白酒中氨基甲酸乙酯形成機制、檢測技術(shù)及控制研究進展

尤小龍，程平言，胡 峰，田棟偉，張二康，朱安然

(貴州茅臺酒廠（集團）習(xí)酒有限責(zé)任公司,貴州習(xí)水 564622)

白酒是我國傳統(tǒng)的蒸餾酒，也是我國特有的傳統(tǒng)酒種，具有獨特的工藝和風(fēng)格，以其優(yōu)異的色、香、味、格受到廣大飲用者的喜愛，中國白酒工藝區(qū)別于西方蒸餾酒，例如自然接種、開放式的固態(tài)純糧發(fā)酵等，造就了中西方蒸餾酒的不同風(fēng)格[1-3]。在白酒釀造過程中，使用的多種原料輔料的部分含氮化合物，會生成氨基甲酸乙酯前體物質(zhì)，繼而被微生物轉(zhuǎn)化導(dǎo)致食品中內(nèi)源性的產(chǎn)生一種潛在的基因致癌化合物——氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）[4-5]。EC最先被國外學(xué)者在酸乳酪中檢測發(fā)現(xiàn)，隨后很多研究者在涉及到發(fā)酵生產(chǎn)工藝的食品及酒精飲料中也檢測到了EC 的存在。隨著人們對自身健康問題的重視及對白酒產(chǎn)品食品安全信息的關(guān)注，學(xué)者們對白酒中EC 的研究逐步廣泛開展[6-7]。相關(guān)研究顯示，白酒產(chǎn)品中的EC 含量檢出限在239.40 μg/L[8]。雖然我國暫時并未制定白酒中有關(guān)EC 的強制性標(biāo)準(zhǔn)，但是白酒中EC 的問題已經(jīng)引起了廠家和消費者的普遍關(guān)注。聯(lián)合國糧農(nóng)組織規(guī)定醬油中的EC 含量不得超過20.00 μg/L，酒精飲料中的標(biāo)準(zhǔn)首次是由加拿大政府于1985 年出臺，其對各類酒精飲料中EC 的含量進行了限定，例如對蒸餾酒、白蘭地、葡萄酒分別限量為150.00 μg/L、400.00 μg/L、100.00 μg/L[9]，我國現(xiàn)階段對酒精飲料中EC 含量并未制定強制標(biāo)準(zhǔn)，許多名優(yōu)酒企都暫時參照加拿大的國際限量對EC 進行控制。作為白酒的生產(chǎn)大國，隨著中國白酒在全球市場日益火熱，EC 生成機制及控制消除問題迫在眉睫。因此，探究如何有效抑制白酒釀造過程中產(chǎn)生的EC，有利于保障中國白酒在全球市場的地位，以及鞏固中國白酒的國際形象。本文參考國內(nèi)外的相關(guān)研究內(nèi)容，針對白酒中EC 的危害、產(chǎn)生機制、檢測技術(shù)及控制方法等方面進行綜述，以期為中國白酒產(chǎn)品食品安全風(fēng)險評估及處理提供理論依據(jù)。

表1 部分飲料酒中EC最高限量 (μg/L)

