鳳型大曲儲(chǔ)藏期不同部位理化指標(biāo)及微生物群落演替規(guī)律分析

張 艷，曹 丹，孟勤燕，張永利，閆宗科

（陜西西鳳酒股份有限公司，陜西鳳翔 721406）

近年來，各香型白酒對大曲培曲過程中理化指標(biāo)[1]、功能性酶活性[2]、風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生[3]及微生物菌群結(jié)構(gòu)[4-5]研究較多，但對大曲儲(chǔ)藏過程中各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)的變化規(guī)律研究甚少。有研究表明[6-8]，大曲經(jīng)過一個(gè)月的培曲發(fā)酵，形成了多菌共存的微生物環(huán)境，使曲坯中含有大量生酸菌等雜菌，因而大曲培曲結(jié)束后必須經(jīng)過一段時(shí)間的儲(chǔ)存后熟期，待曲坯的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)及微生物菌群結(jié)構(gòu)經(jīng)過自然選擇趨于穩(wěn)定后投產(chǎn)，避免因部分雜菌增殖造成酒醅生酸過猛，影響基酒質(zhì)量及產(chǎn)能；儲(chǔ)存期間部分有益微生物會(huì)繼續(xù)增殖進(jìn)而產(chǎn)生多種酶系，這些酶系在酒醅發(fā)酵時(shí)不僅有助于原料的利用，還能促進(jìn)白酒香氣的形成。研究表明大曲儲(chǔ)藏期對大曲質(zhì)量具有重要影響。為了從理論方面進(jìn)一步提高對鳳型大曲的認(rèn)識，構(gòu)建以微生物群落結(jié)構(gòu)為中心，輻射理化指標(biāo)的理論構(gòu)架，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，追蹤鳳型大曲儲(chǔ)藏階段理化指標(biāo)及微生物菌群環(huán)境的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，綜合分析鳳型大曲儲(chǔ)藏過程對白酒生產(chǎn)的重要價(jià)值，為后期功能微生物的篩選和鳳香型白酒生產(chǎn)工藝的改進(jìn)提供科學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

大曲樣品：選取鳳型大曲38#、64#兩房出房大曲進(jìn)行6個(gè)月的儲(chǔ)存期跟蹤。

試劑：乙酸鈉、葡萄糖、斐林試劑、乙酸、可溶性淀粉等，均為分析純。

儀器設(shè)備：冷凍高速離心機(jī)DH-2000R，上海德洋意邦儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱SPX-250-Ⅱ，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；恒溫水浴鍋SYG-2S，常州朗越儀器制造有限公司；電陶爐。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 取樣

分別取儲(chǔ)藏1～6 個(gè)月的大曲樣品進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定（儲(chǔ)存4 個(gè)月的大曲樣本因疫情影響未獲得）。曲塊外圍樣品粉碎作為曲皮樣，中心樣品粉碎作為曲心樣，完整大曲粉碎作為混合樣。

1.2.2 理化指標(biāo)檢測

理化指標(biāo)測定參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》。

1.2.3 微生物群落多樣性檢測

大曲樣品送上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行微生物多樣性檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 鳳型大曲儲(chǔ)存階段理化指標(biāo)變化規(guī)律研究

2.1.1 水分變化規(guī)律

水是微生物繁殖代謝必不可少的物質(zhì)，在大曲儲(chǔ)藏期間參與到相關(guān)功能酶系及風(fēng)味物質(zhì)的合成過程[9]。從圖1 可以看出，曲皮水分流失較快，整個(gè)儲(chǔ)藏過程中始終低于曲心，整體變化規(guī)律基本一致。與儲(chǔ)藏前相比，儲(chǔ)藏過程中部分水分流失或被微生物利用，六個(gè)月后水分含量略有降低?；旌蠘铀痔幱谇ず颓闹g，變化規(guī)律與曲皮曲心基本相似。

圖1 大曲儲(chǔ)存期水分含量變化

2.1.2 淀粉含量變化規(guī)律

淀粉是微生物生長必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，淀粉含量的變化可反映微生物對淀粉的利用情況，與大曲發(fā)酵儲(chǔ)藏過程中糖化酶和液化酶活性關(guān)系密切[10]。由圖2可知，儲(chǔ)藏期間由于微生物的分解利用，大曲中淀粉含量隨儲(chǔ)藏期的延長整體呈下降趨勢。儲(chǔ)存前期大曲曲皮曲心微生物生長消耗淀粉，淀粉含量逐漸降低；后期曲心微生物受水分、氧氣等影響，生長緩慢，淀粉利用率降低，含量穩(wěn)定，曲皮微生物仍可消耗淀粉進(jìn)行生長繁殖。

