柚皮揮發(fā)性有機化合物與牛乳鐵蛋白相互作用分子機制及指紋圖譜

耿照明，周清滕，郭 明，胡智燕，朱杰麗

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，浙江 杭州 311300；2.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023）

柚皮揮發(fā)性有機化合物（pomelo volatile organic compounds，PVOC）因具有獨特的香味及存在大量具有抗菌消炎的烯萜和醛酮類化合物，在醫(yī)藥食品、化學(xué)化工等方面具有潛在應(yīng)用價值[1]。而揮發(fā)性活性物質(zhì)的藥理活性需要與載體蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)運至相應(yīng)作用靶點方能發(fā)揮作用[2]。蛋白質(zhì)可與PVOC分子發(fā)生可逆或不可逆結(jié)合，二者的相互作用高度依賴于PVOC分子的性質(zhì)、蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)與PVOC分子結(jié)合時的結(jié)構(gòu)變化以及溫度和pH等參數(shù)。探究兩者的作用本質(zhì)和規(guī)律是一個系統(tǒng)且復(fù)雜的工作。在處理揮發(fā)性物質(zhì)樣品進行分析時，確保其完整性非常重要。頂空固相微萃?。╤eadspace-solid phase microextraction，HS-SPME）是一種無溶劑的樣品處理技術(shù)，具有成本低、所需樣品少、靈敏度高、重現(xiàn)性好和操作簡單快捷的特點，能較準(zhǔn)確地反映樣品的揮發(fā)物組成[3]，可與氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS），實現(xiàn)揮發(fā)性樣品成分的快速分析[4-5]。光譜學(xué)可用于評估生理條件下蛋白質(zhì)配體相互作用。借助多光譜方法，如熒光猝滅、三維熒光、圓二色性光譜和紫外吸收，可研究蛋白質(zhì)分子相互作用和結(jié)構(gòu)變化的主要作用力。分子建?？梢灶A(yù)測蛋白質(zhì)和配體之間的最佳結(jié)合構(gòu)象[6-7]。

牛乳鐵蛋白（bovine lactoferrin，BLF）是一種源自轉(zhuǎn)鐵蛋白的鐵結(jié)合糖蛋白，主要從牛乳中提取。BLF具有抗氧化、抗癌、抗炎防止微生物感染、維持鐵在正常范圍內(nèi)的平衡和調(diào)節(jié)鐵在腸道的吸收等一系列功能特性[8]，因此被廣泛應(yīng)用于營養(yǎng)補充劑和嬰兒配方食品中。而BLF若在胃內(nèi)消化程度過高，將失去一些生物活性功能，如失去輸運鐵和對抗自由基的功能，可能引起食物過敏，降低在腸道發(fā)揮生理功能的可能性[9-10]。為保證BLF作為一種有效的鐵轉(zhuǎn)運蛋白，必須在到達特定受體之前保持其穩(wěn)定性。因此，尋找一種蛋白質(zhì)-活性物復(fù)合物保護機制來保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性尤為重要。

本研究對PVOC物質(zhì)組與BLF的吸附結(jié)合進行探索，選取低豐度蛋白BLF（圖1）作為PVOC物質(zhì)組小分子的蛋白受體，采用HS-SPME/GC-MS技術(shù)分離、鑒定PVOC，采用光譜和分子建模技術(shù)從微觀角度探究PVOC與載體蛋白之間的相互作用機制，結(jié)合組學(xué)闡釋PVOC物質(zhì)組與載體蛋白作用的分子機制。

Fig.1 Three-dimensional structure of bovine lactoferrin（BLF）（low abundance）

1 材料與方法

1.1 藥材、主要試劑、儀器和軟件

一、二和三級琯溪蜜柚及南非葡萄柚和以色列青柚（3個品種各級挑選1個樣品，依次編號為S1～S9）均采自福建省漳州市平和果園，所選柚子長勢相近，無病蟲害，果實直徑約10 cm，采后4℃保存?zhèn)溆谩-檸檬烯〔（+）-dipentene，Dt，純度≥95%）〕，上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；乙酸芳樟酯（linalylacetate，La，純度≥95%），上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；圓柚酮（nootkatone，Nt，純度≥98%）和BLF（80 ku，純度≥95%），上海源葉生物科技有限公司；醋酸鈉（CH3COONa，NaAc，純度≥98%），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；冰醋酸（CH3COOH，HAc，純度≥98%），上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀和DB-17MS色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm），美國Agilent公司；AL204電子天平，上海梅特勒托利多國際貿(mào)易有限公司；SPME手柄和固相微萃取頭（50 μm/30 μm DVB/CAR/PDMS），美國 Supelco公司；F-4500型熒光分光光度計，日本HITACHI公司；UV-2600型紫外光譜儀，日本SHIMADZU公司；ZD-2型酸度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；J-810CD光譜儀，日本Jasco公司。ChemDraw 2019軟件，美國CambridgeSoft公司；Discovery Studio 2.5軟件，美國Biovia公司；AutoDock4.2.6軟件，美國Scripps Research公司；Origin 2021軟件，美國OriginLab公司。

