外泌體在腦缺血再灌注損傷中的作用研究進(jìn)展

陶代菊，何 波，羅興煒，沈志強(qiáng)

（昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650500）

腦缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷是臨床常見(jiàn)疾病之一，腦缺血引起腦組織局部損傷，隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，腦組織可能會(huì)遭受水腫甚至神經(jīng)元壞死等不可逆的損害[1]。腦I/R損傷是指腦組織發(fā)生缺血或缺氧后血流供應(yīng)恢復(fù)造成的組織損傷，但這種腦血液循環(huán)的恢復(fù)并不伴隨著正常功能的恢復(fù)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，腦I/R會(huì)導(dǎo)致腦組織產(chǎn)生大量的氧自由基和炎癥因子，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死，進(jìn)而加重腦組織損傷，引起功能障礙，甚至喪失生理功能[3-5]。目前，治療此類損傷的主要方法是減少氧自由基和炎癥因子的產(chǎn)生，但大多數(shù)治療藥物的療效并不理想。因此，探索新的腦卒中治療策略備受矚目。

外泌體是細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡，電鏡下表現(xiàn)為圓形或橢圓形的杯碟狀囊泡結(jié)構(gòu)，能通過(guò)旁分泌方式將囊泡中的內(nèi)容物如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等傳遞到靶細(xì)胞從而調(diào)控靶細(xì)胞的功能，具有良好的生物相容性和低免疫原性，可以發(fā)揮抗凋亡、抗炎和抗纖維化及促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成等作用[6]。外泌體作為一種自分泌物質(zhì)可穿透血腦屏障[7]，這使得通過(guò)修飾外泌體直接作用于缺血區(qū)成為可能。有研究表明，外泌體可通過(guò)降低氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙改善腦I/R損傷[8-9]。外泌體以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)成為治療腦I/R損傷的靶點(diǎn)，但是外泌體治療腦I/R損傷的機(jī)制尚未完全闡明。本綜述就外泌體與腦I/R損傷之間的關(guān)系作系統(tǒng)回顧，為腦I/R損傷的治療開(kāi)拓新的思路。

1 外泌體的分泌與攝取

1.1 分泌

外泌體是在晚期多囊泡內(nèi)體與質(zhì)膜融合后由細(xì)胞分泌的膜囊泡，可選擇性地募集細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸[10]，直徑30～150 nm[11]。外泌體的生物發(fā)生始于質(zhì)膜內(nèi)陷形成初級(jí)內(nèi)吞囊泡，隨后這些囊泡相互融合，形成早期內(nèi)吞體腔，特定的內(nèi)容物在這一過(guò)程被并入內(nèi)陷膜中，而胞質(zhì)成分被吞噬和封閉在腔內(nèi)囊泡（intraluminal vesicles，ILV）中，包含有多個(gè)ILV的晚期核內(nèi)體被稱為多泡體（multivesicular bodies，MVB）。MVB 腔內(nèi)小泡可能從MVB限制性外膜內(nèi)表面出芽[12]。外泌體分泌到細(xì)胞外需要ILV形成、防止MVB被降解和MVB與細(xì)胞表面的融合3個(gè)步驟；當(dāng)MVB與溶酶體融合時(shí)，它們的內(nèi)容物包括ILV就會(huì)被降解；晚期核內(nèi)體和MVB也可與質(zhì)膜融合，將其ILV作為外泌體釋放到細(xì)胞外空間[13]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，幾乎所有細(xì)胞如神經(jīng)干細(xì)胞[14]、小膠質(zhì)細(xì)胞[15]、神經(jīng)元[16]、星形膠質(zhì)細(xì)胞[17]和少突膠質(zhì)細(xì)胞[18]等均能分泌外泌體。

1.2 攝取

一旦外泌體分泌到細(xì)胞外后，將其攜帶的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)調(diào)控功能，但受體細(xì)胞攝取外泌體的機(jī)制尚未完全闡明。外泌體的生物活性被各種類型的內(nèi)吞作用調(diào)節(jié)，如吞噬作用[19]和大胞吞作用[20]及網(wǎng)格蛋白[21]、網(wǎng)格蛋白/小凹蛋白獨(dú)立[22]和脂筏[23]介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。不同類型細(xì)胞內(nèi)化外泌體的方式也不相同，大多數(shù)外泌體附著在非吞噬細(xì)胞的質(zhì)膜上，而在吞噬細(xì)胞中，這些外泌體通過(guò)吞噬作用直接進(jìn)入靶細(xì)胞，吞噬細(xì)胞比非吞噬細(xì)胞能更有效地內(nèi)化外泌體[22]。

