抑制作用逐漸減小，說明不同萃取相黃果茄果實(shí)乙醇提取物對(duì)疼痛的抑制具有時(shí)效性。后期可通過黃果茄果實(shí)提取物的鎮(zhèn)痛藥理作用探究其鎮(zhèn)痛機(jī)制，為尋找新的、不良反應(yīng)小、無成癮性的鎮(zhèn)痛獸藥提供新思路。

目前，在治療動(dòng)物疾病過程中使用的大量非甾體抗炎藥、抗菌藥和激素類藥物容易造成肉蛋奶的獸藥殘留及細(xì)菌耐藥性增加[26]。非甾體抗炎藥中乙酰水楊酸通過抑制COX-2從而減少前列腺素的釋放，發(fā)揮解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎作用，其不良反應(yīng)發(fā)生率較高，易導(dǎo)致胃腸道刺激、組織損害、神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)、血細(xì)胞減少、血液凝血系統(tǒng)障礙和肝腎損傷[27-28]。炎癥狀態(tài)下，細(xì)胞因子和其他炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)激活炎癥部位的COX-2，由此產(chǎn)生PGG2/PGH2，加重炎癥反應(yīng)[29]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，黃果茄果實(shí)乙醇提取物能夠降低小鼠炎癥部位COX-2、TNF-α 和 IL-6水平，抑制炎性癥狀，其中DFSX和EFSX兩個(gè)萃取相的抗炎作用明顯。

綜上，EFSX萃取相具有開發(fā)為新型食品抗氧化劑或抗衰老疾病藥物的潛力。