1 氨基甲酸乙酯概述及在白酒中形成機制

1.1 概述

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）又名烏拉坦、尿烷。在許多產(chǎn)業(yè)中，EC 都有廣泛的用途，在工業(yè)領(lǐng)域，常用于制備改良氨基樹脂產(chǎn)品，也常作為化學(xué)中間體用于紡織加工，使紡織產(chǎn)品的耐洗抗磨損性能增強；在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，可作為催眠劑用作部分人群精神治療，也常作為助溶劑輔助生產(chǎn)部分不易溶于水的鎮(zhèn)靜類藥物；在日常生活中，部分殺蟲劑和化妝品也將其作為添加劑使用[10-12]。但是在食品領(lǐng)域，它是一種在許多食品及酒精飲料發(fā)酵儲藏過程中自然生成的副產(chǎn)物，被視作食品安全風(fēng)險因素，一系列動物實驗證明，EC 會增大動物機體肺癌、淋巴癌、肝癌和皮膚癌等疾病的患病風(fēng)險，是一種潛在的基因致癌化合物，相關(guān)機制研究證明，動物體內(nèi)部分未能代謝排出體外的EC，具有誘導(dǎo)毒性，會使活性氧過量產(chǎn)生，導(dǎo)致機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低細胞排毒能力和還原能力，誘發(fā)DNA 和蛋白質(zhì)的破壞。同時部分人體內(nèi)EC 將轉(zhuǎn)化為乙烯基氨基甲酸酯、α-羥基乙基氨基甲酸酯和乙基-n-羥基氨基甲酸酯等乙烯基-氨基-甲酸酯環(huán)類氧化物，促進人體細胞DNA 的氧化損傷。人體內(nèi)EC 及其衍生物的毒性會導(dǎo)致生物的機體產(chǎn)生癌變，1943年EC 首次被確認為致癌物，1974 年國際癌癥研究機構(gòu)將EC 歸類為2B 類致癌物，2007 年正式將EC歸類為2A級致癌物[13-16]。國內(nèi)對EC的研究普遍集中于發(fā)酵的食品及飲料酒，例如醬油、黃酒、葡萄酒、威士忌、朗姆酒等的EC 定量檢測中，針對其產(chǎn)生及控制機制研究較少[17-18]。

1.2 氨基甲酸乙酯在白酒中形成機制

EC 在白酒釀造過程中，其形成來源于多種前體物質(zhì)，相關(guān)研究表明，在白酒的生產(chǎn)過程中，有不少于5 種前體物質(zhì)通過不同的代謝途徑轉(zhuǎn)化為EC，這些前體物質(zhì)根據(jù)在白酒中的主要代謝途徑大體可分為兩類，一類是經(jīng)過尿素乙醇途徑代謝反應(yīng)生成EC的尿素反應(yīng)相關(guān)化合物，例如尿素、瓜氨酸、精氨酸、氨基甲酸酯磷酸酯等；另一類是由氰化物乙醇代謝途徑產(chǎn)生EC 的氰酸、氫氰酸等含氰基化合物，這類化合物統(tǒng)稱氰化物[19]。

尿素是白酒中EC 產(chǎn)生的重要前體，早在1976年國外學(xué)者就通過實驗證明，常溫狀態(tài)下尿素可與乙醇溶液反應(yīng)生成EC，故尿素在各生產(chǎn)環(huán)節(jié)的含量直接影響了白酒中EC 的生成量。白酒生產(chǎn)中，尿素主要由釀造原料帶入生產(chǎn)體系，在發(fā)酵過程中相關(guān)微生物的作用下，與乙醇進行反應(yīng)生成EC。餾酒過程中，溫度的升高加快尿素與乙醇的反應(yīng)速率，EC 的含量會有較大幅度的升高，未反應(yīng)的尿素還會在貯酒過程中繼續(xù)反應(yīng)產(chǎn)生更多的EC[20-21]。白酒中EC 的產(chǎn)生在很大程度上受尿素含量的影響。仇鈺瑩等[53]在對濃香型白酒中EC 形成機制的研究中發(fā)現(xiàn)，釀造原料和酒醅中均能檢測到尿素，且含量較高，達到30～60 mg/kg。通過模擬蒸餾還發(fā)現(xiàn)尿素對白酒中EC 含量影響較大。尿素在許多酒精飲料發(fā)酵過程中都存在，且含量較高。常見酒類如黃酒在發(fā)酵過程中尿素含量可達25.65 mg/L，葡萄酒可達5.10 mg/L，白酒酒醅中可達55.73 mg/kg。

