不同比例酸棗仁-茯苓水提物對大鼠焦慮樣行為的影響

陳絮蒙，田 星，郭亦杰，尹瓏樺，唐志平，曾 嶸

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長沙 410208）

隨著經(jīng)濟(jì)社會的高速發(fā)展，心理健康已成為倍受關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。發(fā)作性或持續(xù)性的緊張、焦慮等情緒是常見的心理亞健康狀態(tài)[1-3]。長期對負(fù)性情緒消極適應(yīng)而不及時調(diào)整，則可能逐步演變成焦慮癥等精神官能癥，嚴(yán)重危害患者身心健康[4-6]。目前，焦慮癥的防治及發(fā)病機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)。因此，抗焦慮功能食品的研發(fā)具有較高的社會價值。

酸棗仁為鼠李科落葉灌木或小喬木植物酸棗的干燥成熟種子，可養(yǎng)血寧神、安五臟。茯苓為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，常用于心脾兩虛、寧心安神[7]。兩者皆為藥食同源之材，且沒有特殊異味，開發(fā)功能食品的安全性及可行性較高。以酸棗仁、茯苓為主要成分的安神方劑最早出現(xiàn)于《金匱要略》記載中的酸棗仁湯[8]?，F(xiàn)代各家對此方進(jìn)行修改，廣泛用于焦慮癥、抑郁癥等情志病，稱酸棗仁湯加減方[8]。王艷等[9]建立酸棗仁湯數(shù)據(jù)庫，遴選酸棗仁湯共218方，統(tǒng)計酸棗仁湯中藥物出現(xiàn)頻次。結(jié)果顯示酸棗仁、茯苓在酸棗仁湯中使用頻次占比分別為100%、84.6%，提示該方核心組成即酸棗仁及茯苓。

酸棗仁及茯苓長期以來作為寧心安神的保健食品一直被廣泛研究應(yīng)用[10-13]。各國學(xué)者從酸棗仁中提取鑒別出的化學(xué)成分已有一百三十余種，主要為三萜類、皂苷類、黃酮類化合物[14]，多用于開發(fā)助眠安神類產(chǎn)品[15]。而茯苓中主要化學(xué)成分為多糖類和三萜酸類化合物，可通過抗炎、保肝、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用，用于多種疾病的治療和保健[16]。目前，基于抗焦慮作用的酸棗仁-茯苓復(fù)配比例優(yōu)化研究鮮有報道。本研究將酸棗仁-茯苓以不同比例混合并提取有效成分，通過慢性束縛加孤養(yǎng)方法建立大鼠焦慮癥模型，評價不同比例酸棗仁-茯苓水提物對焦慮模型大鼠形態(tài)、體質(zhì)量及行為學(xué)的改善作用，同時探討其抗焦慮機(jī)制是否涉及炎癥反應(yīng)，以期為進(jìn)一步開發(fā)藥食同源抗焦慮功能食品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗仁、茯苓 藥材購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)曾嶸教授鑒定符合2020年版《中華人民共和國藥典》相關(guān)規(guī)定；鹽酸帕羅西汀 中美天津史克制藥有限公司；大鼠腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-6 （Interleukin-6，IL-6）、酶聯(lián)免疫吸附測定法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光實(shí)時定量PCR試劑盒 大連寶生物生物工程技術(shù)公司；TNF-α、IL-1β、IL-6熒光實(shí)時定量PCR引物 廣州銳博生物技術(shù)有限公司，序列如表1；SPF級雄性SD大鼠 體質(zhì)量220～240 g，64只，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，生產(chǎn)證號為SCXK（湘）2021-004。本試驗(yàn)通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會審查，在研究過程中遵循《實(shí)驗(yàn)動物管理條例》進(jìn)行試驗(yàn)研究。