2 外泌體在腦l/R損傷中的作用

外泌體作為細(xì)胞間信號(hào)交流的媒介，隨著近年來(lái)研究的深入，外泌體與腦I/R損傷之間有著密切聯(lián)系。有研究發(fā)現(xiàn)，在短期腦卒中預(yù)后差的患者中血清外泌體微RNA（microRNA，miR）-328-3p的表達(dá)水平明顯高于預(yù)后較好的患者；腦I/R損傷模型大鼠給予預(yù)后差患者血清外泌體，加重大鼠腦I/R損傷，外泌體中miR-328-3p可能作為短期判斷腦I/R損傷程度的生物指標(biāo)之一[24]。有學(xué)者分離大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型大鼠血清中的外泌體，對(duì)其進(jìn)行蛋白測(cè)定發(fā)現(xiàn)，外泌體中生長(zhǎng)停滯和DNA損傷誘導(dǎo)蛋白34（growth arrest and DNA damageinducible protein 34，GADD34）顯著增加，給予GADD34抑制劑可減輕大鼠腦缺血損傷[25]。有研究收集肝I/R損傷模型大鼠血清外泌體，將其注射入正常大鼠體內(nèi)后引起海馬和大腦皮質(zhì)損害[26]。Ye等[10，27]分離并鑒定了急性腦梗死和正常人血清分離的外泌體，將急性腦梗死患者來(lái)源的外泌體注射到MCAO/R模型大鼠，導(dǎo)致腦損傷加重和行為恢復(fù)不良，并促進(jìn)腦部炎癥發(fā)生。綜上，當(dāng)腦I/R損傷發(fā)生時(shí)，外泌體中miRNA表達(dá)失調(diào)，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，進(jìn)一步加重腦損傷。

在細(xì)胞層面，糖氧剝奪/再灌（oxygen glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）模型誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元分泌的外泌體中miRNA表達(dá)失調(diào)，神經(jīng)元源性外泌體以濃度依賴的形式降低了神經(jīng)元的存活率并促進(jìn)其凋亡，且顯著抑制神經(jīng)元樹(shù)突的形成[28]。OGD/R預(yù)處理的大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞與皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)，可導(dǎo)致皮質(zhì)神經(jīng)元的突觸毒性、活性降低和神經(jīng)元凋亡[29]。綜上所述，在腦I/R損傷的病理過(guò)程中，大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元分泌的外泌體中可能含有致病因子，該致病因子被其他細(xì)胞攝取后加重細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致疾病的加重。因此，針對(duì)外泌體內(nèi)容物的靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)，可有效改善腦I/R損傷的癥狀。

3 外泌體治療腦l/R損傷

外泌體中被脂質(zhì)雙分子層包裹的內(nèi)容物分泌到細(xì)胞外后可免受蛋白酶和核酸酶的分解，其結(jié)構(gòu)微小、容易透過(guò)血腦屏障并且具有低免疫原性[30]。這種特性提示，外泌體用于治療腦I/R損傷具有一定優(yōu)勢(shì)。不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)腦I/R損傷展現(xiàn)出較好的治療作用，機(jī)制包括干細(xì)胞來(lái)源外泌體促進(jìn)神經(jīng)血管單元重塑；神經(jīng)系統(tǒng)來(lái)源的星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)祖細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的外泌體能夠促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育和再生，維持神經(jīng)穩(wěn)態(tài)；來(lái)源于血清和血漿的外泌體可以阻止血腦屏障被破壞，使活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成減少，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性增加，改善了線粒體功能，從而降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少腦梗死區(qū)域（圖1）。并且針對(duì)外泌體結(jié)構(gòu)和內(nèi)容物的修飾也展現(xiàn)出了良好的治療潛能。針對(duì)外泌體研究新的藥物可能給腦I/R損傷患者帶來(lái)一種新型的治療策略。

圖1 外泌體治療腦卒中的可能機(jī)制.

