響應(yīng)面法優(yōu)化改良米酒工藝研究

田夢銀，王青青，嚴(yán)丹雨，周鴻翔

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院釀酒工程系，貴州貴陽 550025）

米酒（rice wine）又稱酒釀、甜酒，舊時稱“醴”，用糯米釀制，是我國傳統(tǒng)的酒精飲品，通常用蒸熟的糯米拌上糖化發(fā)酵劑發(fā)酵而成。傳統(tǒng)方法釀造的米酒工藝簡單，口味鮮醇甜美，含酒精量較低，具有濃郁的米酒風(fēng)格，是很多人日常飲用的飲品[1]。但在當(dāng)今社會，由于其風(fēng)味陳舊老派、口感單一、色澤黯淡，消費(fèi)人群日益萎縮，逐漸與時代脫節(jié)，缺乏市場競爭力。日本清酒是借鑒中國黃酒的釀造法而發(fā)展起來的日本國酒，主要工藝特點(diǎn)是要求大米外層剝?nèi)ピ綇氐自胶?，米外?cè)的蛋白質(zhì)、脂肪等成分比較多，用于釀酒有損香氣和色澤，難以釀出好清酒。大米經(jīng)研磨除去外皮后,大大減少了米中蛋白質(zhì)、脂肪等含量,浸漬時米粒吸收水更均勻、更快速，蒸飯時米粒易糊化,有利于提高酒的品質(zhì)[2]。清酒釀造的微生物為兩大類，制曲時用的是米曲霉，釀酒用微生物是清酒專用酵母，釀造時采用低溫、開放式并行復(fù)發(fā)酵的方式[3]。釀制好的清酒入口清爽，口味清雅，酒液呈微黃色或無色，清亮透明。因此，將日本清酒的精米、低溫、開放式并行復(fù)發(fā)酵的工藝與中國傳統(tǒng)米酒發(fā)酵工藝相結(jié)合，可得到一種風(fēng)味協(xié)調(diào)、無色透明、無任何添加劑、操作簡便的改良米酒。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：糯米（貴州茅貢米業(yè)有限公司）；酒曲（四川達(dá)州大竹東柳植物甜酒曲、蘇州蜂蜜牌甜酒曲、安琪甜酒曲、雅大牌高產(chǎn)酒曲）；酵母（異常威克漢姆FBKL2.00K8 由貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）。對照酒樣：米色米酒（6%vol），市場采購。

試劑及耗材（除非另有說明，所使用試劑均為分析純）：麥芽糖；Agar Powder；WL 營養(yǎng)瓊脂；濃鹽酸；葡萄糖；3，5-二硝基水楊酸；氫氧化鈉；酚酞；山梨酸鉀（食品級）。

儀器設(shè)備：生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；S-10 生物傳感器分析儀，深圳市西爾曼科技有限公司；MB-RC52 精米機(jī)，日本山本電氣；紫外分光光度計(jì)，上海儀電分析儀有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 米酒的制備工藝流程及操作要點(diǎn)

試驗(yàn)采用工藝流程：糯米→挑選→精米→浸泡→清洗→蒸煮→加水→二次蒸煮→拌曲→糖化→酵母活化及添加、加水→發(fā)酵→過濾→后發(fā)酵→二次過濾→添加防腐劑→包裝→巴氏滅菌→改良米酒。

1.2.2 操作要點(diǎn)

（1）精米：選取顆粒飽滿，無霉變的糯米放入精米機(jī)精白至一定精米度，備用。

（2）糖化：選取精米后的糯米100 g 浸泡8～12 h，洗凈后蒸煮20 min，倒出后按照原料的40 %加水拌勻，復(fù)蒸20 min 后出鍋。攤晾至室溫，按原料的0.5%加入糖化發(fā)酵劑，攪拌均勻后裝入小型發(fā)酵罐中，將糯米壓實(shí)并在中心搭窩。將發(fā)酵罐放入生化培養(yǎng)箱中，控制環(huán)境溫度28 ℃糖化發(fā)酵48 h，備用。

（3）酵母種子液培養(yǎng)：酵母接種到麥芽汁液體培養(yǎng)基中，28 ℃下以150 r/min 在搖床培養(yǎng)48 h 至細(xì)胞數(shù)為1.5×108個/mL左右，備用。

（4）發(fā)酵：糖化結(jié)束后，加入一定量的純凈水，同時按照原料質(zhì)量0.5 %的接種量接種酵母種子液，攪拌均勻后，放入生化培養(yǎng)箱中，在一定溫度下發(fā)酵3 d。