圖2 大曲儲(chǔ)存期淀粉含量變化

2.1.3 酸度變化規(guī)律

酸度是評價(jià)大曲質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)。如圖3所示，儲(chǔ)藏前期大曲酸度有所降低，儲(chǔ)藏至三個(gè)月時(shí)由于產(chǎn)酸微生物（主要是乳酸菌和醋酸菌）等代謝產(chǎn)生有機(jī)酸使大曲的酸度升高，后期由于水分、能量物質(zhì)等的消耗以及代謝產(chǎn)物的積累，微生物生長受到抑制，部分有機(jī)酸被微生物利用以及參與到香味物質(zhì)等的合成中，大曲酸度逐漸降低后趨于穩(wěn)定。整體來看，大曲曲皮酸度高于曲心，主要與曲皮微生物相對豐度較高，繁殖較快有關(guān)。

圖3 大曲儲(chǔ)存期酸度變化

2.1.4 糖化力變化規(guī)律

如圖4 所示，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長，受曲皮表面水分流失、溫度變化等的影響，曲皮糖化力有所降低，儲(chǔ)存至3 個(gè)月時(shí)，曲皮中霉菌繁殖使糖化酶活力增強(qiáng)，大曲糖化力明顯升高，后期由于水分流失，營養(yǎng)物質(zhì)消耗以及代謝產(chǎn)物的積累[11]，微生物生長緩慢，使曲皮糖化力逐漸降低后趨于穩(wěn)定。曲心水分、溫度等受環(huán)境影響較小，糖化力變化較小，儲(chǔ)存3 個(gè)月時(shí)曲心內(nèi)部霉菌增殖使糖化力略有升高，后期逐漸趨于穩(wěn)定。整個(gè)儲(chǔ)藏過程中，曲皮糖化力始終高于曲心。混合樣大曲的糖化力變化規(guī)律與曲皮相似，表征曲坯在儲(chǔ)存期間糖化力的基本變化情況。

圖4 大曲儲(chǔ)存期糖化力變化

2.1.5 發(fā)酵力變化規(guī)律

大曲發(fā)酵力與酵母菌關(guān)系密切，發(fā)酵力高低直接關(guān)系到出酒率的高低[12]。由圖5可知，儲(chǔ)藏初期，大曲發(fā)酵力處于較低水平，隨著曲坯中酵母菌等微生物的增殖，曲皮曲心發(fā)酵力有不同程度提高；儲(chǔ)藏2 個(gè)月后，由于水分、氧氣以及環(huán)境等的變化，微生物生長受到抑制，曲皮曲心發(fā)酵力有所降低；后期微生物菌群動(dòng)態(tài)變化使得大曲發(fā)酵力又有所升高。整個(gè)儲(chǔ)藏過程中，曲皮發(fā)酵力始終高于曲心，結(jié)合微生物多樣性分析，可能與鳳型大曲曲皮中乳酸菌相對豐度高于曲心有關(guān)。大曲混合樣的發(fā)酵力始終處于曲皮和曲心之間，變化趨勢同曲心基本相似。

圖5 大曲儲(chǔ)存期發(fā)酵力變化

2.1.6 酯化力變化規(guī)律

大曲酯化力高低受細(xì)菌影響較大，關(guān)系到大曲風(fēng)味物質(zhì)及其前體物質(zhì)的產(chǎn)生[13]。從圖6 可以看出，整個(gè)儲(chǔ)藏過程中曲皮曲心的酯化力變化基本一致，曲心酯化力始終高于曲皮，混合樣酯化力介于曲心和曲皮之間。儲(chǔ)藏前期兩房大曲酯化力都較低，隨著儲(chǔ)藏期的延長，大曲中微生物繁殖產(chǎn)生大量酶系，酯化力逐漸增強(qiáng)，儲(chǔ)存至3 個(gè)月時(shí)酯化力達(dá)到較高水平，在隨后的儲(chǔ)藏過程中，受環(huán)境及大曲自身溫度、水分條件的影響，大曲酯化力逐漸降低后趨于穩(wěn)定直至儲(chǔ)存期結(jié)束。這與李潔等[14]的研究結(jié)果相吻合。

