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    河北邢臺及周邊地區(qū)PRRSV流行情況調(diào)查及ORF5基因變異分析

    2023-01-14 03:21:32高明艷葛生虎文生萍
    中國獸醫(yī)雜志 2022年11期
    關鍵詞:周邊地區(qū)邢臺致病性

    高明艷,葛生虎,文生萍

    (1. 青海農(nóng)牧科技職業(yè)學院,青海 西寧 812100 ; 2. 河北銘諸生物科技有限公司,河北 邢臺 054000)

    豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染可導致豬群出現(xiàn)豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),又稱豬藍耳病,該病的主要臨床癥狀包括母豬繁殖障礙(死胎、流產(chǎn)和弱仔等)、不同發(fā)育階段豬群呼吸困難和高熱等,給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[1-2]。PRRSV基因組大小約為15 kb,可編碼多個結構蛋白和非結構蛋白,根據(jù)其基因組序列差異可將PRRSV分為2個基因型,分別為歐洲型(基因1型)和美洲型(基因2型)[3]。

    2013年開始,國內(nèi)部分地區(qū)開始流行類NADC30毒株,該毒株的Nsp2氨基酸序列中存在大片段的氨基酸缺失,且毒力與之前流行的歐洲型或美洲型存在較大差異[4]。當前類NADC30毒株在我國不同省份廣泛流行,甚至在部分地區(qū)的流行比例呈逐年上升趨勢[5]。本試驗于2021年3—10月從河北邢臺及周邊地區(qū)采集疑似感染PRRSV病料組織樣品進行病原檢測,旨在了解該地區(qū)PRRSV流行情況及基因型所占比例情況,以期為該地區(qū)PRRS的防控提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑 病毒RNA提取試劑盒,購自南京諾唯贊生物科技有限公司;PRRSV美經(jīng)典株/高致病性/類DADC30毒株核酸檢測試劑盒[實時熒光定量PCR(qPCR)-TaqMan熒光探針法],購自湖南冠牧生物科技有限公司;cDNA反轉錄試劑盒、DL2 000 DNA Marker、2×PCR預混液和瓊脂粉末等,均購自寶生物工程(大連)有限公司。

    1.2 主要儀器 FQA-48熒光定量PCR儀,購自杭州博日科技股份有限公司;PCR擴增儀,購自力康生物醫(yī)療科技控股有限公司;超凈工作臺,購自山東博科再生醫(yī)學有限公司;瓊脂糖凝膠電泳儀等,均購自蘇州阿爾法生物試驗器材有限公司。

    1.3 樣品來源 2021年3—10月從河北邢臺及周邊地區(qū)收集疑似感染PRRSV病豬組織樣品共217份。其中部分病豬臨床癥狀包括繁殖母豬流產(chǎn)或死胎,仔豬或保育豬高熱、呼吸困難等;剩余組織樣品來源病豬未表現(xiàn)以上癥狀。在確定不是非洲豬瘟感染前提下對病豬進行解剖,無菌采集淋巴結、扁桃體、肺臟等組織樣品,標記樣品來源和日期等信息,低溫送至河北銘諸生物科技有限公司,保存于-20 ℃,待檢。

    1.4 臨床病料處理及PRRSV核酸檢測 采用滅菌眼科剪和手術刀剪取約0.5 g組織樣品,加入少量滅菌PBS溶液后研磨勻漿,反復凍融后高速離心(12 000 r/min,5 min),取200 μL上清用于RNA基因組提取,基因組提取步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。采用PRRSV美洲經(jīng)典株/高致病性/類DADC30毒株核酸檢測試劑盒對樣品進行檢測,若樣品Ct值<35判定為對應毒株核酸陽性,樣品對應Ct值>35判定為陰性。