（5）后發(fā)酵：發(fā)酵結(jié)束后過濾酒液，放入冰箱在4 ℃低溫環(huán)境下繼續(xù)發(fā)酵15～30 d。

（6）過濾、澄清：后發(fā)酵結(jié)束，過濾掉殘余酒糟，得到澄清酒液。

（7）防腐、包裝、滅菌：向酒液中按0.4%的比例加入山梨酸鉀，攪拌均勻后進(jìn)行罐裝與巴氏滅菌。滅菌結(jié)束后迅速冷卻至室溫，靜置，得到改良米酒成品。

1.2.3 改良米酒工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

在進(jìn)行改良米酒工藝單因素實(shí)驗(yàn)前確定基礎(chǔ)工藝條件為：精米度70 %，酒曲選擇雅大酒曲，發(fā)酵溫度28 ℃，加水量為原料的200 %?？疾炀锥?、糖化發(fā)酵劑種類、發(fā)酵溫度、發(fā)酵加水量4 個工藝因素對米酒品質(zhì)的影響。實(shí)驗(yàn)中分別選用精米度為100%、90%、80%、70%、60%；安琪甜酒曲、蘇州蜂蜜曲、達(dá)州東柳植物曲、雅大酒曲等4 種糖化發(fā)酵劑；發(fā)酵溫度22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃；原料150 %、200 %、250 %、300 %、350 %的發(fā)酵加水量進(jìn)行單因素發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以葡萄糖、乙醇含量及感官品評得分為指標(biāo)，確定最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇精米度（A）、發(fā)酵溫度（B）及加水量（C）3 個因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以米酒感官品評得分（Y）為響應(yīng)指標(biāo)，確定改良米酒最佳工藝條件，因素及水平如表1所示。

表1 因素水平設(shè)計(jì)表

1.2.5 理化指標(biāo)的測定與感官評分

（1）葡萄糖、酒精含量的測定：利用生物氧化酶膜電化學(xué)傳感器對待測樣品葡萄糖含量、酒精含量進(jìn)行檢測。

（2）總糖的測定：酸水解后，用3，5-二硝基水楊酸測定總糖[4]。

（3）總酸的測定：參照GB/T 10345—2007 白酒分析方法。

（4）酒精度的測定：參照GB 5009.225—2016酒精計(jì)法。

（5）感官評分標(biāo)準(zhǔn)：選擇10 名食品專業(yè)人員，從米酒的色澤、香氣、口味和風(fēng)格4 個指標(biāo)進(jìn)行評定，滿分100 分，感官評分結(jié)果取平均值，評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 改良米酒感官評價(jià)表

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用Origin2021、Excel2020、Design-Expert8.0.6等軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，每個處理組進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 改良米酒單因素實(shí)驗(yàn)

精米度指“磨過之后的白米，占原本玄米（糙米）的比重”。精米的目的是盡可能保留淀粉多的心白，同時去除外層容易產(chǎn)生雜味的蛋白質(zhì)和脂肪。因此心白保留的程度，也就是精米度，對所釀清酒的品質(zhì)有很大的影響。由圖1（a）可知，乙醇含量隨著精米度的增加而顯著上升，感官得分和葡萄糖含量均在精米度為70 %時最高，乙醇含量最高時的精米度為100%，其葡萄糖含量和感官得分均為最低。沒有經(jīng)過精白的原米，保留了完整的蛋白質(zhì)和脂肪等，利于微生物的生長繁殖，葡萄糖利用充分，酒精發(fā)酵完全，所得產(chǎn)品更偏向傳統(tǒng)米酒，但酒液渾濁，香氣較雜，糖酸比不協(xié)調(diào)。精米度為70%時，酒體澄清透明，花果復(fù)合香舒適，酒精度適中，酸甜舒適，口感較協(xié)調(diào)。因此確定改良米酒的精米度為70%。

糖化發(fā)酵劑的作用是將糧食中的淀粉類物質(zhì)經(jīng)糖化、發(fā)酵等生化反應(yīng)轉(zhuǎn)化成乙醇，是釀酒發(fā)酵的動力，其質(zhì)量直接關(guān)系到酒的質(zhì)量和產(chǎn)量[5]。在米酒發(fā)酵中糖化發(fā)酵劑的選擇非常重要。如圖1（b）所示，不同種類的糖化發(fā)酵劑葡萄糖含量、乙醇含量及感官品評得分相差很大。感官得分最高的東柳植物曲葡萄糖含量和乙醇含量相對均勻，所得產(chǎn)品香氣舒適、甜中帶酸、口感協(xié)調(diào)，還帶有淡淡的植物香氣，雅大酒曲感官次之，葡萄糖含量低、乙醇含量略高，口感略酸澀；安琪酒曲酒體較淡薄，缺少特色；蘇州蜂蜜曲具有特別的蜂蜜清香，但風(fēng)格較為單一，酒香不突出。因此選定糖化發(fā)酵劑為東柳植物曲。

