陽離子脂質(zhì)體在基因治療中的研究進(jìn)展

汪瓊卉,劉哲鵬，李北雪

上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院（上海，200093）

0 引言

過去的三十年里，基因治療作為一種具有潛力的治療方法已經(jīng)獲得了極大的關(guān)注。它不僅可以用于治療遺傳性疾病，而且可以用于治療和預(yù)防各種獲得性疾病如癌癥、囊性纖維化、艾滋病等［1］。在基因治療中，不同類型的反義寡核苷酸進(jìn)入細(xì)胞主要依靠?jī)?nèi)吞機(jī)制，但帶高負(fù)電荷的主鏈極大地限制了它們與細(xì)胞的相互作用和靶向細(xì)胞的轉(zhuǎn)染［2］。目前，用非病毒載體遞送核酸分子已成為基因治療的公認(rèn)策略。其中，陽離子脂質(zhì)體因其制備簡(jiǎn)單、具有可重復(fù)性以及生物可降解性等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于臨床診斷和基因治療［3］。

1 陽離子脂質(zhì)體組成成分

陽離子脂質(zhì)體主要由陽離子類脂組成。類脂不僅可以單獨(dú)組成脂質(zhì)體，也可以和其他輔助類脂一起構(gòu)成脂質(zhì)體。常用的陽離子類脂由三部分組成，包括親水頭基、疏水尾基以及兩者之間的連接鍵［3］。

1.1 親水頭基

帶正電的親水頭基負(fù)責(zé)脂質(zhì)體與核苷酸、細(xì)胞膜或細(xì)胞其他成分之間的相互作用，對(duì)基因傳遞起著至關(guān)重要的作用。不同類型的頭基可分為：季銨、胺、氨基酸或多肽、胍、雜環(huán)頭基和一些特殊的頭基。

近年來，陽離子脂質(zhì)體研究的另一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)是將一些基團(tuán)如甘露糖、半乳糖或熒光基團(tuán)結(jié)合到陽離子脂質(zhì)的頭基結(jié)構(gòu)域中，從而提高體外和體內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率。除此之外，一些與生物體內(nèi)某些分子結(jié)構(gòu)相似的陽離子脂質(zhì)( 如心磷脂和磷酰胺衍生物等) 具有較低的細(xì)胞毒性和較高的轉(zhuǎn)染效率，這為陽離子脂質(zhì)體適用于人類基因治療的發(fā)展提供了一個(gè)樂觀的前景［4］。

1.2 疏水尾基

疏水尾基主要分為兩類，分別是膽固醇環(huán)衍生物和脂肪酰鏈衍生物。輔助脂質(zhì)一般為中性脂質(zhì)，主要包括DOPE(1，2- 二油酸甘油- 3- 磷脂酰乙醇胺)、PC(1，2- 二?；视? 磷脂酰膽堿)、DOPC(1，2- 二油酸甘油-3- 磷脂酰膽堿)、DPPC(1，2- 二 棕 櫚 酸 甘 油- 3- 磷 脂 酰 膽 堿)、Chol( 膽固醇) 等。它們能夠穩(wěn)定脂質(zhì)雙層膜和降低陽離子脂質(zhì)毒性［5］。

1.3 連接鍵

頭基和尾基的連接鍵是陽離子脂質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定性和生物降解性的重要決定因素，并進(jìn)一步控制其轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性。根據(jù)連接鍵的結(jié)構(gòu)，它們可以分為許多類型，如醚類、酯類、酰胺類、二硫化類、尿素類、?；觐?、磷酸鹽類及其他特殊類型。醚類是最早使用的連接鍵，一般情況下帶醚類連接鍵的陽離子脂質(zhì)體可以獲得較高的轉(zhuǎn)染效率，但醚類連接鍵具有化學(xué)穩(wěn)定性和不可生物降解性，從而導(dǎo)致較高的細(xì)胞毒性。與醚類連接鍵相比，具有生物可降解性的酯類摻入陽離子脂類可以增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的代謝或清除脂質(zhì)，從而避免非天然脂質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期存在并產(chǎn)生的不良后果。

研究者在進(jìn)行設(shè)計(jì)時(shí)，應(yīng)充分考慮連接鍵的長(zhǎng)度、類型、位置等因素，這對(duì)合理設(shè)計(jì)高轉(zhuǎn)染效率、低細(xì)胞毒性的新型陽離子脂質(zhì)具有重要意義［6］。