1.2 頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)構(gòu)建PVOC指紋圖譜及其與牛乳鐵蛋白吸附結(jié)合指紋圖譜

配制0.2 mol·L-1HAc-NaAc緩沖液（pH=7.4），然后使用該緩沖液配制BLF 5×103mg·L-1溶液。PVOC 1.0×10-5mol·L-1單分子及混合液標(biāo)準(zhǔn)品均使用無水乙醇配制。通過5次連續(xù)進樣考察儀器的精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性。將采集的柚子樣品取果皮并切成小塊（2 mm×2 mm），分別稱取0.5 g置于頂空瓶中，25℃于固相微萃取儀上平衡萃取，萃取結(jié)束后，采用GC-MS技術(shù)獲得PVOC指紋圖譜。樣品在GC進樣口熱解吸2 min。色譜條件：氦氣作為載氣，掃描速度3.2 amu·min-1，初始溫度為50℃，保持1 min，然后以10℃·min-1程序升溫至260℃，保持2 min；前進樣口、傳輸線、離子源和四極桿溫度分別為260℃，260℃，230℃和150℃。質(zhì)譜條件：電子轟擊源（electron Impact，EI）電離能量為-70 eV，質(zhì)量掃描范圍為質(zhì)荷比（m/z）50～500，溶劑延遲時間為4.5 min?？傔\行時間24 min。

將收集的9種柚皮PVOC分別定量通入盛有2 mL BLF蛋白溶液的頂空瓶中，密封。室溫低轉(zhuǎn)速平衡攪拌10 min，使PVOC與BLF充分結(jié)合至飽和后進行HS-SPME定時平衡萃取，采用GC-MS技術(shù)獲得PVOC與BLF吸附結(jié)合的指紋圖譜[11]?？瞻讓φ战M（2 mL HAc-NaAc緩沖溶液0.05 mol·L-1）按上述步驟操作。

在NIST98.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫中對GC-MS分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行檢索，查尋有關(guān)質(zhì)譜資料，對基峰、m/z和相對豐度等進行分析，分別對各峰所代表物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和名稱進行確認(rèn)，獲得PVOC物質(zhì)組成分信息[12]，采用峰面積歸一法分析相對含量。采用Origin 7.5軟件建立GC-MS指紋圖譜；以9個柚皮PVOC物質(zhì)組共有成分相對含量為特征，采用離差平方和法，選用歐式距離為測度，對樣品進行聚類分析[13]。

1.3 PVOC物質(zhì)組與BLF結(jié)合的分子模型的建立

使用ChemDraw構(gòu)建PVOC配體結(jié)構(gòu)，并進行MM2能量最優(yōu)化處理，在Autodock軟件中添加原子類型后保存文件。PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫導(dǎo)出“1BLF”晶體結(jié)構(gòu)作為BLF的對接模板。在Pymol中打開配體文件對其進行去水和加氫的前期處理。利用Autodock 4.2.6軟件添加AD4原子類型并保存。利用Autodock進行分子對接，體系盒子大小設(shè)置為X：70，Y：70，Z：70（X，Y和Z分別表示各方向上格點的數(shù)量），格點間隔默認(rèn)0.375 ?（1 ?=0.1 nm），格子的中心移至格子整體包覆住Try523，Try524，Try526和Try560，采用拉馬克遺傳算法（LGA）進行內(nèi)部構(gòu)象搜索，通過AutoDock軟件包的python腳本，運行AutoGrid，進行分子對接，輸出保存為pdb格式。對接結(jié)束后，根據(jù)Autodock 4.2.6軟件內(nèi)分子間結(jié)合能高低進行分子模型評估，首選對接排名較高的對接結(jié)果。在這一步中，PyMol軟件用于pdb文件的可視化和生成。

1.4 紫外光譜、熒光光譜和紫外可見吸收光譜測定PVOC物質(zhì)組與BLF相互作用

使用F-4500熒光分光光度計分別在298和310 K檢測BLF的固有熒光發(fā)射，激發(fā)波長設(shè)置為282 nm，發(fā)射波長設(shè)置為270～450 nm。分別用PVOC單分子（Dt，La和Nt）標(biāo)準(zhǔn)液及物質(zhì)組（Dt，La和Nt）混合液對BLF溶液進行連續(xù)滴定至飽和。對于所有樣品，滴定結(jié)束時乙醇的含量不超過3%（V/V）。根據(jù)式①進行內(nèi)濾效應(yīng)校正[14]。