溫度是影響米酒發(fā)酵的重要因素，不同的發(fā)酵溫度會對酵母生長造成影響，同時影響原料活性物質(zhì)的溶出、營養(yǎng)成分及風(fēng)味物質(zhì)的保留[6]。如圖1（c）所示，溫度為22 ℃時葡萄糖含量最高，乙醇含量最低，二者相差也最大，感官品評時甜味明顯，酒味很淡；24 ℃時的米酒香氣較為淡薄，米酒味不突出；在28 ℃時米酒感官得分達(dá)到最高，此時葡萄糖含量與乙醇含量較為均衡，米酒香氣突出、香味明顯、口感適中。因此選定發(fā)酵溫度為28 ℃。

米酒中水的含量高達(dá)80 %以上，所以加水量在米酒發(fā)酵中至關(guān)重要，加水量過多或過少都會影響發(fā)酵進(jìn)程進(jìn)而影響米酒風(fēng)味。如圖1（d）所示，加水量最少時，葡萄糖含量最高，此時乙醇含量也相對較高，所得成品口味偏甜、酒體不協(xié)調(diào)；加水量最多時，葡萄糖含量最低，酒味淡薄，米酒風(fēng)味不明顯；加水量在250%感官得分最高。因此選定發(fā)酵加水量為原料的250%。

圖1 不同單因素對改良米酒的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與方差分析

通過Design-Expert8.0.6 軟件的分析，得到響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，如表3所示。

將表3 數(shù)據(jù)帶入Design-Expert8.0.6 軟件中，得到方差分析結(jié)果，如表4所示。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面方差及顯著性分析結(jié)果

利用Design-Expert8.0.6 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次擬合分析，建立感官品評（Y）和精米度（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵加水量（C）的回歸方程模型：Y=84.60-1.42A+0.51B-0.59C-1.15AB+1.00AC-0.18BC-4.31A2-5.14B2-4.29C2。

由表4 可知，回歸模型的P＜0.0001，說明回歸方程極顯著，能較好地模擬出真實(shí)曲面；通過F 值的大小，可知3 個因素對米酒改良工藝影響程度的大小依次為A＞C＞B；相關(guān)系數(shù)R2=0.9954，調(diào)整后的R2Adj=0.9895，二者差異＜0.2，代表該模型擬合度良好，誤差小；失擬項(xiàng)中F=0.35，P=0.7908，二者均大于0.01，差異不顯著，說明模擬性較好；表中P值反映了不同因素對感官評價(jià)不同程度的影響，P值越小，對感官評價(jià)影響程度越大[7-8]，在此模型中各因素對感官評價(jià)影響程度大小的次序?yàn)榘l(fā)酵溫度（B）＞發(fā)酵加水量（C）＞精米度（A），其中AB、AC、A2、B2、C2等項(xiàng)對感官品評的影響極顯著（P＜0.01），BC 等項(xiàng)對感官品評的影響不顯著（P＞0.05）；變異系數(shù)0.9789 %＜10 %，精密度為32.239＞4，表明該模型有較高的精密度，進(jìn)一步證明該模型對米酒改良工藝的預(yù)測具有較高的可信度。

表4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析

2.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)交互作用分析

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，響應(yīng)面圖的曲面越陡峭，兩兩因素的交互作用就越明顯，相反，響應(yīng)面圖的曲面越平緩，兩兩因素的交互作用就越不顯著。等高線呈圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形或馬鞍形則表示兩因素交互作用顯著[9]。

圖2 是各因素及其交互作用對改良米酒感官品評影響的響應(yīng)面圖，其中：a.精米度與發(fā)酵溫度的響應(yīng)曲面及等高線圖；b.精米度與發(fā)酵加水量的響應(yīng)曲面及等高線圖；c.發(fā)酵溫度與發(fā)酵加水量的響應(yīng)曲面及等高線圖。