2.2 鳳型大曲儲(chǔ)存階段微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律分析

2.2.1 真菌微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律分析

2.2.1.1 物種分類學(xué)分析

由圖7 可知，大曲儲(chǔ)存階段曲坯中真菌群落歸屬于4 個(gè)菌門，分別為子囊菌門（Ascomycota）、毛霉亞門（Mucoromycita）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、被孢霉菌門（Mortierellomycota）。儲(chǔ)存期大曲曲皮中Ascomycota 占絕對優(yōu)勢，相對豐度在85 %以上，Mucoromycita 占比在9.68%以上，Basidiomycota、Mortierellomycota 占比極??；曲心中Ascomycota 占比達(dá)99.9%以上；混合樣中Ascomycota 占比在98 %以上，含有少量的Mucoromycita，占比在1%左右。

圖7 儲(chǔ)存期大曲門水平真菌群落結(jié)構(gòu)分布

大曲中微生物種類繁多，不同菌群間相互作用不僅促進(jìn)了大曲的成熟，而且產(chǎn)生眾多酶系為白酒發(fā)酵提供動(dòng)力[15]。從圖8 可以看出，儲(chǔ)藏期曲坯中真菌屬種類較少，曲皮曲心種群豐富度差異較大，但均以Thermoascus（嗜熱子囊菌）為主，大曲在發(fā)酵過程中經(jīng)過大火期，高溫條件使大部分微生物死亡，耐高溫的Thermoascus得以存活。大曲儲(chǔ)藏1個(gè)月時(shí)曲皮中優(yōu)勢菌群除Thermoascus外，還有一定量的Aspergillus（曲霉菌屬）、Pichia（畢赤酵母屬）以及Rhizopus（根霉菌屬），后隨著儲(chǔ)存期的延長，曲皮中優(yōu)勢菌群Thermoascus占比略有降低，直至儲(chǔ)存六個(gè)月時(shí)又有所升高；Aspergillus相對豐度在儲(chǔ)存兩個(gè)月時(shí)迅速降低直至儲(chǔ)藏期結(jié)束，占比均在1 %以下；Pichia和Rhizopus占比在整個(gè)儲(chǔ)藏過程中變化不大。由于曲心內(nèi)部受水分、溫度變化影響較小，微生物數(shù)量變化不明顯，曲心菌群中Thermoascus和Aspergillus占絕對優(yōu)勢，整個(gè)儲(chǔ)存過程中相對豐度達(dá)99 % 以上；混合樣中Thermoascus始終占主導(dǎo)地位，儲(chǔ)存期相對豐度在46.96 %～60.90%之間，呈先增大后降低的趨勢，在儲(chǔ)存的第三個(gè)月相對豐度最大，Aspergillus和Pichia也占有一定比例，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長，Aspergillus與Thermoascus相對豐度呈現(xiàn)此消彼長的變化趨勢，Pichia在整個(gè)發(fā)酵期相對豐度為8.11 %～14.34 %。大曲中優(yōu)勢微生物對白酒釀造至關(guān)重要，不同大曲中優(yōu)勢菌屬不同形成了不同香型的白酒[16-17]。

圖8 儲(chǔ)存期大曲屬水平top10真菌組成柱狀圖

2.2.1.2 Alpha多樣性分析通過Illumina高通量測序?qū)P型大曲儲(chǔ)存階段曲坯不同部位真菌群落進(jìn)行多樣性分析，在97 %相似度水平下對序列聚類并進(jìn)行OTU 劃分，結(jié)果見表1。

表1 大曲儲(chǔ)存階段不同部位真菌Alpha 多樣性指數(shù)

Alpha 多樣性是對單個(gè)樣本內(nèi)微生物群落進(jìn)行多樣性和豐富度分析。表1 中coverage 數(shù)值在0.999957～0.999994 之間，表明本次測序結(jié)果能完整反映儲(chǔ)存期大曲中真菌菌群組成的真實(shí)情況。由表1 可知，大曲儲(chǔ)存階段曲皮、曲心及混合樣品中真菌群落豐富度隨儲(chǔ)存時(shí)間的變化呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律，多樣性受儲(chǔ)存時(shí)間影響較小。整體來看曲皮中真菌群落多樣性和豐富度明顯高于曲心，混合樣品居于曲皮和曲心之間，接近曲皮。大曲儲(chǔ)存期是曲坯后熟階段，出房新曲中含有的真菌在儲(chǔ)存階段經(jīng)過自然生長消亡逐漸達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)，大曲的生化性能等也逐漸趨于穩(wěn)定，為后期酒醅發(fā)酵提供動(dòng)力基礎(chǔ)[18]。