其中FObs和FCorr分別為初始熒光強度和內(nèi)濾波效應(yīng)校正后的熒光強度。AExc和AEmi分別是PVOC在最大激發(fā)波長處的熒光值和最大發(fā)射波長處的熒光值。

分別取BLF溶液、PVOC單分子標(biāo)準(zhǔn)液及物質(zhì)組混合液各3 mL于比色皿中，測定200～500 nm紫外可見吸收光譜。收集BLF固有熒光發(fā)射數(shù)據(jù)與PVOC單分子的紫外吸收數(shù)據(jù)，根據(jù)F?rster的偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，得到蛋白質(zhì)與配體間作用結(jié)合距離[15]。

通過Stern-Volmer方程（式②）分析熒光猝滅數(shù)據(jù)[16]，探索BLF與PVOC物質(zhì)組結(jié)合機制。

式中，F(xiàn)0，F(xiàn)，Kq，KSV，τ（010-8s）和L分別表示無猝滅劑和有猝滅劑時的熒光強度、猝滅速率常數(shù)、Stern-Volmer猝滅常數(shù)、分子平均壽命和猝滅劑濃度。

確認(rèn)熒光猝滅機制后，用雙對數(shù)Stern-Volmer方程（式③）計算PVOC物質(zhì)組在BLF上的結(jié)合位點數(shù)[17]。

其中，K為結(jié)合常數(shù)，n為結(jié)合位點數(shù)，L為PVOC樣品濃度。

使用Hill方程（式④）消除約束模型中的假設(shè)，減少建模條件之間的差異[18]。

式中，θ為熒光飽和度，F(xiàn)sat為蛋白熒光強度最小時的熒光值，Ka為結(jié)合常數(shù)，nH為Hill系數(shù)，L為PVOC物質(zhì)組樣品濃度。

1.5 理論方程計算PVOC物質(zhì)組與BLF結(jié)合作用力類型和結(jié)合距離

根據(jù)Ross理論[19]，可由體系的焓變（ΔH）、熵變（ΔS）和自由能變（ΔG）來判斷生物大分子與小分子之間相互作用力的類型。配體與蛋白受體分子作用的作用力有氫鍵、靜電作用力、范德華力和疏水作用力。體系的ΔH，ΔS和ΔG可反映蛋白受體與配體之間相互作用力的類型，ΔS＞0表示作用力為疏水作用力和靜電力；ΔS＜0表示氫鍵和范德華力；ΔH＞0，ΔS＞0表示疏水作用力；ΔH＜0，ΔS＜0表示為氫鍵和范德華力[20]。通過熒光光譜極點測取，并根據(jù)Van't Hoff方程（式⑤和⑥）[21-23]，得到體系的ΔH和ΔG。

根據(jù)Gibbs-Helmholtz方程（式⑦），計算獲得作用體系的ΔS。

式⑧中，E為能量轉(zhuǎn)移效率，R0為能量轉(zhuǎn)移效率為50%時分子間的距離，r為供受體分子間的實際距離。式⑨中，溶液折射常數(shù)N=1.336；供體的熒光量子產(chǎn)率Φ=0.118；K2是取向因子，一般將溶液中的供受體當(dāng)作混亂取向，從而取K2=2/3計算R0；式⑩中，J是蛋白熒光發(fā)射譜與猝滅劑紫外吸收譜的重疊積分，λ為波長，F(xiàn)（λ）為波長λ處的熒光值，ε（λ）為波長λ處的紫外吸收值。

1.6 圓二色性光譜法測定BLF蛋白二級結(jié)構(gòu)變化

移取BLF溶液3 mL于比色皿中，以HAc-NaAc緩沖液為參比溶液，記錄圓二色性（circular dichroism，CD）光譜儀上BLF的遠(yuǎn)紫外-CD譜，再分別測定添加等摩爾濃度的3種PVOC單分子及其混合物溶液的CD譜。檢測波長為190～260 nm。BLF的二級結(jié)構(gòu)中占主導(dǎo)作用的α-螺旋含量變化由式[11]計算得出，將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為摩爾橢圓率[θ]（deg·cm2·dmol-1），并繪制CD譜圖。BLF蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征是在208 ～210 nm處出現(xiàn)負(fù)帶[25]，β-折疊結(jié)構(gòu)的特征是在190～200 nm處有一個強的正帶，在210 nm附近有一個負(fù)帶。結(jié)合CD譜圖及式[12]計算α-螺旋含量。以α-螺旋含量反映二級結(jié)構(gòu)變化。

式中，θObs是儀器測定的CD光譜強度；MRE是橢圓率；CP是蛋白物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)；l是樣品池的厚度；n是氨基酸殘基基團的數(shù)目。