    1.5 類NADC30毒株ORF5基因序列擴增與測序 根據(jù)參考文獻[6]合成擴增PRRSV毒株ORF5基因序列的特異性引物:PRRSV-ORF5-F:5′-GTTTTAGCCTGTCTTTTTGCC-3′,PRRSV-ORF5-R:5′-TA-TATCATCACTGGCGTGTAGG-3′,引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。以類NADC30 PRRSV毒株陽性樣品核酸為模板,應用逆轉錄PCR(RT-PCR)法對毒株ORF5基因序列進行擴增,擴增體系(50.0 μL):2×PCR預混液25.0 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL,模板3.0 μL,無RNA酶水20.0 μL;反應條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35個循環(huán),最終72 ℃ 5 min。反應結束后取5.0 μL擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,并在凝膠成像儀中觀察結果。將類NADC30 PRRSV毒株陽性產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。

    1.6 類NADC30毒株ORF5基因序列分析 從NCBI網(wǎng)站上下載國內(nèi)外具有代表性的PRRSV毒株ORF5基因序列,應用DNASTAR軟件(MegAlign)對獲得的ORF5基因核苷酸序列進行同源性分析;使用MEGA 7.0軟件中Neighbor-Joining(NJ)法構建系統(tǒng)遺傳進化樹,其Bootstrap值設置為1 000。

    2 結果

    2.1 河北邢臺及周邊地區(qū)送檢樣品PRRSV核酸檢測 采用qPCR法對河北邢臺及周邊地區(qū)采集的疑似PRRSV感染組織樣品進行檢測,結果如表1所示,77個送檢豬場中有43個豬場存在PRRSV陽性病料,場陽性率為55.84%;217份組織樣品中有105份樣品檢測為PRRSV核酸陽性,平均檢出率為48.39%。進一步分析發(fā)現(xiàn),PRRSV廣泛流行于不同送檢地區(qū),各地區(qū)PRRSV場陽性率和樣品陽性率分別介于40.91%~76.47%和29.85%~75.00%,其中石家莊市流行情況相對最嚴重。

    2.2 河北邢臺及周邊地區(qū)不同基因型PRRSV毒株流行特點 進一步分析PRRSV陽性毒株基因型發(fā)現(xiàn),河北邢臺及周邊地區(qū)同時存在3種不同基因型的PRRSV流行,但其檢出率存在較大差異。結果如表2所示,類NADC30毒株檢出率最高,為29.49%(64/217),高致病性PRRSV毒株和經(jīng)典型PRRSV毒株檢出率分別為15.21%(33/217)和4.61%(10/217),3種毒株陽性樣品占PRRSV陽性樣品的比例分別為60.95%、31.43%和9.52%。此外,2份樣品存在“類NADC30毒株+高致病性毒株”混合感染,但未發(fā)現(xiàn)其他毒株混合感染現(xiàn)象。

    表1 邢臺及周邊地區(qū)送檢樣品PRRSV核酸檢測Table 1 PRRSV nucleic acid detection of samples from Xingtai and its surrounding areas

    表2 邢臺及周邊地區(qū)不同基因型PRRSV毒株流行情況Table 2 Prevalence of PRRSV strains with different genotypes in Xingtai and its surrounding areas

    2.3 類NADC30毒株ORF5基因序列擴增與測序 凝膠電泳結果顯示,8個PRRSV毒株ORF5基因序列均成功擴增,其RT-PCR產(chǎn)物大小約600 bp,與預期大小基本相符,且無非特異性條帶(圖1)。測序結果顯示,8個毒株ORF5基因序列大小均為606 bp,可編碼202個氨基酸。根據(jù)樣品采集時間和地點將8個毒株分別命名為HBXT1-2021、HBXT2-2021、HBHS1-2021、HBHS2-2021、HBSJZ1-2021、HBSJZ2-2021、HBHD1-2021和HBHD2-2021。

    圖1 PRRSV毒株ORF 5基因序列RT-PCR擴增Fig.1 RT-PCR amplification of PRRSV ORF 5 geneM:DL2 000 DNA Marker; N:陰性對照; P:陽性對照; 1~8:8份樣品M:DL2 000 DNA Marker; N:Negative control; P:Positive control; 1-8:8 samples