2.2.1.3 層次聚類分析

圖9 是儲(chǔ)存期大曲真菌群落層次聚類樹及對應(yīng)的屬水平top10 物種豐度，根據(jù)0.2 聚類距離劃分，圖中所有樣本被分為三大類，儲(chǔ)存2 個(gè)月、3 個(gè)月、5 個(gè)月、6 個(gè)月的曲皮樣本被分為一類，曲心樣本被分為一類，混合樣本、儲(chǔ)存一個(gè)月的曲皮樣本被分為一類，三大類下又被分為不同小類。整體而言，除QC1P 樣本外，曲皮、曲心、混合樣本分別被劃分為不同類，說明儲(chǔ)存期大曲曲皮、曲心、混合樣中真菌群落組成及相對豐度存在明顯差異。對比物種豐度圖來看，混合樣本中真菌組成主要包括Thermoascus、Aspergillus、Pichia、Rhizopus，曲心樣本中真菌組成主要包括Thermoascus、Aspergillus，曲皮樣本中真菌組成主要包括Thermoascus、Pichia、Rhizopus，不同類別下真菌菌群物種組成及相對豐度各不相同。

圖9 儲(chǔ)存期大曲樣本中真菌聚類樹圖

2.2.2 細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律分析

2.2.2.1 物種分類學(xué)分析

鳳型大曲儲(chǔ)存階段門水平下共檢出25 種細(xì)菌門，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）等。由圖10可知，儲(chǔ)存期大曲曲皮、曲心、混合樣品中Firmicutes 為優(yōu)勢菌門，但相對豐度有所差異，曲皮占比56.83%～76.64%，曲心占比15.73%～30.13%，混合樣占比63.89 %～71.99 %；Actinobacteria 和Proteobacteria 也占有一定比例，二者在曲皮和混合樣中的相對豐度明顯高于曲心，這主要是因?yàn)榇笄嗲笃谇きh(huán)境利于細(xì)菌生長，故相對豐度較高，曲心因高溫缺氧抑制了細(xì)菌的生長，相對豐度較低。

圖10 儲(chǔ)存期大曲門水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布

圖11 儲(chǔ)存期大曲屬水平top10細(xì)菌組成柱狀圖

大曲儲(chǔ)存期間細(xì)菌物種組成豐富，曲皮曲心細(xì)菌種類及占比差異較大。在整個(gè)儲(chǔ)藏過程中，曲皮細(xì)菌主要以Lactobacillus（乳桿菌屬）、Weissella（魏斯氏菌屬）、Streptomyces（鏈霉菌屬）為主，Lactobacillus在儲(chǔ)藏3 個(gè)月時(shí)相對豐度增大至39.27 %，后期又降低至30 %左右，Weissella占比在20.88 %～26.48%；儲(chǔ)藏前期曲皮中Staphylococcus（葡萄球菌屬）占比極小，只有0.29 %，在儲(chǔ)藏的第2 個(gè)月，對環(huán)境有所適應(yīng)的微生物再次生長繁殖，Staphylococcus占比迅速增大至3.85%，直至儲(chǔ)藏期結(jié)束相對豐度變化不大；Streptomyces在儲(chǔ)藏的前期和后期相對豐度占比較大，但儲(chǔ)藏2～3 個(gè)月時(shí)由于Lactobacillus、Acetobacter（醋桿菌屬）等細(xì)菌的增殖，Streptomyces占比有所降低；曲皮中Brevibacterium（短桿菌屬）和Corynebacterium（棒狀桿菌屬）在儲(chǔ)藏中期相對豐度明顯增大，后期隨著曲皮水分流失及微生物衰亡，相對豐度降低。曲心細(xì)菌主要以Lactobacillus和Weissella為主，隨著儲(chǔ)藏期延長，二者相對豐度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，這可能是大曲培曲階段曲心內(nèi)部細(xì)菌受條件限制繁殖情況較曲皮弱，營養(yǎng)物質(zhì)消耗少，儲(chǔ)存階段曲心細(xì)菌會(huì)小幅度增殖，至儲(chǔ)存6 個(gè)月時(shí)隨著營養(yǎng)物質(zhì)消耗、產(chǎn)物積累等生長環(huán)境變化抑制了其進(jìn)一步生長繁殖，相對豐度降低；儲(chǔ)藏前期Staphylococcus占比達(dá)到48 %，但從第2 個(gè)月開始占比迅速降低至2 %，直至儲(chǔ)藏期結(jié)束占比一直較低，這可能是因?yàn)镾taphylococcus生長對氧氣、水分等的需求較大，其他微生物的生長對氧氣等的消耗抑制了它的生長。儲(chǔ)存5 個(gè)月的混合樣中Staphylococcus和Corynebacterium占比較大，區(qū)別于其他月份?；旌蠘又屑?xì)菌主要以Lactobacillus、Weissella和Streptomyces為主，占比60.54%～72.48%。大曲儲(chǔ)藏過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在自然環(huán)境下不斷調(diào)整，形成最佳的微生態(tài)環(huán)境，為后期釀造發(fā)酵提供動(dòng)力基礎(chǔ)[19]。

