GPX模擬物-碲代4-叔丁基杯[4]芳烴的合成及體外活性研究

＊范紅革 岳彩欣 張鴻雁 孫雪 馮德日

（沈陽醫(yī)學院 遼寧 110034）

活性氧自由基（ROS）是體內線粒體呼吸鏈傳遞電子過程中產生的副產物，ROS在體內的大量堆積會引起體內組織細胞脂質過氧化現(xiàn)象，從而導致細胞的損傷和衰老。體內存在著多種可以清除ROS的抗氧化物酶，其中谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）清除ROS的作用非常重要[1,2]。研究表明，體內GPX活性的降低及減少與臨床上多項疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關，包括克山病、各種心腦血管疾病及癌癥等[3]。但在實際的臨床應用中，天然的GPX具有來源有限、在體內穩(wěn)定性差、不易被吸收等特點，這限制了其在臨床上的醫(yī)療應用價值。因此，近年來越來越多的科研人員致力于GPX模擬物的人工合成研究，如Ebselen（PZ51），硒（碲）化環(huán)糊精，硒（碲）化GPX單克隆抗體酶等，其中Ebselen是研發(fā)最早的一種GPX模擬物，被稱為“小分子硒酶”，現(xiàn)已進入實際的臨床應用中[4,5]。

4-叔丁基杯[4]芳烴是繼環(huán)糊精和冠醚之后廣受矚目的第三代有機合成超分子，其是由4個苯酚單元通過亞甲基在酚羥基鄰位連接而成的環(huán)狀小分子聚合物[6,7]。在其分子結構中，每個苯酚單元下端都含有1個活性羥基基團，可以作為修飾活化的目標靶點，進行多種酶催化基團的修飾改造。同時，4個苯酚單元在空間上連接成環(huán)狀，在其分子內部形成一個類似于酶活性中心的疏水腔結構，非常有利于其與各種酶催化底物的結合。近年來，科研人員通過以4-叔丁基杯[4]芳烴為修飾底物，將其改造為多種酶的人工模物[8]。

在本研究中，我們以4-叔丁基杯[4]芳烴為GPX模擬物的修飾底物，將GPX酶的關鍵催化基團-金屬碲（Te）特異的修飾到其疏水腔結構下緣苯酚單元的-OH基團上，合成了一種新化合物-碲代4-叔丁基杯[4]芳烴，該模擬物具有顯著的GPX活性，合成方法如圖1所示。為了進一步研究該模擬物的體外抗氧化效果，我們還建立了由H2O2誘導的血紅細胞體外氧化損傷體系，對該模擬物的抗氧化活性進行研究[9]。

圖1 碲代4-叔丁基杯[4]芳烴合成路線

1.實驗方法

(1)試劑與儀器

對甲苯磺酰氯（p-TsCl）、4-叔丁基杯[4]芳烴、寒羊血購自上海國藥集團有限公司；碲（Te）、谷胱甘肽（GSH）、輔酶（NADPH）、H2O2購于德國Sigma公司；其它試劑為國產分析。

Agilent 7890A-5975C型質譜儀（美國Agilent公司）；Bruker-300型核磁共振儀（瑞士Bruker公司）TMS為內標，甲醇為溶劑；UV-120分光光度計（日本島津公司）；日本日立熒光分光光度計（日本島津公司）。

(2)模擬物的制備方法

①合成化合物2

將50mL二氯甲烷加入三口燒瓶中，然后分別加入3.0g 4-叔丁基杯[4]芳烴和1.8mL三乙胺。將反應液放入0℃冰鹽浴中，30min內滴加P-TsCl/乙腈溶液（3.8g/10mL）。然后將反應液放入室溫條件下，攪拌反應12h。反應結束后，將大部分溶劑從反應液中蒸出，再分別加入1M稀鹽酸和50mL氯仿，繼續(xù)室溫攪拌15min。反應液有機相用NaHCO3萃取三次，調有機相pH值至中性，經無水硫酸鎂干燥、過濾。有機相旋轉蒸發(fā)出大部分氯仿，再加入甲醇，有白色沉淀析出，沉淀經抽濾、甲醇重結晶，最終得到3.45g白色固體，產率為81%，mp176.0～177.4℃；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ:7.75(bs，2H，OH)，7.08(s，4H，ArH)，6.79(bs，8H，ArH)，6.53(s，4H，ArH)，4.26(d，4H，ArCH2Ar)，3.12(d，4H，ArCH2Ar)，1.43(s，6H，ArCH3)，1.29［s，18H，C(CH3)3］，0.97［s，18H，C(CH3)3］；ESI-MS，m/z:956.32[M+HI]+。