2 制備方法

傳統(tǒng)的陽離子脂質(zhì)體制備方法有薄膜分散法、擠出法、逆相蒸發(fā)法、鈣融合法和凍融法等。但這些方法在制備過程中存在有機(jī)溶劑或表面活性劑的殘留，會(huì)對(duì)陽離子脂質(zhì)體產(chǎn)生影響，而且不易控制粒徑以及均勻化程度，從而使得這些技術(shù)很難應(yīng)用的大規(guī)模制備陽離子脂質(zhì)體中。

目前，新型制備方法包括改進(jìn)的乙醇注入法、薄膜-凍融法、高壓均質(zhì)法、二氧化碳超臨界法、真空干燥- 超聲法、薄膜- 擠出法、薄膜- 凍干法和微流控技術(shù)等［7］。它們均有各自的優(yōu)點(diǎn)，如采用高壓均質(zhì)法可使脂質(zhì)體均勻化、微?；?，并且能更簡(jiǎn)化地制備出不同粒徑的脂質(zhì)體，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。二氧化碳超臨界法以二氧化碳為溶劑，具有環(huán)保、無毒和安全性。薄膜-擠出法可制備出粒徑較小且均勻的單層陽離子脂質(zhì)體。真空干燥超聲法可在制備過程中除去有機(jī)溶劑等［8］。

此外，制備方法會(huì)影響陽離子脂質(zhì)體在體內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性。Luca 等［9］分別通過自組裝和微流控技術(shù)用DC-Chol 和DOPE 制備載pDNA的陽離子脂質(zhì)體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自組裝的陽離子脂質(zhì)體內(nèi)部呈多層體系，在結(jié)構(gòu)上比微流控制備所得的脂復(fù)合物更穩(wěn)定，使其在溶酶體中的降解效率變低，從而轉(zhuǎn)染效率更高，而且自組裝生成的脂復(fù)合物數(shù)量更少，不易在細(xì)胞內(nèi)殘留造成細(xì)胞毒性。而微流控技術(shù)制備的陽離子脂質(zhì)體內(nèi)部呈單層體系，生成的脂復(fù)合物較多，易在細(xì)胞內(nèi)殘留造成細(xì)胞毒性。

3 轉(zhuǎn)染機(jī)制

作為一種基因載體，陽離子脂質(zhì)體與攜帶負(fù)電荷的目的基因序列通過靜電作用相互吸引結(jié)合，其轉(zhuǎn)染過程主要是通過膜融合或細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，脂質(zhì)復(fù)合物在細(xì)胞質(zhì)中或進(jìn)一步進(jìn)入核內(nèi)釋放基因，從而完成細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯［10］。

除了受陽離子脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)以及被測(cè)量的生物反應(yīng)類型的影響，陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率也可能受被遞送的基因的影響。如質(zhì)粒DNA（pDNA）比線性DNA 更有效地傳遞到細(xì)胞中，因?yàn)閜DNA與線性DNA 相比會(huì)產(chǎn)生更低的有效負(fù)電荷，因此需要更低量的陽離子脂質(zhì)。

4 陽離子脂質(zhì)體在不同核酸遞送中的應(yīng)用

由于基因治療中包括pDNA、mRNA、siRNA、microRNA 和其他類型的反義寡核苷酸進(jìn)入細(xì)胞主要通過內(nèi)吞機(jī)制，但它們帶高負(fù)電荷的主鏈極大地限制了它們與細(xì)胞的相互作用和靶向細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，所以通過陽離子脂質(zhì)體將其運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核或胞質(zhì)溶膠可達(dá)到治療目的。

4.1 載pDNA 的陽離子脂質(zhì)體

pDNA 作為生物藥劑的研究備受關(guān)注，因其安全穩(wěn)定、對(duì)多種外源基因的容納量大、易生產(chǎn)而且不會(huì)直接引起人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生不良反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，故可將其作為基因治療的載體［11］。但其傳遞過程也面臨一些挑戰(zhàn)，如實(shí)現(xiàn)高負(fù)載能力和避免因pDNA 的高負(fù)電荷和高分子量而聚集。更重要的是，與mRNA 不同，pDNA 需要到達(dá)細(xì)胞核而不僅僅是到達(dá)細(xì)胞質(zhì)來進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯。