1.7 三維熒光光譜法測定BLF蛋白三級結(jié)構(gòu)變化

使用F-4500型熒光分光光度計在298 K檢測記錄BLF的三維熒光數(shù)據(jù)，然后再分別測定添加等體積的3種PVOC單分子及其混合物溶液時BLF三維熒光數(shù)據(jù)。激發(fā)波長（λEx）范圍為220～310 nm，增量為10 nm；發(fā)射波長（λEm）范圍為220～500 nm，增量為5 nm。將三維熒光數(shù)據(jù)導(dǎo)出，使用Origin2021軟件進行可視化分析。以λMax紅移程度或藍(lán)移程度反映蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的程度。以特征峰λEX=280 nm處Peak1的變化反映Tyr和Trp殘基的光譜特征；以λEX=230 nm處Peak2的變化反映多肽骨架結(jié)構(gòu)熒光特征，同時反映蛋白二級結(jié)構(gòu)特征。

1.8 分子動力學(xué)模擬軟件分析BLF-PVOC最佳結(jié)合模型構(gòu)象穩(wěn)定性

選擇PVOC物質(zhì)組單分子（Dt，La和Nt）分別在BLF上的最佳結(jié)合模型進行配體與蛋白的分離，將蛋白與配體分別導(dǎo)入到分子動力學(xué)模擬軟件中，將蛋白置于盒子中心且距離盒子邊緣3 nm，采用AMBER3力場，并向盒子中填充TIP3P周期性水模型，并添加Na+/Cl-以中和電荷，保證體系的穩(wěn)定性。能量優(yōu)化首先采用最陡下降法進行1000步能量優(yōu)化，再采用共軛梯度法進行2000步能量優(yōu)化，之后再進行壓力和溫度平衡。最后系統(tǒng)溫度為298 K，時間步長設(shè)置為2.5 fs。每隔100 ps保存一次能量和坐標(biāo)信息，體系進行100 ns的非限制動力學(xué)模擬。非鍵分子間作用距離截斷值設(shè)置為10.0 ?，每100 ps保存一次能量和坐標(biāo)信息。結(jié)合能計算采用MM/PBSA方法[26]。最后對100 ns模擬結(jié)果進行Cα原子的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）和氨基酸殘基均方根浮動（root mean square fluctuation，RMSF）分析，以此判斷對接模型的構(gòu)象穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 9種柚皮揮發(fā)物指紋圖譜及牛乳鐵蛋白吸附結(jié)合指紋圖譜

方法學(xué)考察結(jié)果表明，各共有峰的相對保留時間及相對峰面積RSD均＜3%，說明儀器的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。以出峰最多且峰型較完整的一級以色列青柚揮發(fā)物作為樣品對照峰，測定S1～S9 PVOC物質(zhì)組的總離子流色譜（total ionic chromatography，TIC）（圖2A），共篩選出21種共有成分（表1）；通過峰面積歸一化法確定PVOC的相對含量，并采用平方和法和歐氏距離進行聚類分析，經(jīng)聚類分析篩選出Dt，La和Nt等活性PVOC物質(zhì)組特征成分[27]。利用HS-SPME/GC-MS測定BLF對柚皮PVOC物質(zhì)組平衡吸附的GC-MS總離子流圖（圖2B），BLF對柚皮PVOC物質(zhì)組平衡吸附的GC-MS數(shù)字化指紋圖譜見表2。

午飯后，辦公室沒人，淼哥坐在辦公桌前看毛姆的《刀鋒》。娟妹一陣風(fēng)似的跑過來坐下興奮地說：“淼哥、淼哥，剛吃飯的時候刷手機，看到一則新聞?wù)f是，一男子三亞游泳，水里擼管致10名女子懷孕。我的天啦，嚇?biāo)缹殞毩?，差點兒沒讓我把剛吃下的雞腿吐出來。你說我們總是遇到那么多不懷孕來做輔助生育的，她們這也太好懷孕了吧？真是人比人，氣死人?！?/p>

Fig.2 Total ion chromatography of volatile organic compounds（PVOCs）of 9 pomelo peels before（A）and after adsorption with BLF（B）.S1-S3，S4-S6 and S7-S9：the first，second and third grade Guanxi pomelo（S1-S3），South African grapefruit（S4-S6）and Israel green pomelo（S7-S9），respectively；R：contrast fingerprint of volatile compounds in pomelo peels.