②NaHTe的制備

NaHTe的制備方法，參考文獻[5]。

③合成化合物3

將DMF/H2O（體積比為1:1）加入到三口燒瓶中，在氮氣保護下分別加入100mg化合物2和4mL NaHTe，60℃攪拌反應24h。二氯甲烷萃取反應液3次，合并有機相，有機相經無水硫酸鎂干燥、過濾，有機相減壓蒸干，得黃色油狀物67mg。產物進一步經硅膠柱層析分離、純化，洗脫液為石油醚/乙酸乙酯（V:V=5:1），最終得淡黃色固體52mg，產率63%，mp157.2～158.5℃；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ:7.73(bs，2H，OH)，7.18(s，4H，ArH)，6.58(s，4H，ArH)，4.06(d，4H，ArCH2Ar)，3.33(d，4H，ArCH2Ar)，1.18［s，18H，C(CH3)3］，0.86［s，18H，C(CH3)3］；ESI-MS，m/z:870.31[M+HI]+。

(3)模擬物GPX活力測定

我們對模擬物-碲代4-叔丁基杯[4]芳烴的GPX活性進行測定，具體測定方法見文獻[2]。

(4)模擬物體外抗血紅細胞氧化損傷活性測定

①由H2O2誘導的體外血紅細胞氧化損傷評價體系的建立

系統(tǒng)Ⅰ：1ml紅細胞懸液；

系統(tǒng)Ⅱ：1ml紅細胞懸液加入終濃度為10mM的H2O2；

系統(tǒng)Ⅲ：系統(tǒng)Ⅱ中加入終濃度為0.02μM碲代4-叔丁基杯[4]芳烴和0.05mM的GSH；

系統(tǒng)Ⅳ：系統(tǒng)Ⅱ中加入終濃度為0.05μM的碲代4-叔丁基杯[4]芳烴和0.05mM的GSH；

系統(tǒng)Ⅴ：系統(tǒng)Ⅱ中加入終濃度為0.1μM的碲代4-叔丁基杯[4]芳烴和0.05mM的GSH。

其中系統(tǒng)Ⅰ為空白組；系統(tǒng)Ⅱ為損傷組；系統(tǒng)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ分別為加入不同濃度碲代4-叔丁基杯[4]芳烴的保護組。

②損傷血紅細胞溶血度的測定

系統(tǒng)Ⅰ～Ⅴ于37℃溫浴1h，1500rpm離心5min后，取上清液，測各系統(tǒng)溶液540nm下的光吸收值OD540，測定血紅蛋白的含量。

③丙二醛生成量的測定

系統(tǒng)Ⅰ～Ⅴ于37℃溫浴1h，1500rpm離心后取上清液1.0ml，加入0.5ml硫代巴比妥酸（TBA）溶液，沸水浴30min，冷卻后1500rpm離心5min，測各系統(tǒng)溶液532nm下的光吸收值OD532，測定丙二醛的生成量。

④脂褐質生成量的測定

系統(tǒng)Ⅰ～Ⅴ于37℃溫浴1h，加入五倍低滲PBS中，4℃下放置30min，使之完全溶血，16000rpm離心30min后去上清，洗滌沉淀三次。得到乳白色的影膜（發(fā)暗）。用1:2的甲醇-氯仿溶液抽提血影膜，有機相用熒光分光光度計于300～400nm范圍內掃描最大激發(fā)波長，然后以其最大激發(fā)波長在400～500nm范圍內進行熒光強度的測定。

2.結果和討論

(1)模擬物的GPX活性

實驗結果表明，碲代4-叔丁基杯[4]芳烴的天然GPX活力達到了321.16U/μmol。同時，我們還將該模擬物的GPX活性與其他幾種以報道的GPX模擬物活性[10]進行了比較，結果如表1所示。