3.1 干細(xì)胞來(lái)源外泌體通過(guò)抗炎、抗凋亡改善腦l/R損傷

外泌體可以從不同細(xì)胞中釋放出來(lái)，不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體在腦I/R損傷中發(fā)揮著不同的作用。干細(xì)胞因其具有多向分化潛能而受到廣泛關(guān)注。但干細(xì)胞替代治療時(shí)，到達(dá)損傷部位的干細(xì)胞很少，且干細(xì)胞在植入后存活時(shí)間短，難以達(dá)到預(yù)期療效，故有學(xué)者將干細(xì)胞的分泌物用于腦I/R損傷的治療，其效果優(yōu)于干細(xì)胞替代本身[31-32]。有研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞分泌的外泌體通過(guò)調(diào)節(jié)大腦的細(xì)胞和微環(huán)境改善腦I/R損傷。來(lái)源于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體通過(guò)尾靜脈注射給腦I/R損傷模型大鼠，模型大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力得以改善，血清、皮質(zhì)和海馬中炎癥因子白細(xì)胞介素1α（interleukin-1α，IL-1α），IL-2和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平明顯降低，有效抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[1]。有學(xué)者將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體iv給予腦I/R損傷大鼠，減少了大鼠腦梗死面積，促進(jìn)了大鼠神經(jīng)血管單位重塑，并且誘導(dǎo)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化，從而改善炎癥反應(yīng)[33]。低氧預(yù)處理的干細(xì)胞與OGD/R模型小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后，可促進(jìn)OGD/R模型小膠質(zhì)細(xì)胞的存活，并抑制TNF-α，IL-1β和IL-6等炎癥因子的表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子IL-10的表達(dá)；抑制干細(xì)胞外泌體的分泌則明顯減輕干細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響[34]。MCAO/R模型大鼠尾靜脈注射間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體，可通過(guò)逆轉(zhuǎn)半胱氨酰白三烯受體2/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥，促進(jìn)大鼠髓鞘形成和神經(jīng)元再生，顯著提高大鼠的運(yùn)動(dòng)、記憶和學(xué)習(xí)能力[35]。綜上，正常干細(xì)胞分泌的外泌體可通過(guò)調(diào)節(jié)大腦細(xì)胞微環(huán)境穩(wěn)態(tài)和減少促炎因子的釋放，改善炎癥反應(yīng)，阻止神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而改善腦I/R損傷。

3.2 神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞來(lái)源的外泌體通過(guò)抗凋亡改善腦l/R損傷

神經(jīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞主要包括神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞來(lái)源的外泌體中含有許多miRNA，在腦I/R損傷中發(fā)揮著重要作用，如表1所示。最近研究表明，正常神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞分泌的外泌體在腦I/R損傷修復(fù)中具有保護(hù)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源外泌體通過(guò)靶向Toll樣受體7下調(diào)絲裂原活化蛋白激酶/核因子κB通路，表明miR-34c在星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源外泌體中發(fā)揮腦I/R損傷時(shí)的神經(jīng)保護(hù)作用[36]。M2型小膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的外泌體中含有miR-137，直接靶向Notch信號(hào)通路，在體外減少OGD處理神經(jīng)元的凋亡，維持神經(jīng)穩(wěn)態(tài)，并且在體內(nèi)改善腦I/R損傷小鼠的腦梗死體積和行為缺陷[37]。MCAO模型大鼠側(cè)腦室注射小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體，大鼠的神經(jīng)行為明顯改善；給予外泌體后，神經(jīng)祖細(xì)胞遷移和增殖增加，凋亡減少[38]。M2小膠質(zhì)細(xì)胞衍生的外泌體中過(guò)表達(dá)miR-124，可通過(guò)抑制下游目標(biāo)蛋白特異性蛋白酶的表達(dá)減輕缺血性腦損傷，并促進(jìn)神經(jīng)元存活[39]。綜上所述，神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞來(lái)源的外泌體能改善神經(jīng)通訊，促進(jìn)神經(jīng)元增殖并抑制其凋亡，減輕腦I/R損傷。

表1 外泌體微RNA（miRNA）在腦缺血再灌注（l/R）損傷中的作用

3.3 其他組織細(xì)胞來(lái)源的外泌體通過(guò)抗氧化應(yīng)激和抗炎改善腦l/R損傷

人血液中也含有大量外泌體，研究證實(shí)，血液中的外泌體具有抗腦I/R損傷活性。I/R損傷模型小鼠腦注射血漿來(lái)源外泌體后，腦組織ROS生成減少，SOD活性增強(qiáng)，可阻止血腦屏障的破壞，抑制細(xì)胞凋亡，緩解小鼠腦I/R損傷[7]。從大腦缺血預(yù)處理的小鼠血清中提取外泌體并與OGD/R模型小鼠來(lái)源的神經(jīng)瘤母細(xì)胞共培養(yǎng)能有效減輕炎癥、凋亡和氧化，保護(hù)小鼠來(lái)源神經(jīng)瘤母細(xì)胞免受OGD/R誘導(dǎo)的損傷，并且在外泌體中miR-451a過(guò)表達(dá)，抑制炎癥和氧化發(fā)生[51]。有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞衍生的外泌體通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和抑制細(xì)胞凋亡，直接保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受I/R損傷[52]。綜上所述，血液中的外泌體可通過(guò)影響ROS生成、提高SOD活性、阻止血腦屏障破壞和減輕炎癥等機(jī)制改善腦I/R損傷。