Tab.1 ldentification results of peaks of PVOCs in 9 pomelo peels in Fig.2A

Tab.2 Digital fingerprint of adsorption and binding degree of common aroma between BLF and PVOCs of 9 pomelo peels

由圖2可知，排除溶劑干擾，9種柚皮的PVOC在與BLF溶液平衡吸附后，指紋圖譜中峰高均有不同程度降低，表明BLF吸附結(jié)合柚皮PVOC的能力較強?，g溪蜜柚和南非葡萄柚的共有特征峰峰高明顯降低，由于出峰位置基本未變，初步判斷該成分與BLF進行結(jié)合。比較圖2A和2B中共有峰峰高并結(jié)合表2中緩沖液與BLF溶液對揮發(fā)物吸附數(shù)據(jù)，可見BLF溶液對9種柚皮的PVOC的吸附量＞緩沖液對揮發(fā)物的吸附量，因此可排除溶劑吸附揮發(fā)物的影響。

對BLF與9種柚皮PVOC共有吸附結(jié)合程度結(jié)果進行聚類分析，以組間分類距離為橫坐標(biāo)，樣品編號為縱坐標(biāo)繪制聚類分析圖（圖3）。結(jié)果在組間距離為10時，存在3條直線能夠連接所有樣品組分，因此PVOC與BLF的吸附結(jié)合程度也被分為3類，即一、二和三級以色列青柚（S7～S9）PVOC是第一類；一、二和三級南非葡萄柚（S4～S6）PVOC為第二類；一、二和三級琯溪蜜柚（S1～S3）PVOC則是第三類。根據(jù)表2分別計算3類PVOC與BLF的吸附結(jié)合程度總和，發(fā)現(xiàn)琯溪蜜柚PVOC與BLF的吸附結(jié)合程度最強是27.492，其次是以色列青柚（21.856）和南非葡萄柚（17.280）。

Fig.3 Systematic cluster analysis tree of degree of common aroma adsorption and binding between BLF and PVOCs of 9 pomelo peels

2.2 PVOC物質(zhì)組與BLF結(jié)合的分子模型

由建立的PVOC物質(zhì)組與BLF結(jié)合的分子模型（圖4）可知，3種PVOC單分子Dt，La和Nt均與BLF上的活性位點Trp560存在氫鍵及不同類型的疏水作用力（圖4B～D）。疏水性配體Nt的羰基氧以4.54 ?的距離與BLF上的Thr636產(chǎn)生氫鍵作用，并被BLF中的Trp560，Asp508，Asp509，Glu521，Lys522，Glu353，Arg531，Ala558，Thr636，Glu635，Lys637，Thr527，Gly528，Lys520形成的疏水封閉球型包裹。

Fig.4 Optimal conformation of BLF combined with PVOCs.A：distribution of PVOCs on BLF；B，C and D：molecular docking model of PVOCs monomolecular Dt，La and Nt binding with BLF，respectively.

La的2個酯基氧分別以5.77 ?和5.74 ?的距離與BLF上的Trp560和Arg531產(chǎn)生氫鍵作用，整個La分子被包裹在BLF中由Trp560，Thr636，Ser519，Thr527，Leu639，Gly525，Tyr524，Gly528，Glu521，Lys522，Arg531及Ala558形成的疏水口袋中。Dt結(jié)構(gòu)中不存在氧原子，與BLF無氫鍵作用，但其上的雙鍵及環(huán)己烯基與BLF上的Trp560和Ala558聯(lián)合產(chǎn)生交叉疏水作用，同時周圍還存在Thr636，Thr527和Arg531等范德華力輔助結(jié)合作用。

2.3 PVOC物質(zhì)組與BLF的相互作用

由熒光譜（圖5）可見，Nt和PVOC物質(zhì)組混合液均能強烈猝滅BLF的內(nèi)源熒光，由于Dt和La對BLF內(nèi)源熒光的猝滅效果相較于Nt不明顯，因此未展示結(jié)果。對比圖5A和5B可看出，在相同的濃度比條件下，PVOC物質(zhì)組對BLF內(nèi)源熒光的猝滅程度強于Nt。在進行的10次滴定過程中，BLF的內(nèi)源熒光強度共降低了372，同時引起B(yǎng)LF熒光發(fā)射譜紅移34 nm。表明PVOC物質(zhì)組與BLF結(jié)合后，BLF的Tyr殘基所處的微環(huán)境疏水性降低，極性增加。從而推斷PVOC物質(zhì)組與BLF發(fā)生了較強的結(jié)合作用。對比圖5A和5B可以看出，Nt與BLF的相互作用則無PVOC物質(zhì)組強烈，前者引起B(yǎng)LF熒光猝滅的程度是后者的1/2倍，且未引起B(yǎng)LF熒光發(fā)射峰紅移或藍(lán)移現(xiàn)象。表明Nt與BLF間的相互作用對BLF結(jié)合位點氨基酸殘基的微環(huán)境影響較小。

Fig.5 Fluorescence spectra and Hill equation fitting curve of BLF combined with Nt and PVOCs mix.A and B：the fluorescence spectra of BLF combined with Nt and PVOCs at 298 K；C and D：fitting curves of Hill equation for BLF+Nt system and BLF+PVOCs system at 298 and 310 K.Curves 1→10 correspond to different concentrations of PVOCs（0-8.64×10-6mol·L-1，pH 7.4）.The variation of fluorescence spectra at 310 K is similar to that at 298 K，not given in the figure.