表1 不同GPX模擬物的酶活性比較

(2)模擬物抗血紅細胞氧化損傷的保護作用

①模擬物可以降低血紅細胞的溶血度

以H2O2誘導的血紅細胞損傷組溶血度為100%，其它各保護組及空白組的溶血度為保護組及空白組的OD540與前者OD540的百分比。從表2可以看出，不同濃度的碲代4-叔丁基杯[4]芳烴對于由H2O2誘導的血紅細胞溶血現(xiàn)象都有一定的保護作用，且其保護作用隨著模擬物濃度的升高而越來越顯著。其中0.1μM碲代4-叔丁基杯[4]芳烴保護組的紅細胞溶血保護度已經接近空白組紅細胞發(fā)生自溶血現(xiàn)象的溶血保護度。

表2 碲代4-叔丁基杯[4]芳烴對由H2O2誘導的血紅細胞溶血保護作用

②模擬物可以抑制損傷血紅細胞中丙二醛的生成

H2O2誘導血紅細胞氧化損傷后，血紅細胞內大量的脂肪酸等物質會發(fā)生顯著的脂質過氧化現(xiàn)象，該過氧化反應的終產物是丙二醛（MDA），MDA在細胞中的生成量可以表明血紅細胞的脂質過氧化程度。圖2的實驗結果表明，在由H2O2誘導血紅細胞損傷組中，其MDA的生成量會顯著增加，說明紅細胞內脂質過氧化現(xiàn)象嚴重。而在加入模擬物碲代4-叔丁基杯[4]芳烴后的保護組中，MDA的生成量都有一定程度的降低，且隨著模擬物濃度的提高，則保護組中MDA生成量會越來越少。0.1μM碲代4-叔丁基杯[4]芳烴保護組中MDA生成量僅為損傷組的36.2%。結果表明碲代4-叔丁基杯[4]芳烴可以有效的抑制損傷血紅細胞中脂質過氧化現(xiàn)象的發(fā)生。

圖2 不同濃度碲代4-叔丁基杯[4]芳烴對MDA生成抑制作用的比較

③模擬物可以抑制損傷血紅細胞中脂褐質的生成

損傷血紅細胞中脂質過氧化反應終產物丙二醛MDA可以進一步與游離氨基生成熒光性的Schiff堿分子-脂褐質，其在300～400nm光激發(fā)條件下，在400～500nm可以產生熒光。因而我們通過測定損傷血紅細胞過氧化反應產物中脂褐質的熒光強度來進一步評價碲代4-叔丁基杯[4]芳烴體外抗氧化活性。圖3表示以393nm為激發(fā)波長，在454nm條件下測定的各組熒光強度評價結果。該實驗結果基本上與損傷血紅細胞中MDA生成量評價結果相吻合，加入模擬物碲代4-叔丁基杯[4]芳烴后的保護組可以明顯的抑制血紅細胞中脂質過氧化現(xiàn)象的發(fā)生，且抑制效果隨模擬物濃度的增加而逐漸加強。

圖3 不同濃度碲代4-叔丁基杯[4]芳烴對脂褐質生成抑制作用的比較

3.總結

我們將GPX酶關鍵催化基團-金屬碲（-Te）引入到底物4-叔丁基杯[4]芳烴結構中苯酚單元的-OH基團上，合成了一種新的GPX模擬物-碲代4-叔丁基杯[4]芳烴。其天然GPX活性可達321.16U/μmol，雖然該模擬物的GPX活性與天然GPX酶的活性相比仍存在一定差距，但相比于幾種已報道的GPX模擬物來說，該模擬物已經表現(xiàn)出了更顯著的抗氧化活性。同時，我們建立了由H2O2誘導的體外血紅細胞氧化損傷體系，對該模擬物的體外抗氧化活性進行了進一步的研究。實驗結果表明，模擬物碲代4-叔丁基杯[4]芳烴對于由H2O2誘導的血紅細胞氧化損傷現(xiàn)象具有明顯的抑制作用。其能夠有效的降低血紅細胞溶血現(xiàn)象，同時還可以明顯抑制損傷血紅細胞中脂質過氧化產物MDA及脂褐質的累積。