在陽離子脂質(zhì)體制備中選擇具有生物相容性的氨基酸作為脂質(zhì)材料是常用的方法，且選擇含有DOPE 的陽離子脂質(zhì)體可以改善pDNA 在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。María 等［12］在研究中，將一種賴氨酸衍生物連接到C12 鏈上組成的陽離子脂質(zhì)（LYCl）與輔助脂質(zhì)（DOPE）結(jié)合制備而成的陽離子脂質(zhì)體，可作為一種潛在的載體將兩種pDNA（編碼綠色熒光蛋白GFP 和熒光素酶）轉(zhuǎn)染到COS-7 細(xì)胞。結(jié)果表明，LYCl/DOPE 陽離子脂質(zhì)體平均粒徑為200 nm 左右，且形成的多分散指數(shù)低的溶致液晶相有效壓縮了pDNA，并防止DNA 酶使其降解，從而促進(jìn)了細(xì)胞攝取過程。此結(jié)果證實(shí)了LYCl/DOPE 脂質(zhì)雙層是穩(wěn)定的，并且能夠穩(wěn)定DNA片段。María 等研究出的最佳配方（LYCl 含量為20%）能夠有效地完成轉(zhuǎn)染過程，且細(xì)胞存活率高。

4.2 載mRNA 的陽離子脂質(zhì)體

信使RNA(mRNA) 是基因的天然產(chǎn)物，在細(xì)胞內(nèi)的主要任務(wù)是攜帶遺傳信息并作為蛋白質(zhì)合成的直接模板。目前，關(guān)于mRNA 的臨床工作主要集中在疫苗接種、蛋白質(zhì)替代療法和遺傳疾病的治療上［13］。然而，由于需要改進(jìn)其遞送方式，mRNA 的應(yīng)用仍然受到限制。

Zhang 等［14］用DOTAP: Chol（1:1）制備陽離子脂質(zhì)體(CLPP/ mSur-T34A)，用于在體外和體內(nèi)C26 結(jié)腸癌模型中遞送編碼survivinT34A 的mRNA。結(jié)果顯示，制備的CLPP/mSur-T34A 平均粒徑為（186.1±3.1）nm，且通過內(nèi)吞作用在C26 腫瘤細(xì)胞上表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)染效率。CLPP/mSur-T34A mRNA 的表達(dá)對(duì)C26 結(jié)腸癌模型在體內(nèi)外均有明顯的治療作用，并進(jìn)一步表明CLPP/mSur-T34A mRNA 的表達(dá)是結(jié)腸癌治療的潛在候選基因。

4.3 載siRNA 的陽離子脂質(zhì)體

siRNA 即小干擾RNA，它能夠抑制引起病毒感染和癌癥的特定基因，具有作為治療工具的潛力。與pDNA 相比，siRNA 分子量更低，僅由20～30 個(gè)堿基對(duì)組成，且不需要輸送到細(xì)胞核發(fā)揮作用。而且siRNA 比microRNA 更具特異性。然而，siRNA 在應(yīng)用中仍然存在許多挑戰(zhàn)，包括脫靶效應(yīng)、給藥困難、免疫反應(yīng)和細(xì)胞毒性等［13］。

近年來，關(guān)于陽離子脂質(zhì)體傳遞siRNA 的研究集中在賦形劑和表面性質(zhì)對(duì)其在細(xì)胞內(nèi)傳遞效率的影響。陽離子脂質(zhì)如（2,3-二油?；?丙基）-三甲基銨- 氯鹽（DOTAP）、1,2- 二油?；?3-二甲基銨 - 丙烷（DODAP）、1,2- 二油醇-3 －二甲基氨基- 丙烷（DODMA）、1,2- 雙十八烯氧基-3- 甲基銨丙烷（DOTMA）與DOPE/ 膽固醇/PEG 等以不同的摩爾比組成的陽離子脂質(zhì)體常用于siRNA 的傳遞。另一種常用的配方是DCChol 和DOPE 以1:1 的摩爾比合成［2］。目前，多種基于siRNA 藥物制劑的陽離子脂質(zhì)體正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，其中應(yīng)用最廣泛的是穩(wěn)定的核酸顆粒（SNALPs），其組分包括陽離子脂類、融合脂類、膽固醇和聚乙二醇（PEG）［16］。