從圖5C和5D可以看出，溫度升高時，Nt和PVOC物質(zhì)組與BLF的結(jié)合位點數(shù)n值（方程斜率值）增高，分別從2.03，2.23升高到2.58與2.59。表明PVOC分子與蛋白相互作用時溫度增大（蛋白活性范圍內(nèi)），PVOC分子熱運動劇增，觸碰蛋白的活性位點機會增多。

由圖5C和5D中Nt和PVOC物質(zhì)組與BLF作用后R2高線性趨勢可排除同時發(fā)生靜態(tài)和動態(tài)猝滅現(xiàn)象的可能性[28-29]。此外，PVOC物質(zhì)組與BLF作用后Kq均高于2×1010L·mol·s-1，證實二者的結(jié)合是靜態(tài)猝滅機制。Hill方程對熒光猝滅數(shù)據(jù)的擬合結(jié)果見表3。Dt，La，Nt和PVOC物質(zhì)組與BLF結(jié)合的nH值分別為 1.64，1.38，2.03和2.23，Dt和La與BLF結(jié)合的結(jié)合位點數(shù)更接近1，而物質(zhì)組和Nt與BLF結(jié)合的結(jié)合位點數(shù)大于2。表明Dt和La在BLF中存在獨立結(jié)合位點，而物質(zhì)組和Nt在BLF中則有多個結(jié)合位點且依然存在協(xié)同關(guān)系。此外，Dt，La，Nt和PVOC物質(zhì)組與BLF作用后R2均具有較高的線性相關(guān)度，同時Kq值均高于2×1010L·mol·s-1，進一步表明Dt，La，Nt和PVOC物質(zhì)組與BLF形成復(fù)合物是靜態(tài)猝滅機制。

Tab.3 Binding characteristics of BLF with Dt，La，Nt and PVOCs mix at 298 K by fitting fluorescence quenching data with Stern-Volmer and double logarithmic model and Hill model

2.4 PVOC物質(zhì)組與BLF結(jié)合的作用力類型和結(jié)合距離

由Van't Hoff方程及Gibbs-Helmholtz方程計算所得各體系焓變ΔH、自由能變ΔG和熵變ΔS結(jié)果見表4。PVOC物質(zhì)組與BLF的自由能變ΔG均為負(fù)值，以焓為驅(qū)動力自發(fā)結(jié)合，且隨溫度升高，該自發(fā)趨勢增大。此外，Dt+BLF，Nt+BLF和PVOCs mix+BLF體系中ΔH＜0，ΔS＜0，表明范德華力和氫鍵是其主要分子間相互作用力。而La+BLF體系中ΔS＞0，ΔH＜0，表明疏水作用力和范德華力是其主要分子間相互作用力。與圖4分子對接顯示的PVOC物質(zhì)組與BLF結(jié)合的主要作用力類型一致。

Tab.4 Spontaneous tendency and main binding force types of Dt，La，Nt and PVOCs mix with BLF

分子間作用的能量轉(zhuǎn)移機制分為輻射和非輻射2種，前者會導(dǎo)致生物大分子熒光峰形發(fā)生畸變，而后者不會導(dǎo)致生物大分子的熒光發(fā)射峰峰形發(fā)生畸變。PVOC與BLF相互作用的熒光光譜中，BLF的熒光發(fā)射峰形狀未發(fā)生畸變（圖5），可判斷Dt，La和Nt及PVOC物質(zhì)組與BLF間的作用熒光譜為非輻射能量轉(zhuǎn)移。根據(jù)的偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，得到Dt，La和Nt及PVOC物質(zhì)組與BLF的結(jié)合距離r（圖6）分別為3.99，4.76，1.27和1.64 nm。以上4個體系通過計算得出0.5R0＜r＜1.5R0，即PVOC與BLF間的作用距離均＜7 nm，說明PVOC與BLF間的作用為短程分子間作用，進一步驗證了PVOC與BLF間發(fā)生了分子間作用，同時也說明Dt，La和Nt與BLF的能量轉(zhuǎn)移主要是通過非輻射熒光共振能量轉(zhuǎn)移進行的。

Fig.6 Fluorescence-UV overlapping spectra of Dt（A），La（B），Nt（C）and PVOCs（D）combined with BLF.

