高效液相色譜法測(cè)定披針葉黃花中黃酮含量

劉明地，劉繼超，李學(xué)翠，王秋紅，宋 萍,2,3

(1.青海民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，青海西寧 810007；2.青藏高原資源化學(xué)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧 810007;3.青海資源化學(xué)研究所，青海西寧810007）

披針葉黃花(T.1anceolata R.Br.)又名牧馬豆、野決明，系豆科(Leguminoseae)野決明屬(Thermopsis)多年生草本植物，分布于中國(guó)東北、華北及西北廣大地區(qū)。喜生于濕潤(rùn)的丘陵、草原和沙地，也見(jiàn)于河岸及礫質(zhì)戈壁。披針葉黃花葉量大；粗蛋白質(zhì)含量高，據(jù)青海畜牧科學(xué)院分析，開(kāi)花期最高達(dá)27.93%，結(jié)果期也有15.41%[1]。披針葉黃花全株有去痰止咳、止痛、止血之功效，可為藥用[1]。

黃酮類化合物（flavonoids），原是指以2-苯基色原酮為骨架衍生的一類化合物的總稱,現(xiàn)泛指兩個(gè)苯環(huán)通過(guò)三個(gè)碳原子相互連接而成的一系列化合物，即具有C6-C3-C6結(jié)構(gòu)的一類化合物的總稱。黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、保護(hù)心血管、降壓、抗菌、抗病毒和抗腫瘤等多種生物活性和藥理作用，是廣泛存在于植物界的一大類天然產(chǎn)物[2-3]。黃酮類化合物以其廣譜的藥理作用倍受青睞，目前國(guó)際上對(duì)黃酮類化合物的研究開(kāi)發(fā)十分活躍，為黃酮類化合物在醫(yī)藥、保健食品、化妝品等方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)[4]。其中對(duì)黃酮提取工藝的研究是一個(gè)重要的內(nèi)容。黃酮的提取方法有：熱水提取法[5-6]、堿性水或堿性稀醇提取法[7-8]、微波輔助萃取[9-11]、超聲波輔助萃取[10，12]、酶解法[11，13-14]、大孔樹(shù)脂吸附法[11-13]、超濾法[11，13-14]、超臨界流體萃取法[10-11，13-14]、有機(jī)溶劑提取法[10-13]等。其中有機(jī)溶劑提取法是國(guó)內(nèi)外使用最廣泛的方法，主要用于提取脂溶性基團(tuán)占優(yōu)勢(shì)的黃酮類物質(zhì)。有機(jī)溶劑主要用乙醇、甲醇、乙酸乙酯、乙醚等，最常使用的是乙醇，即醇提法。該法對(duì)設(shè)備要求簡(jiǎn)單，產(chǎn)品得率高。此外黃酮含量的測(cè)定是一個(gè)重要的內(nèi)容，黃酮的含量測(cè)定成為研究的關(guān)鍵步驟。而披針葉黃花作為豆科植物其黃酮含量相對(duì)較高，藥用價(jià)值大。本實(shí)驗(yàn)以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法選出最佳提取條件，用高效液相色譜法測(cè)定披針葉黃花中黃酮含量。

1 樣品與試劑

1.1 樣品與試劑

披針葉黃花（自采，陰干粉碎）；無(wú)水乙醇（分析純，≥99.7%，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；甲醇（色譜純，≥99.99%，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；乙腈（色譜純，≥99.9%，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；磷酸（分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（固體UV≥98%，上海源業(yè)生物科技有限公司）。

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀（Agilent Technologies12608）；分析天平（XS-125，濟(jì)南歐威騰生物科技）；超聲波清洗器（DL-360A，上海之信儀器有限公司）；高速中藥粉碎機(jī)（XFB-400，吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠）。

2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.1.1 蘆丁儲(chǔ)備液的配制

準(zhǔn)確稱取15.00 mg 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇（色譜級(jí)）溶解并定容于100 mL的容量瓶中，配制成濃度為0.15 g/L的儲(chǔ)備液，混勻，備用。

2.1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的配制

分別移取0.1、0.2、0.5、0.7、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 儲(chǔ)備液，用甲醇定容至10 mL 的容量瓶中，經(jīng)孔徑為0.45 μm 有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾（針頭式的有機(jī)膜配合一次性注射器過(guò)濾，將標(biāo)準(zhǔn)溶液吸入帶有針頭式有機(jī)膜的注射器內(nèi)，推注射器進(jìn)行過(guò)濾），備用。蘆丁儲(chǔ)備液、0.03 g/L、0.045 g/L 和0.09 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)液在360 nm下的高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜圖

2.1.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液5 μL，采用C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈∶0.4 %磷酸水溶液=20∶80 進(jìn)行等度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，檢測(cè)時(shí)間為15 min。以峰面積為縱坐標(biāo)（y），濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如圖2。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 最優(yōu)提取條件的選擇

2.2.1 不同提取方法的考察

2.2.1.1 超聲法

稱取披針葉黃花2.0000 g，于錐形瓶中加入100 mL濃度為80%的乙醇，搖勻，超聲處理（功率360 W，頻率40 kHz）2 h，冷卻至室溫，搖勻，抽濾并收集濾液，經(jīng)高效液相色譜儀測(cè)定得到該濾液的色譜圖（見(jiàn)圖3a），計(jì)算濃度。

2.2.1.2 索氏法

稱取披針葉黃花2.0000 g，裝入備好的濾紙筒中，置于索氏提取器中，加入100 mL 濃度為80%的乙醇，85 ℃水浴加熱，提取2 h，冷卻至室溫，搖勻，抽濾并收集濾液備用，用高效液相色譜儀測(cè)定得到該濾液的色譜圖（圖3b），計(jì)算濃度。