表1 熒光實(shí)時定量PCR引物序列Table 1 Primer sequence of real-time PCR

DLX-880型酶聯(lián)免疫儀 美國BIO-TEK公司；7300 Real time PCR system 美國Applied Biosystem公司；PCR儀 德國Biometra公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酸棗仁-茯苓水提物制備 酸棗仁、茯苓或酸棗仁-茯苓（按質(zhì)量比1:1、2:1、3:1比例混合均勻且總質(zhì)量相等），分別加10倍質(zhì)量水煮沸，后保沸提取2 h。過濾后將剩余藥材繼續(xù)加8倍水質(zhì)量煮沸，后保沸提取1 h。過濾后將2次所得的濾液合并，濃縮至提取液含對應(yīng)生藥量1 g/mL。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動物組別設(shè)計、造模及給藥 SD大鼠隨機(jī)分成8組，恒溫恒濕環(huán)境適應(yīng)性喂養(yǎng)一周并在期間觀察其綜合情況（飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22±4 ℃、相對濕度50%～70%、日光照時長12 h）。8組分別為：正常對照組、模型組、帕羅西汀組、酸棗仁組、茯苓組、酸棗仁-茯苓1:1組、酸棗仁-茯苓2:1組、酸棗仁-茯苓3:1組，每組8只，每只體重在230±10 g之間。正常對照組不做任何處理，其余7組采用慢性束縛加孤養(yǎng)方法建模[17-18]，每日束縛6 h，連續(xù)進(jìn)行28 d，一鼠一籠單獨(dú)飼養(yǎng)。期間每天對大鼠的基本形態(tài)進(jìn)行觀察并每7天測量一次體質(zhì)量。

造模7 d后，分別給予生理鹽水、帕羅西?。?.8 mg/kg·d）、酸棗仁提取物（含酸棗仁生藥量2 g/kg·d）、茯苓提取物（含茯苓生藥量2 g/kg·d）、酸棗仁-茯苓1:1提取物（含酸棗仁、茯苓生藥量共2 g/kg·d，兩者比例為1:1）、酸棗仁-茯苓2:1提取物（含酸棗仁、茯苓生藥量共2 g/kg·d，兩者比例為2:1）、酸棗仁-茯苓3:1提取物（含酸棗仁、茯苓生藥量共2 g/kg·d，兩者比例為3:1），灌胃給藥處理21 d。正常對照組不做任何處理。

造模第28 d對各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)評價，組間交叉進(jìn)行。所有動物均提前3 h進(jìn)入行為學(xué)測試室適應(yīng)環(huán)境；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后麻醉大鼠，心臟灌流后頸動脈插管取血，3000 g離心l0 min取上清，分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?；處死大鼠后于冰上分離海馬及杏仁核。加入液氮研碎后另加入1 mL Trizol，常溫靜置5 min后吹打。加入0.2倍Trizol體積的氯仿，劇烈震蕩后室靜置10 min。12000 g離心l5 min，取上清。加入與吸出上清同體積的氯仿，劇烈震蕩后室溫靜置10 min。12000 g離心l0 min后去上清。加入1 mL 75%酒精，劇烈震蕩漂洗沉淀。7500 g離心 5 min后去上清。加入1 mL 100%酒精，劇烈震蕩漂洗沉淀。7500 g離心5 min后去上清。室溫15～20 min自然風(fēng)干。加入DEPC水溶解RNA沉淀，提取組織總mRNA，-80 ℃保存?zhèn)溆茫患尤胍旱兴楹蠹尤?0 μL細(xì)胞裂解液RIPA（含1 %蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟），靜置30 min；超聲裂解后，12000 g離心20 min 取上清，提取組織總蛋白，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 動物行為學(xué)評價

1.2.3.1 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn) 高架十字迷宮包括閉合臂和開放臂各兩條。每條臂長50 cm、寬10 cm，閉合臂和開放臂交匯平臺寬10 cm×10 cm。開放臂的邊緣高1 cm，閉合臂的邊緣高40 cm。設(shè)備距地面50 cm高，臺面為黑色。

將大鼠從中央?yún)^(qū)面向閉合臂放入迷宮，記錄大鼠5 min內(nèi)在迷宮內(nèi)活動的情況。觀察指標(biāo)：進(jìn)入閉合臂次數(shù)、進(jìn)入開放臂次數(shù)、閉合臂停留時間、開放臂停留時間。計算大鼠總穿臂次數(shù)、進(jìn)入開臂的次數(shù)比例和在開臂停留時間比例。每只大鼠測定完成后徹底清潔，避免氣味殘留，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3.2 曠場實(shí)驗(yàn) 使用100 cm×100 cm×50 cm大小的立方體敞箱，四周及箱底為黑色，用白線劃分成面積相等的25塊。

將大鼠置于敞箱底面的中心方格，以穿越底面的格數(shù)為水平運(yùn)動次數(shù)，以后肢直立次數(shù)（前爪騰空或攀附箱壁）為垂直運(yùn)動次數(shù)。每只大鼠測定時間為5 min。每只大鼠測定完成后徹底清潔，避免氣味殘留，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 炎癥因子水平及表達(dá)測定 按夾心法酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒檢測方法檢測大鼠血清及海馬、杏仁核組織中TNF-α、IL-1β及IL-6水平。