2.5 PVOC對BLF蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

將得出的CD光譜數(shù)據(jù)通過Origin2021軟件進行可視化分析，如圖7所示。

Fig.7 Circular dichrogram of BLF combined with PVOCs.A-D：the change of circular dichromatography before and after BLF was combined with Dt，La，Nt and PVOCs mix；E：the change of the proportion of α-helix，β-sheet，β-turn and other secondary structure in BLF.

Dt和La分別與BLF結(jié)合后，BLF α-螺旋結(jié)構(gòu)的負(fù)帶特征峰增強，β-折疊結(jié)構(gòu)的正帶特征峰增強（圖7A和7B），α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-折疊結(jié)構(gòu)所占比例均有所增大（圖7E）。Nt與BLF結(jié)合后，BLF的α-螺旋負(fù)帶特征峰削弱，而對β-折疊結(jié)構(gòu)在190～200 nm處的正帶特征峰正性增強（圖7C），說明Nt的介入使BLF的α-螺旋結(jié)構(gòu)減少，β-折疊結(jié)構(gòu)增加（圖7E）。而PVOC物質(zhì)組與BLF結(jié)合則使得α-螺旋負(fù)帶特征峰負(fù)性和在190～200 nm處的正帶特征峰正性增加，說明其與BLF結(jié)合后導(dǎo)致BLF的α-螺旋松動和β-折疊結(jié)構(gòu)增多。

2.6 三維熒光光譜法分析PVOC對BLF蛋白三級結(jié)構(gòu)的影響

BLF與Nt和PVOC物質(zhì)組間作用前后的三維熒光光譜見圖8。與二維熒光結(jié)果一致，Nt與PVOC物質(zhì)組均能有效猝滅BLF內(nèi)源熒光；同樣，由于Dt和La對BLF內(nèi)源熒光的猝滅效果相較于Nt不明顯，因此結(jié)果未展示。BLF+Nt、BLF+PVOC物質(zhì)組相互作用體系三維熒光光譜中2個主要檢測峰Peak1和Peak2的變化結(jié)果見表5。表5中可以看出BLF由于Nt和物質(zhì)組的介入，使得λEX=230 nm處Peak2有較明顯的紅移，且熒光強度降低也較為顯著，這說明，Nt和物質(zhì)組對BLF的二級結(jié)構(gòu)影響較大，導(dǎo)致BLF中大量的α-螺旋松動及部分β-折疊結(jié)構(gòu)增加，這與圓二色性光譜所得結(jié)果高度一致。

Tab.5 Three-dimensional fluorescence spectra of BLF before and after combination with Nt and PVOCs mix

如等高線圖（圖8）所示，Nt和PVOC物質(zhì)組與BLF結(jié)合后Peak1的熒光強度下降，且伴隨輕微的紅移，說明Nt和PVOC物質(zhì)組與BLF發(fā)生了結(jié)合，并分別結(jié)合在BLF的熒光基團當(dāng)中。同時也說明相互作用引起蛋白熒光基團殘基微環(huán)境的改變，對其三級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。結(jié)合圖4分子對接結(jié)果，Nt結(jié)合在BLF上的Trp560殘基上，結(jié)合距離為3.60 ?。而Trp560是BLF上的熒光基團殘基。表明光譜實驗與分子模擬的結(jié)果一致。

Fig.8 3D contour spectra of BLF combined with Nt（A）and PVOCs mix（B）

2.7 BLF-PVOC最佳結(jié)合模型的構(gòu)象穩(wěn)定性

為了探索PVOC物質(zhì)組與不同蛋白受體相互作用規(guī)律，分別對BLF受體蛋白單體體系和由分子對接甄選出的Dt+BLF，La+BLF，Nt+BLF最佳結(jié)合模型體系進行100 ns的分子動力學(xué)模擬，在各個體系中均以初始蛋白構(gòu)象為參照，在模擬時間內(nèi)對系統(tǒng)Cα原子的RMSD進行計算。BLF蛋白質(zhì)單體系的主鏈RMSD平均值為0.208 ?，＞0.2 ?，各二元復(fù)合物體系Dt+BLF，La+BLF，Nt+BLF的蛋白質(zhì)主鏈RMSD平均值分別為0.187 ?，0.191 ? 和0198 ?（圖9A～C），所有結(jié)果均＜0.2 ?，表明所有的動態(tài)模擬軌跡平衡性是合理的，而且當(dāng)PVOC物質(zhì)組單分子進入BLF蛋白質(zhì)活性位點后，使得二元復(fù)合物體系的穩(wěn)定性增強。

Fig.9 Mean values of RMSD and RMSF for C α atoms of various systems.A-C：the mean root mean square deviation（RMSD）values for the Cα atoms of systems of BLF and Dt+BLF，BLF and La+BLF，and BLF and Nt+BLF.C-E：the mean root mean square fluctuation（RMSF）values for the Cα atoms of systems of BLF and Dt+BLF，BLF and La+BLF，and BLF and Nt+BLF.