白酒產(chǎn)生EC 的另一個重要前體物質(zhì)為氰化物，氰化物一般是氰酸、氫氰酸、含氰基化合物等形式存在的多種化合物的統(tǒng)稱，以上任何一種氰化物存在形式均能與乙醇反應(yīng)產(chǎn)生EC。國內(nèi)外多項研究已證明EC在蒸餾酒中的主要前體物質(zhì)之一是氰化物，其并非天然存在，是由氰糖苷自發(fā)轉(zhuǎn)化而來，氰糖苷在多種發(fā)酵需要的植物中普遍存在，經(jīng)加熱裂解等化學(xué)反應(yīng)即會生成氰化物，氰化物被氧化為氰酸鹽后，氰酸根就會和乙醇分子反應(yīng)生成EC[22-23]，氰化物易揮發(fā)，在蒸餾過程中很容易變?yōu)闅鈶B(tài)被帶入餾分中，從而在氣相或固相之間產(chǎn)生EC。中國白酒中的氰化物研究已取得了一定成果，被證明是中國白酒中EC最主要的前體物質(zhì)[24-26]。

2 氨基甲酸乙酯在白酒中的檢測方法

EC 的準(zhǔn)確定量是EC 研究開展的前提，簡單快速且精確定量EC 的檢測方法研究近年一直持續(xù)進行，結(jié)合處理樣品物理化學(xué)性質(zhì)的差異，研究人員可以配合不同的前處理方法，搭配各種檢測儀器，開展各種物質(zhì)中EC 含量的檢測，不同方法的檢測限從0.1～30 μg/L不等。

2.1 前處理方法

EC 的檢測樣品大多數(shù)為發(fā)酵食品，樣品中各類成分較為復(fù)雜，需要通過前處理去除其中對檢測干擾較大的雜質(zhì)，保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確有效。前處理步驟一般包含提取、凈化和富集等，溶劑萃取、固相萃取都是較為常見的EC 前處理方法。前處理時可以在樣品中加入內(nèi)標(biāo)，用來消除系統(tǒng)誤差，提升檢測準(zhǔn)確度，最常用的內(nèi)標(biāo)物是d5-EC。

2.2 色譜法

最早用于測定EC 的就是色譜法。氣相色譜法（GC）一般用于分析沸點在500 ℃以下、相對分子量小于400、不易分解的物質(zhì)，具有分析速度快、測定成本低等優(yōu)點，現(xiàn)已成為各大檢測機構(gòu)最常用的EC 檢測方法。但是GC 需要較為昂貴的儀器，操作步驟較為復(fù)雜，另外GC 僅靠保留時間來確定某種物質(zhì)，對于復(fù)雜基質(zhì)（如發(fā)酵食品）來說，EC 很容易受到樣品中其他物質(zhì)的干擾，很難準(zhǔn)確、靈敏地測定EC 的含量，因而限定了GC 法的廣泛應(yīng)用。高效液相色譜（HPLC）儀器操作簡單且儀器價格相對便宜，在整個檢測領(lǐng)域應(yīng)用更為廣泛[27-28]。采用HPLC法檢測EC，進樣前需要在酸性條件下與占噸醇衍生，通過優(yōu)化衍生條件和流動可達極低的檢測限。但HPLC 法的缺陷也比較突出，對于乙醇含量較高的酒類，乙醇某種程度會干擾衍生反應(yīng)，甚至在衍生時轉(zhuǎn)化成EC，對樣品進行稀釋使乙醇含量一致的話又間接提高了定量限；對于部分帶有顏色的酒精飲料，衍生前需要先進行脫色及除雜處理，導(dǎo)致整個實驗時間被拖長。占噸醇與EC 的衍生反應(yīng)是一個酸性條件的可逆反應(yīng)，衍生過程不算穩(wěn)定，會導(dǎo)致實驗結(jié)果出現(xiàn)誤差，加上衍生產(chǎn)物在230 nm 激發(fā)波長下有308 nm 和600 nm 兩個發(fā)射波長，方法的穩(wěn)定性無法保障[29-30]。