2.2.2.2 Alpha多樣性分析

通過Illumina高通量測序?qū)?chǔ)存期大曲樣本進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析，在97 %相似度水平下對序列聚類并進(jìn)行OTU劃分，結(jié)果見表2。

表2 儲(chǔ)存大曲細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)

對儲(chǔ)存期大曲中不同部位的細(xì)菌菌群進(jìn)行Alpha 多樣性分析，結(jié)果見表2。表中coverage 數(shù)值在0.97958～0.99478 之間，表明本次測序結(jié)果能完整反映儲(chǔ)存期大曲中細(xì)菌菌群組成的真實(shí)情況。Chao1 和Observed_species 指數(shù)反映了大曲中細(xì)菌的豐富度，從表2 可以看出，儲(chǔ)存期大曲曲皮中細(xì)菌豐富度高于曲心和混合樣，且隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長，曲皮、曲心、混合樣中細(xì)菌豐富度均呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，這與儲(chǔ)存期大曲中真菌豐富度的變化規(guī)律相同，表明大曲儲(chǔ)存期間仍有部分真菌和細(xì)菌繼續(xù)增殖，通過自身不斷的代謝調(diào)整逐漸形成穩(wěn)定的微生物群落結(jié)構(gòu)[20]。儲(chǔ)存一個(gè)月的曲皮曲心中細(xì)菌多樣性較低，第2 個(gè)月開始隨著微生物增殖，細(xì)菌多樣性有所增大。

2.2.2.3 層次聚類分析

對儲(chǔ)存期大曲中細(xì)菌群落基于Weighted Unifrac 距離算法進(jìn)行層次聚類分析，可直觀反映各樣本之間的相似性。根據(jù)0.25 聚類距離劃分，圖12中所有樣本被分為兩大類，每一類下又被分為多個(gè)小類，同一分支的樣本表明其相似性高。整體來看，曲心樣本中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成和曲皮樣本差異較大，混合樣本的相似性和曲皮較為相似，對應(yīng)屬水平top10 物種豐度圖可知，這種差異主要源于大曲不同部位細(xì)菌組成的多樣性和豐富度。

圖12 儲(chǔ)存期大曲樣本中細(xì)菌聚類樹圖

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對鳳型大曲儲(chǔ)存后熟期的理化指標(biāo)和微生物菌群演替規(guī)律進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：鳳型大曲儲(chǔ)藏期微生物會(huì)小范圍增殖，大曲水分下降5%左右，曲心始終高于曲皮；微生物對淀粉的利用率在2%～7%之間；儲(chǔ)存期大曲中酸、醇等物質(zhì)相互作用，使曲坯酸度在儲(chǔ)存結(jié)束后有所降低；儲(chǔ)存期大曲糖化力、發(fā)酵力曲皮高于曲心，酯化力曲心較曲皮高，儲(chǔ)藏2～3 個(gè)月時(shí)隨著微生物的變化，糖化力、發(fā)酵力、酯化力較高，后期逐漸趨于穩(wěn)定。儲(chǔ)存期大曲曲皮和曲心中真菌群落結(jié)構(gòu)組成不同，曲皮以Thermoascus、Pichia、Rhizopus為主，相對豐度占比52 %～84 %，曲心以Thermoascus、Aspergillus為主，占比99 %以上。對比培曲階段曲坯真菌群落結(jié)構(gòu)來看[21]，儲(chǔ)存階段曲皮真菌結(jié)構(gòu)組成變化較大，由出房曲的以Thermoascus、Issatchenkia為主演變?yōu)橐訲hermoascus、Pichia、Rhizopus為主，曲心微生物優(yōu)勢菌屬始終為Thermoascus和Aspergillus。儲(chǔ)存期大曲中曲皮曲心細(xì)菌組成種類相似，均以Lactobacillus、Weissella、Streptomyces為主，但相對豐度占比差異較大，曲皮在77%～88%之間，曲心在20 %～55 %之間。Alpha 多樣性結(jié)果進(jìn)一步表明儲(chǔ)存期大曲曲皮微生物多樣性較曲心高。聚類分析結(jié)果表明鳳型大曲曲皮、曲心中微生物多樣性和豐富度存在明顯差異。