Dt+BLF，La+BLF和Nt+BLF最佳結(jié)合模型的穩(wěn)定性通過分子動力學(xué)模擬估算后，對各個體系分子動力學(xué)平衡后氨基酸殘基波動情況進行分析（圖9A～C）。結(jié)果表明，BLF在被Dt，La和Nt分子進攻結(jié)合前，整個氨基酸殘基RMSF波動值波動較大，當(dāng)Nt配體分子進入BLF蛋白活性位點之后，RMSF波動值的波動幅度減弱，說明BLF氨基酸殘基能夠與Nt或溶劑產(chǎn)生某種程度的結(jié)合作用。結(jié)合對接可視化結(jié)果，Nt與BLF Thr636殘基以4.54 ?的距離產(chǎn)生氫鍵作用（圖4D）可能導(dǎo)致了BLF構(gòu)象的改變。如圖9D所示，Dt進入BLF蛋白活性位點后，BLF整個氨基酸殘基RMSF波動值波動幅度減小，且BLF Trp560殘基RMSF波動值明顯減小，說明Dt的介入使得BLF蛋白氨基酸殘基剛性增大。結(jié)合圖4B對接可視化結(jié)果，Dt的雙鍵及環(huán)己烯基于BLF Trp560和Ala558殘基聯(lián)合產(chǎn)生交叉疏水作用可能導(dǎo)致了BLF構(gòu)象的變化，這與CD光譜得出的結(jié)論較為一致。

3 討論

本研究利用HS-SPME/GC-MS、多光譜驗證、理論計算及分子建模研究柚皮PVOC物質(zhì)組與BLF的相互作用，發(fā)現(xiàn)BLF對柚皮PVOC物質(zhì)組有較強的親和力，結(jié)合常數(shù)為1.42×105L·mol-1。BLF對烯類PVOC的親和力及結(jié)合力均較強，對酮類及酯類的均較弱。但若將烯類、酯類及酮類同時與BLF進行結(jié)合作用，BLF對柚皮PVOC物質(zhì)組的親和力及結(jié)合力的總和增大，說明柚皮PVOC物質(zhì)組對BLF的結(jié)合作用可能存在強抵消和弱助長的協(xié)同作用關(guān)系。在BLF作為載體時，與BLF親和力較低但活性高的PVOC單分子能與親和力較高的PVOC單分子混合作用于BLF載體蛋白，這可能為提高柚皮PVOC物質(zhì)組單分子的生物利用度提供可行途徑。

BLF與柚皮PVOC物質(zhì)組結(jié)合后，BLF的Tyr殘基所處的微環(huán)境疏水性降低，極性增加，PVOC分子熱運動劇增，觸碰蛋白的活性位點機會增多。Dt和La在BLF中存在獨立結(jié)合位點與BLF形成復(fù)合物是靜態(tài)猝滅機制，而物質(zhì)組和Nt在BLF中則有多個結(jié)合位點且依然存在協(xié)同關(guān)系。Dt，La，Nt和柚皮PVOC物質(zhì)組與BLF間的作用熒光譜為非輻射能量轉(zhuǎn)移。二級結(jié)構(gòu)上PVOC物質(zhì)組與BLF結(jié)合使得α-螺旋負(fù)帶特征峰負(fù)性和在190～200 nm處的正帶特征峰正性增加，α-螺旋松動和β-折疊結(jié)構(gòu)增多?？紤]到BLF由于小分子的嵌入結(jié)合，可能導(dǎo)致的蛋白三維結(jié)構(gòu)疏松不利于保持蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，本研究對蛋白結(jié)合柚皮PVOC物質(zhì)組前后進行了分子動力學(xué)模擬，從模擬的RMSD結(jié)果可以得出，BLF與柚皮PVOC物質(zhì)組的結(jié)合對蛋白的分子結(jié)構(gòu)不會有較大影響，反而在于物質(zhì)組結(jié)合后蛋白的構(gòu)象更趨于穩(wěn)定；但是通過RMSF結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于物質(zhì)組的結(jié)合，BLF分子運動的自由度受到了限制。這也可能對維持蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有一定的促進作用。另外，光譜及分子模擬共同評估了柚皮PVOC物質(zhì)組與BLF的結(jié)合作用的結(jié)合距離、結(jié)合作用力、結(jié)合位置、結(jié)合前后蛋白的二和三級結(jié)構(gòu)變化及束縛PVOC氣體分子的關(guān)鍵氨基酸殘基。組學(xué)角度下綜合闡述柚皮PVOC物質(zhì)組與載體蛋白的選擇結(jié)合的分子機制，可為深入研究活性化合物的藥理學(xué)及毒理學(xué)提供有益參考。