    2.4 類NADC30毒株ORF5基因序列分析 核苷酸序列分析結果顯示,8個PRRSV毒株ORF5基因核苷酸序列同源性為98.5%~99.8%;與類NADC30 PRRSV代表性毒株(如NADC30、HeN1和HeN2014)OFRF5基因序列同源性最高,為93.9%~99.5%,與疫苗株VR2332ORF5基因序列同源性為85.1%~85.4%;與高致病性PRRSV代表性毒株(如JXA1和HuN4)ORF5基因序列同源性為83.9%~84.4%;與譜系3.5代表性毒株(如QYYZ和FJFS)ORF5基因序列同源性則為82.8%~83.1%(圖2)。

    當前全球流行的PRRSV毒株可分為2個基因型,分別為歐洲型(PRRSV-1)和美洲型(PRRSV-2),而美洲型毒株可分為多個亞型[7-8]。應用MEGA 7.0軟件構建遺傳進化樹顯示,本試驗獲得的8個毒株與GenBank收錄的類NADC30代表性毒株聚為同一分支,且與我國流行的河南株(HeN1)相距最近(圖3)。結果表明,本試驗獲得的毒株均屬于類NADC30毒株,且其與國內(nèi)流行毒株(HeN1)親緣關系最近。

    圖2 PRRSV毒株ORF 5基因核苷酸序列同源性分析Fig.2 Homology analysis of PRRSV ORF 5 nucleotide sequences▲:本試驗獲得PRRSV毒株;下圖同 ▲:PRRSV strains obtained in this study. The same as the following figures

    圖3 PRRSV毒株ORF 5基因序列遺傳進化樹Fig.3 Phylogenetic tree construction based on the PRRSV ORF 5 sequences

    3 討論

    當前,PRRS已成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要疫病。PRRSV屬于RNA病毒,而RNA病毒基因組在復制過程中易出現(xiàn)堿基突變、缺失和缺失,這導致當前我國PRRSV流行毒株基因型復雜,對其進行有效防控十分困難[8]。2006年,我國江西省部分地區(qū)豬場暴發(fā)高致病性PRRSV感染引發(fā)的PRRS,豬群感染該病后出現(xiàn)高熱和高病死率,該病的廣泛流行給我國部分豬場造成毀滅性打擊[9]。其后,2013年我國部分地區(qū)開始流行類NADC30毒株[10]。3種不同基因型PRRSV毒株(經(jīng)典型毒株、高致病性毒株、類NADC30毒株)對宿主的致病性存在差異,使得我國PRRS防控相對困難,這也提示監(jiān)測PRRSV流行情況及不同基因型所占比例情況十分必要。

    綜上,本試驗通過對河北邢臺及周邊地區(qū)PRRSV流行情況進行調(diào)查和分析,發(fā)現(xiàn)樣品中PRRSV檢出率較高(48.39%,105/217),說明該病原仍然廣泛流行于河北部分地區(qū)豬場??赡苁怯捎谀壳癙RRS已退出國家強制性免疫豬病名單,使得部分豬場疏于對該病的防控[11]。進一步分析發(fā)現(xiàn),被調(diào)查地區(qū)同時存在3種基因型PRRSV毒株的流行,但不同基因型毒株所占比例差異較大,其中類NADC30毒株、HP-PRRSV毒株和經(jīng)典型PRRSV毒株所占比例分別為60.95%、31.43%和9.52%。說明類NADC30毒株和HP-PRRSV毒株在被調(diào)查地區(qū)已屬于優(yōu)勢基因型,這與周群等[5]調(diào)查結果基本一致,提示當前國內(nèi)部分地區(qū)PRRSV流行毒株基因型較為復雜,這也說明對PRRSV流行株進行基因型鑒定十分重要。

    在PRRSV基因組中,ORF5基因是變異最頻繁的開放閱讀框之一,大量研究表明可以依據(jù)ORF5基因對PRRSV遺傳變異情況進行初步探究[12-14]。為初步分析河北及周邊地區(qū)流行類NADC30毒株遺傳變異情況,本試驗對8個類NADC30毒株ORF5基因序列進行擴增、測序和分析,發(fā)現(xiàn)8個類NADC30毒株ORF5基因與經(jīng)典PRRSV弱毒疫苗毒株VR2332和高致病性PRRSV弱毒疫苗毒株(JXA1和HuN4)同源性相對較低,這提示此類疫苗對類NADC30毒株的防控能力可能有限[13]。

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