2.3 氣相色譜-質(zhì)譜法

氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）是目前為止在酒精飲料中使用最為廣泛的EC 測定方法。GC-MS在GC 法高分離效能的優(yōu)點基礎(chǔ)上，具備了MS 的高鑒別特點，可以實現(xiàn)從構(gòu)成較為復(fù)雜的樣品中鑒別某一特定組分[31]。但是使用GC-MS 開展實驗時，需要對樣品進行較為復(fù)雜且耗時的前處理，過程步驟較多，導(dǎo)致分析誤差增大，實驗人員的前處理操作水平對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性影響很大，主觀影響因素較多[32]。

2.4 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

當(dāng)樣品的基質(zhì)效應(yīng)過強，或者樣品的基質(zhì)過于復(fù)雜，使用GC-MS 法測定其中的EC 含量就非常困難，各種基質(zhì)極大的干擾了測定結(jié)果。固相微萃取可以一定程度解決上述問題，但固相微萃取技術(shù)操作和設(shè)備要求較多，實際操作麻煩。氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS-MS）可以解決上述難題。2005 年，GC-MS-MS 技術(shù)首先被外國學(xué)者用于測定酒精飲料中的EC，其以m/z 44 作為定量離子峰，檢出限為0.01 mg/L[33]。使用GC-MS-MS 技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確、靈敏及自動檢測發(fā)酵食品及酒精飲料中的EC，但是GC-MS-MS 設(shè)備昂貴、后期維護成本高，對其廣泛推廣運用造成了巨大限制。

2.5 超高效液相色譜-質(zhì)譜法

超高效液相色譜-質(zhì)譜法（UPLC-MS）是目前為止用來檢測EC 的方法中，最為快速和高效的方法，其集合了LC 的分離能力以及質(zhì)譜設(shè)備的高靈敏定量能力，對目標(biāo)物的選擇性能極佳，適用于基質(zhì)復(fù)雜的樣品測定，對樣品的前處理過程極為簡單，大部分情況下僅需對樣品進行稀釋或基質(zhì)去除即可進樣，測定結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好[34]。近年有學(xué)者利用了EC 分子源內(nèi)裂解的特殊性質(zhì)，在超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜一級全掃描模式下，以EC母離子（m/z 90.05）及其子離子（m/z 62.02）作為定性離子，m/z 62.02 作為定量離子，開發(fā)出了醬香型白酒中EC 的一級子離子定量法，有效地解決了一級母離子定量噪音較大、二級子離子定量響應(yīng)較低的問題[35]?？傮w而言，UPLC-MS 法具有分析速度快、檢出限低、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點，適用于酒精飲料中EC的監(jiān)控。但同樣的，因設(shè)備極為昂貴，導(dǎo)致其無法廣泛應(yīng)用。

3 氨基甲酸乙酯在白酒中的消減方法

白酒中EC 形成于釀酒的全過程中，重點集中于發(fā)酵、蒸餾、貯存三個階段。根據(jù)EC 生成的主要機理，學(xué)者們從原輔料的處理、工藝的控制、發(fā)酵菌種選育改良以及原酒中直接去除等方面著手，針對EC本體以及EC生成的前體物質(zhì)，開發(fā)了多種酒飲料中EC 含量的降除方法。目前去除EC 的途徑主要有以下幾個方面：