雖然帶正電的陽離子脂質(zhì)體有利于跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，但也會(huì)與血液中的蛋白質(zhì)相互作用，因此，當(dāng)接觸到血清時(shí)，陽離子脂質(zhì)體會(huì)迅速從循環(huán)系統(tǒng)中被清除并立即釋放siRNA。此外，陽離子脂類具有細(xì)胞毒性，如破壞細(xì)胞膜以及產(chǎn)生活性氧［17］。為了提高siRNA 的轉(zhuǎn)染效率和降低細(xì)胞毒性，除了選擇載體的組成成分之外，在陽離子脂質(zhì)體上附加材料以提高穩(wěn)定性也是一種廣泛應(yīng)用的策略，常用的附加材料包括聚乙二醇（PEG）、透明質(zhì)酸（HA）、親水性肽等［18］。

4.4 載microRNA 的陽離子脂質(zhì)體

microRNA (miR) 在動(dòng)植物中主要參與轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)調(diào)控。通過合成陽離子脂質(zhì)體遞送miR，可抑制mRNA 的翻譯，并調(diào)節(jié)其他功能基因，從而表現(xiàn)出其治療潛力。

研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF-A）與甲狀腺癌的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)相關(guān)，且VEGF-A 是控制腫瘤血管生成的重要因素之一［16］。Maroof 等［19］制備了 DOTAP/Chol/DOPE 脂質(zhì)體，通過靜脈注射向甲狀腺癌部位遞送了miR-34b-5p，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)和體外均抑制VEGF-A 的表達(dá)。

徐楓等［20］研究了靶向陽離子脂質(zhì)體（CLPs）遞送miR 對(duì)三陰性乳腺癌(TNBC) 相關(guān)特異性抑瘤基因的作用。通過薄膜分散法制備CLPs 并對(duì)其進(jìn)行表面HA 靶向修飾，制備了新型透明質(zhì)酸（HA）CLP。經(jīng)過共聚焦檢測(cè)和流式細(xì)胞術(shù)熒光檢測(cè), 驗(yàn)證了HA-CLPs 能夠順利將miR-205 運(yùn)送至細(xì)胞內(nèi)而且分布在細(xì)胞核附近, 證明了HA-CLPs 對(duì)TNBC 細(xì)胞具有較強(qiáng)的靶向特異性,且對(duì)TNBC 細(xì)胞的增殖和遷移起到了一定的抑制作用。

5 影響陽離子脂質(zhì)體遞送的因素

由于陽離子脂質(zhì)體受理化性質(zhì)和人體生理環(huán)境的影響，在基因治療的臨床應(yīng)用中仍存在著阻礙。

5.1 生理環(huán)境

人體內(nèi)環(huán)境相對(duì)復(fù)雜，比如細(xì)胞外屏障中調(diào)理素作用、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的快速清除作用以及腫瘤穿透性差，細(xì)胞內(nèi)屏障包括內(nèi)體/溶酶體的運(yùn)輸網(wǎng)絡(luò)和核內(nèi)擴(kuò)散受限，阻礙負(fù)載外源基因的陽離子脂質(zhì)體到達(dá)靶向部位。通過改變脂質(zhì)材料和增加表面修飾如PEG 修飾劑可改變陽離子脂質(zhì)體的特性，從而實(shí)現(xiàn)核酸的有效遞送并達(dá)到治療效果［19］。

5.2 理化性質(zhì)

陽離子脂質(zhì)體在體內(nèi)分布情況不僅受生理環(huán)境的影響，還受其理化性質(zhì)的影響，而理化性質(zhì)主要由脂質(zhì)組成決定。其中，陽離子脂質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和中性輔助脂質(zhì)融合的能力對(duì)調(diào)控轉(zhuǎn)染效率非常重要。同時(shí)，轉(zhuǎn)染效率與陽離子脂質(zhì)體的粒徑和表面電荷相關(guān)，而這兩者都受脂質(zhì)組成的影響［20］。

6 展望

陽離子脂質(zhì)體因其良好的靶向性、生物相容性以及能夠大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，是目前研究最多的非病毒載體。其正電荷雖有利于與體內(nèi)細(xì)胞融合，但也不可避免地增加了體內(nèi)的免疫原性和毒性［21］。因此，關(guān)于陽離子脂質(zhì)體在基因治療方面的臨床應(yīng)用需要研究者關(guān)注陽離子脂質(zhì)體在基因傳遞中存在的屏障及其理化性質(zhì)對(duì)治療結(jié)果的影響，從而保證高轉(zhuǎn)染效率，并獲得良好的藥效學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)特性以滿足臨床需要。陽離子脂質(zhì)體的創(chuàng)新與發(fā)展，將為人類提供更多的治療選擇。