2.2.1.3 熱回流法

稱取披針葉黃花2.0000 g，置于圓底燒瓶中，加入100 mL 濃度為80%的乙醇，85 ℃水浴加熱，熱回流2 h，冷卻至室溫，搖勻，抽濾，用高效液相色譜儀測(cè)定該濾液的色譜圖（圖3c），計(jì)算濃度。

圖3 不同提取方法提取液的高效液相色譜圖

比較三種提取方法提取液的高效液相色譜圖峰面積可知：熱回流法（57.2 mAU·s）＞索氏提取法（47.0 mAU·s）＞超聲提取法（37.4 mAU·s）。熱回流提取的峰面積最大，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線得熱回流提取液中黃酮的含量最多。故熱回流法提取效果最好，因此本實(shí)驗(yàn)選用熱回流法提取。

2.2.2 溶劑濃度的考察

分別用100 mL 50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇熱回流提取2 h，收集提取液，用高效液相色譜法測(cè)得樣品的峰面積，考察溶劑濃度對(duì)提取效果的影響，如圖4 所示。由圖可知，乙醇濃度為60%的提取液的峰面積最大，提取效果最佳；50%的乙醇次之，隨后為70%的乙醇，濃度為90%的乙醇提取效果最差。故以50%、60%、70%的乙醇作為考察溶劑的濃度三個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 正交試驗(yàn)

以A（浸泡時(shí)間）、B（提取時(shí)間）、C（溶劑體積）、D（乙醇濃度）等4 個(gè)對(duì)提取效果影響較大的因素作為主要影響成分，以提取液黃酮含量為考察指標(biāo)，研究披針葉黃花中提取黃酮的最優(yōu)條件，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)見(jiàn)表1。

表1 披針葉黃花提取黃酮的正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

由表1中極差R判斷出各個(gè)因素對(duì)披針葉黃花中提取黃酮提取率的影響順序?yàn)椋篊＞A＞B＞D，也就是說(shuō)用乙醇回流法從披針葉黃花中提取黃酮，溶劑體積對(duì)黃酮提取率的影響最為明顯，其次是浸泡時(shí)間，隨后是提取時(shí)間，而溶劑濃度的影響最小。再比較K值可知：最優(yōu)提取條件為：A1B3C3D1，即最佳工藝條件為浸泡0 h，回流時(shí)間3 h，，溶劑體積130 mL，乙醇濃度50%。

2.3 藥材披針葉黃花中黃酮含量的測(cè)定

取披針葉黃花2.0000 g，置于燒瓶中加入130 mL濃度為60%的乙醇，85 ℃水浴加熱3 h，放冷，搖勻，進(jìn)行抽濾。在360 nm 的波長(zhǎng)下測(cè)定其峰面積，高效液相色譜圖見(jiàn)圖5。代入標(biāo)準(zhǔn)回歸方程可得濃度，經(jīng)計(jì)算后得到披針葉黃花原藥材中總黃酮含量。上述溶液的峰面積值為125.3 mAU·s，對(duì)應(yīng)的濃度為0.0417 g/L，則2.0000 g 披針葉黃花中含有5.4210 mg的黃酮。

圖5 最優(yōu)提取工藝下提取液的高效液相色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

在樣品的基質(zhì)中添加蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，是來(lái)驗(yàn)證分析方法可靠性和精密度重要的手段。本研究采用在混勻的披針葉黃花提取液中定量的添加5 個(gè)不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)5 次平行提取、測(cè)定，計(jì)算回收率。表4列出了在披針葉黃花中添加的5個(gè)標(biāo)樣的回收率。

由表2 結(jié)果可得，樣品的平均回收率為99.20%，RSD為1.09%，所以采用液相色譜紫外檢測(cè)器測(cè)定黃酮結(jié)果可靠。

表2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝5）

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，按上述高效液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得峰面積分別為141.8、137.9、138.1、139.9、137.8、137.8 mAU·s，RSD=0.0115%，表明精密性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一披針葉黃花提取液在相同色譜條件下，于0，1，2，3，4，5，6 h進(jìn)樣測(cè)定，得面積分別為71.9、73.5、71.5、73.4、71.9、73.5 mAU·s，RSD=0.0130%（n=6），表明提取液在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 結(jié)論

披針葉黃花資源豐富，全株入藥，能祛痰、止咳、有興奮呼吸、升高血壓的功效，主治祛痰止咳。作為黃酮類化合物因具有抗氧化、降糖降脂、保肝等生物學(xué)功效而在糖尿病、非酒精性脂肪肝、肥胖等慢性非傳染性疾病防治中備受關(guān)注[15]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)提取方法考察實(shí)驗(yàn)選出最佳提取方法為熱回流法，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)確定最佳提取工藝條件為浸泡0 h，回流時(shí)間3 h，溶劑體積130 mL，乙醇濃度50%。采用C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈∶0.4%磷酸水溶液＝20∶80 進(jìn)行等度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，測(cè)定2.0000 g 披針葉黃花中含有5.4210 mg 的黃酮。目標(biāo)色譜峰分離效果良好、精密度穩(wěn)定性和回收率均符合要求。為后續(xù)研究披針葉黃花中總黃酮的含量提供依據(jù)。本研究建立的黃酮類成分含量測(cè)定方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，適用于所有樣品的含量測(cè)定。

由于時(shí)間和條件的限制，本課題還有一些問(wèn)題需要進(jìn)一步研究。如還需進(jìn)一步考察其它提取方法、提取次數(shù)、提取溫度等因素對(duì)披針葉黃花中黃酮提取的影響，以及其他流動(dòng)相的洗脫效果。