3.1 優(yōu)化工藝

對生產(chǎn)工藝進行優(yōu)化，可以達到減少EC 的目的[36]。對生產(chǎn)工藝的優(yōu)化，可以從原輔料的篩選和處理著手，白酒釀造過程中高粱和小麥中的含氮量會對白酒中EC 生成量造成影響，原料種植過程中施加氮肥的用量會對尿素以及氰化物的含量造成影響，控制氮肥用量可以降低白酒的EC含量；對高粱、大米或者小麥的漂洗和精煉也可減少發(fā)酵過程中的尿素含量。以上工藝優(yōu)化措施雖然可以控制EC 含量，可能也同時會對原料品質(zhì)產(chǎn)生影響[37]。也可通過優(yōu)化發(fā)酵過程條件控制EC 含量，多項研究顯示，釀酒過程中多種環(huán)境條件會影響EC 的生成量，例如pH 值、氧氣、儲存器具、溫度等，發(fā)酵過程中選用的菌株種類也會對EC 生成造成影響[38]。溫度是影響發(fā)酵食品中EC 形成的重要因素，白酒釀造過程中，溫度提升與酒的品質(zhì)以及酒體質(zhì)量穩(wěn)定性有很大關(guān)聯(lián)，但是也促進了EC 的形成。雖然溫度影響EC 形成的機制暫未明確，但在較低溫度下進行餾酒、貯存、發(fā)酵確實能降低EC 含量，在許多食品尤其是酒類發(fā)酵食品中均得到證實，例如在黃酒釀造過程中，通過降低煎酒、滅菌以及陳釀的溫度，均可以有效減少黃酒中EC 的含量。除溫度的直接影響外，對EC 熱力學(xué)和動力學(xué)的深入研究表明，酒精如果通過金屬容器蒸餾，在異氰酸為代表的EC 活性前體物質(zhì)的催化作用下，EC 含量會增加，在蒸餾過程進行“去頭掐尾”的工藝操作，EC 含量會顯著降低[39-40]。王金夢等[41]的研究表明，將壺式二次蒸餾技術(shù)運用于濃香型白酒的中試生產(chǎn)中，EC 的絕對去除率可達97.1%。白酒醇厚的復(fù)合型香氣來自于其獨特的工藝，優(yōu)化白酒生產(chǎn)工藝極大可能會改變酒體風(fēng)味，所以許多通過優(yōu)化工藝降低EC 的方法，都停留在理論階段，因此優(yōu)化工藝方法是否能在應(yīng)用實際生產(chǎn)中減少EC 的含量還有待驗證。

3.2 直接去除

除控制生產(chǎn)工藝外，運用物理和化學(xué)方法，對EC 進行直接降解、去除能有效降低EC。運用EC水解酶直接將EC水解成氨、乙醇和二氧化碳，相關(guān)研究從20 世紀(jì)80 年代起開展并取得了對應(yīng)成果。日本學(xué)者在2006 年首次從馬紅球菌中分離得到了EC 水解酶[42]，對其生物序列開展分析，得出該酶對EC 的針對性不強，對系列氨基甲酸乙酯類化合物均有水解效果。隨后，國外研究人員不斷從青霉菌、檸檬酸桿菌、紅酵母菌等菌株中分離出EC 降解酶[43-45]。李京京等[46]純化了賴氨酸芽孢桿菌中EC 水解酶獲得了純酶，可耐受高濃度的酒精和鹽分?，F(xiàn)階段針對EC 水解酶類的研究表明，天然微生物代謝獲得的EC 水解酶酶活力整體偏低，且白酒普遍具有酸類、乙醇含量高的特點，故EC 水解酶除酶活需要達標(biāo)之外，對其耐酸性和耐乙醇性也有較高要求，因此白酒中EC 的水解酶應(yīng)用仍不成熟。

運用物理吸附或者吸附加過濾技術(shù)去除EC 也是一種有效且常見的方法，物理脫除EC 主要根據(jù)被脫去物的性質(zhì)，選擇不同的方式以及介質(zhì)，常用的吸附介質(zhì)有活性炭、硅膠、硅藻土、殼聚糖和聚乙烯吡咯烷酮等，在酒類飲料中，應(yīng)用范圍最廣泛的吸附介質(zhì)為硅藻土和活性炭，硅藻土用于吸附黃酒中的EC 后能最大程度地保持酒體風(fēng)味，故在黃酒中使用較多。天然硅藻土雜質(zhì)含量較高，提純改性等處理方法可提高其吸附性能，曹甜等[47-48]利用堿法改性硅藻土和殼聚糖改性硅藻土，探索其對黃酒中EC的吸附性能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過堿處理后，硅藻土對黃酒中EC 的減除率大大提升，且處理后酒體風(fēng)味與原酒基本一致?；钚蕴勘桓鄳?yīng)用于吸附白酒和醬油中的EC，由于活性炭吸附劑對EC 的吸附均為非特征吸附，白酒中微量風(fēng)味成分會與EC 一起被吸附過濾，對白酒品質(zhì)影響較大[49]。除一般吸附劑外，學(xué)者們也對樹脂吸附酒精飲料中的EC 開展了研究，徐巖[50]首次采用苯乙烯基大孔樹脂,研究建立了柱式連續(xù)吸附減除黃酒中高濃度EC 的技術(shù)方案，利用自行設(shè)計試制的500 L 級柱式連續(xù)吸附中試裝置,對5 噸EC 含量在1000 μg/L 以上的陳年黃酒基酒樣品進行應(yīng)用試驗，EC 濃度降低了近500 μg/L。