3.4 結(jié)構(gòu)修飾的外泌體在腦l/R損傷中的應(yīng)用

應(yīng)用生物學(xué)技術(shù)可以對(duì)外泌體進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾[53]，包括化學(xué)連接體、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等[54]改變外泌體特定的物質(zhì)，或使用組織工程技術(shù)定量密集外泌體，可以有效治療腦I/R損傷。從大鼠全血中分離出外泌體，將槲皮素和抗GAP43單克隆抗體整合到外泌體中，通過(guò)激活核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）通路明顯減少OGD誘導(dǎo)的人神經(jīng)瘤母細(xì)胞損傷；將其注射入MCAO/R模型動(dòng)物體內(nèi)，可明顯增加其在大腦中的遞送，促進(jìn)大鼠缺血區(qū)細(xì)胞存活，并顯著抑制ROS產(chǎn)生[55]。過(guò)表達(dá)miR-223-3p大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可減少M(fèi)CAO/R模型大鼠腦梗死體積，改善神經(jīng)功能缺損，促進(jìn)大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，并促進(jìn)缺血皮質(zhì)和海馬中抗炎因子的分泌，體外外泌體miR-223-3p以濃度依賴的方式抑制NMLTC4誘導(dǎo)的M1小膠質(zhì)細(xì)胞生成，并促進(jìn)M2小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化[56]。有研究從轉(zhuǎn)染miR-26a-5p的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中分離出外泌體，并將其注射到MCAO模型小鼠體內(nèi)顯著減少小鼠腦梗死體積，這種外泌體與OGD/R誘導(dǎo)的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后能抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6表達(dá)，明顯降低細(xì)胞凋亡[57]。將晚期糖基化終產(chǎn)物拮抗肽RBP-Lamp2b-HA轉(zhuǎn)染到人胚腎細(xì)胞中，獲得分離外泌體，并將其開(kāi)發(fā)為一種低氧特異性載體，用于抗miRNA寡核苷酸的鼻腦遞送。該外泌體與經(jīng)缺氧處理小鼠來(lái)源的神經(jīng)瘤母細(xì)胞共同孵育，可明顯減少晚期糖基化終產(chǎn)物受體陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，這種外泌體通過(guò)鼻腔內(nèi)滴注的方式給予到腦I/R損傷模型大鼠，可降低促炎因子TNF-α表達(dá)，同時(shí)減少細(xì)胞凋亡和梗死體積[58]。

多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外泌體可作為腦I/R損傷的潛在標(biāo)志物，但在針對(duì)外泌體純化和穩(wěn)定提取方面仍有諸多困難。超濾技術(shù)在處理和分析人類血液來(lái)源的外泌體中展現(xiàn)出巨大的潛力，但所使用的設(shè)備影響其分離效率[59]。雖然針對(duì)外泌體的提取和鑒定技術(shù)尚處于發(fā)展階段，但隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，傳感器與微單元集成更加多功能化[60]，等離子體傳感器可對(duì)生物目標(biāo)進(jìn)行實(shí)時(shí)且無(wú)標(biāo)記的檢測(cè)，具有前所未有的靈敏度和檢測(cè)極限。它們不僅能使外泌體得以分離，而且還可在傳感器上進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)分析[61]。未來(lái)，新的外泌體提取、分離和鑒定技術(shù)有望在腦I/R損傷中得以應(yīng)用。

4 結(jié)語(yǔ)

不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體中多種活性成分展現(xiàn)出了明顯的改善腦I/R損傷能力，外泌體具有低免疫原性、無(wú)毒和靶向細(xì)胞攝取內(nèi)化的特點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾包載藥物可將藥物定向攝取到病變部位，將會(huì)極大程度提高該類藥物在腦I/R損傷治療中的地位。雖然外泌體治療腦I/R損傷的研究大多停留在基礎(chǔ)研究階段，但目前已經(jīng)有制劑進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)并取得預(yù)期效果。盡管已對(duì)外泌體進(jìn)行了大量的研究，但關(guān)于其中存在的分子成份、功能和作用機(jī)制及其分泌和攝取等環(huán)節(jié)的諸多問(wèn)題仍有待回答。通過(guò)生物工程技術(shù)使外泌體攜帶有功能性的miRNA，長(zhǎng)鏈非編碼RNA和環(huán)狀RNA用于防治腦I/R損傷，將為腦I/R損傷的治療提供新策略。