根據(jù)圖2（a）可以看出，精米度一定時，感官品評得分隨著發(fā)酵溫度的增加先增后減；發(fā)酵溫度一定時，感官品評得分隨著精密度的增加先增后減；發(fā)酵溫度和精米度的交互作用顯著。發(fā)酵溫度對于改良米酒感官品評的影響相較于精米度更顯著。根據(jù)圖2（b）可以看出，精米度一定時，感官品評得分隨著發(fā)酵加水量的增加先增后減；發(fā)酵加水量一定時，感官品評得分隨著精米度的增加先增后減，發(fā)酵加水量和精米度的交互作用顯著。精米度對于改良米酒感官品評的影響較發(fā)酵加水量更顯著。根據(jù)圖2（c）可以看出，發(fā)酵溫度一定時，感官品評得分隨著發(fā)酵加水量的增加先增后減；發(fā)酵加水量一定時，感官品評得分隨著發(fā)酵溫度的增加先增后減，發(fā)酵加水量和發(fā)酵溫度的交互作用顯著。發(fā)酵溫度對于改良米酒感官品評的影響較發(fā)酵加水量更顯著。

圖2 各因素交互作用對改良米酒感官品評影響的響應(yīng)面圖

2.2.4 響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面軟件分析出最佳工藝條件：精米度68.2%，發(fā)酵加水量為糯米原料的245%，發(fā)酵溫度26.2 ℃。在此工藝條件下軟件預(yù)測得分為84.8分。采用相應(yīng)工藝參數(shù)，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得出的實(shí)際感官評分為89 分，與預(yù)測結(jié)果基本吻合。所得米酒總酸含量為2.23 g/L，總糖含量130.18 mg/mL，酒精含量為6.8%vol，符合T/GZSX017—2020 發(fā)酵型米酒理化要求。因此采用響應(yīng)面法優(yōu)化米酒工藝得到的工藝條件準(zhǔn)確可靠，可以用于實(shí)際操作。

2.3 香氣特征及滋味感官屬性分析

對實(shí)驗(yàn)制得的改良米酒與市售的同類產(chǎn)品進(jìn)行香氣特征和滋味比較研究。結(jié)果可見圖3，其中：a.改良米酒與米色米酒（對照品）的香氣特征得分雷達(dá)圖；b.改良米酒與米色米酒（對照品）的滋味品質(zhì)得分雷達(dá)圖。

品評人員主要通過米香、酒香、植物香、花果香、雜味、豐富度6 個屬性對改良米酒及其對照酒的香氣特征進(jìn)行描述。圖3（a）的雷達(dá)圖為改良米酒及其對照酒的香氣特征得分情況，2 種米酒之間有顯著性差異。對照酒沒有經(jīng)過精米工藝，保留有較濃郁的米香味，也保留了較多的雜味。改良米酒因?yàn)槭褂昧藮|柳植物曲和異常威克漢姆酵母FBKL2.00K8 而有明顯的花果香和植物香氣，香氣豐富度大于米色米酒。

圖3 改良米酒與米色米酒香氣特征和滋味感官屬性分析雷達(dá)圖

品評人員主要通過酸、甜、苦、澀4個屬性以及綜合評價(jià)對改良米酒及其對照酒的感官特征進(jìn)行描述[10]。圖3（b）的雷達(dá)圖為改良米酒及其對照酒的酸、甜、苦、澀屬性及綜合評分情況。米色米酒原料未經(jīng)精米處理，所得成品保留有較強(qiáng)的酸味、澀味及苦味，甜味比改良米酒低，綜合評分也較低。改良米酒因前發(fā)酵周期短，所得成品含糖量高，雖有甜膩感，但甜酸比協(xié)調(diào)，苦、澀味強(qiáng)度較低，綜合比較之下改良米酒評分高于米色米酒。

3 結(jié)論

米酒生產(chǎn)中工藝條件對成品質(zhì)量有很大影響。本實(shí)驗(yàn)以優(yōu)選貴州本土糯米為原料，采用日式清酒精米、低溫、開放式并行復(fù)發(fā)酵工藝，通過單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定米酒最佳發(fā)酵工藝條件為精米度68.2 %，發(fā)酵加水量為糯米原料的245 %，發(fā)酵溫度26.2 ℃。在此最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下，所得米酒總酸含量為2.23 g/L，總糖含量130.18 mg/mL,酒精含量為6.8%vol，符合T/GZSX017—2020 發(fā)酵型米酒理化要求。所得酒體清亮透明，帶有淡淡的植物香與花果香，有明顯的米酒香氣，酸甜適中，風(fēng)味協(xié)調(diào)。希望優(yōu)化改良后的米酒工藝可以為傳統(tǒng)的米酒釀造生產(chǎn)提供新的思路。