3.3 微生物改良

EC 的主要前體物質(zhì)尿素，其代謝反應(yīng)與發(fā)酵過程的酵母菌息息相關(guān)。已有研究表明，釀酒酵母在精氨酸代謝途徑中代謝精氨酸產(chǎn)生尿素，正常情況下尿素能夠通過氮代謝途徑降解，但氮代謝因偏好型氮源存在發(fā)生阻遏效應(yīng)時，尿素?zé)o法正常代謝，未被分解的尿素會被分泌到細胞外，導(dǎo)致尿素的積累[51]，不同的釀酒酵母具有不同尿素產(chǎn)生能力導(dǎo)致EC 含量不同，基于對釀酒酵母中尿素代謝的充分了解，利用基因工程改造釀酒酵母，減少尿素生成的方法，越來越被重視。根據(jù)精氨酸代謝生成尿素的反應(yīng)，敲除或抑制尿素表達基因以及促進氮代謝反應(yīng)基因的表達可以達到直接降低尿素含量的目的，即構(gòu)建精氨酸酶缺陷的釀酒酵母或強化表達尿素分解代謝相關(guān)酶的釀酒酵母，系列研究證明了遵循該方向的研究實際效果較好。相關(guān)研究也表明，構(gòu)建強化表達尿素分解代謝相關(guān)基因的菌株，遺傳穩(wěn)定性良好，不會引起發(fā)酵過程中發(fā)酵風(fēng)味等特征的改變，但由于尿素代謝能夠產(chǎn)生大量的氨，需要進一步考察對成品酒風(fēng)味、滋味及貯藏特性的影響。通過氮代謝調(diào)控促進尿素代謝基因表達量升高能夠顯著降低發(fā)酵過程中尿素的積累量，趙鑫銳[52]通過改造四種尿素代謝的調(diào)控途徑來降低發(fā)酵過程中的尿素積累，發(fā)現(xiàn)強化Dal81p 和Dal82p 的激活作用能夠顯著增強酵母對尿素的代謝能力，且二者共表達的基因工程菌比對照組降低了55.7 %。由于直接改造后缺失CAR1 基因的酵母不能利用精氨酸，會導(dǎo)致大量精氨酸浪費且影響風(fēng)味，而且發(fā)酵過程也容易受到環(huán)境中野生酵母的污染導(dǎo)致效果不佳，因此，需要進一步考慮抑制或消除精氨酸代謝反應(yīng)帶來的影響。

4 展望

近年來白酒在酒精飲料市場的占有率日益提升，隨著生活品質(zhì)的提高，人們對白酒中EC 等內(nèi)源性風(fēng)險因子也開始重視，為給消費者帶來更好的消費體驗，明確白酒中EC 的產(chǎn)生原因、機制，以及結(jié)合生產(chǎn)實際情況，研究有效的EC調(diào)控措施，對促進我國白酒行業(yè)有序良性的發(fā)展，具有重大意義。同時，食品安全管理部門也應(yīng)該結(jié)合消費者需求以及企業(yè)實際情況，制定相應(yīng)的控制標(biāo)準(zhǔn)，保證EC 的研究更科學(xué)全面的開展。