大鼠海馬或杏仁核組織總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，稀釋25倍。以2 μL稀釋后的cDNA為模版，以GAPDH為內(nèi)參對照，熒光實(shí)時定量PCR儀擴(kuò)增基因片段，同時設(shè)置無cDNA的陰性對照。熒光實(shí)時定量PCR反應(yīng)參數(shù)： 95 ℃預(yù)變性15 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火與延伸31 s，共40個循環(huán)。PCR過程中實(shí)時收集熒光信號。7300 System SDS Software分析數(shù)據(jù)，通過△△Ct值定量樣本中TNF-α、IL-1β及IL-6 mRNA表達(dá)的相對值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。組間差異采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件One-Way ANOVA 和Newman-Keuol-Student test檢驗(yàn)分析。雙側(cè)P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠形態(tài)及體質(zhì)量變化

基本形態(tài)和體重作為大鼠生長過程中的重要指標(biāo)，反映了焦慮對大鼠帶來的影響。第0 d，各組大鼠反應(yīng)敏捷、皮光毛亮、積極好動、不易激惹；造模7 d后，造模各組大鼠相較于正常對照組大鼠開始出現(xiàn)對于外界刺激回應(yīng)減少和攝食減少的現(xiàn)象；造模28 d即給藥21 d后，模型組大鼠精神不振、毛發(fā)凌亂、蜷縮于箱角、煩躁易怒；帕羅西汀、酸棗仁、茯苓及不同比例酸棗仁-茯苓均能不同程度改善慢性應(yīng)激給大鼠帶來的形態(tài)變化。其中帕羅西汀組及酸棗仁-茯苓3:1組大鼠精神狀況較好、不易惹怒、對外界刺激積極回應(yīng)、進(jìn)食正常，與模型組大鼠相比，基本形態(tài)的改變最為明顯。

如圖1所示，第0 d，各組大鼠體質(zhì)量無明顯差異；造模7 d后，造模各組大鼠體質(zhì)量增重情況較正常對照組大鼠顯著減少（P＜0.01），除正常對照組外各造模組體重?zé)o顯著性差異（P＞0.05）；造模28 d后，模型組大鼠較正常對照組大鼠體質(zhì)量持續(xù)下降，結(jié)果有極顯著性差異（P＜0.01），帕羅西汀組、酸棗仁組、酸棗仁-茯苓1:1組、酸棗仁-茯苓2:1組、酸棗仁-茯苓3:1組動物體質(zhì)量較模型組顯著增加（P＜0.01）。

圖1 不同時間各組大鼠體質(zhì)量（±s，n=8）Fig.1 Weight of rats at different stages（±s, n=8）

大鼠攝食減少、體重減輕，精神不振、毛發(fā)凌亂、蜷縮于箱角、煩躁易怒等癥狀與焦慮癥患者煩躁、心慌、寢食難安、消瘦等癥狀類似。相較于對照組，模型組大鼠出現(xiàn)了明顯的焦慮樣外型改變，帕羅西汀組、酸棗仁組及酸棗仁-茯苓各比例復(fù)配組能改善慢性束縛刺激給大鼠帶來的形態(tài)改變及體重減輕現(xiàn)象，說明其對緩解大鼠焦慮情緒有積極改善作用，其中帕羅西汀組及酸棗仁-茯苓3:1組效果最為明顯。

2.2 各組大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

焦慮癥屬于精神類疾病，病因機(jī)制復(fù)雜。慢性束縛加孤養(yǎng)是目前探討焦慮癥發(fā)病機(jī)制和研究抗焦慮藥物作用機(jī)制的一種常用造模方法，可誘導(dǎo)動物壓力相關(guān)行為[17-18]。該模型尚無固定的造模評價指標(biāo)，一般通過行為學(xué)綜合評定。高架十字迷宮和曠場試驗(yàn)是評估嚙齒類動物心理常用的實(shí)驗(yàn)方法，反映動物對新環(huán)境的探究趨勢和緊張程度，通常用于評價大鼠焦慮樣行為[19]。如表2、表3所示，造模28 d后模型組大鼠高架十字迷宮總穿臂次數(shù)、進(jìn)入開放臂次數(shù)比例、開放臂停留時間比例，曠場水平運(yùn)動次數(shù)、垂直運(yùn)動次數(shù)較正常對照組大鼠均極顯著降低（P＜0.01），表明慢性束縛加孤養(yǎng)方法成功誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)焦慮樣行為。

表2 各組大鼠高架十字迷宮試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Extracts on behavioristics in the elevated cross maze test of rats

表3 各組大鼠曠場試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Extracts on behavioristics in the open field test of rats

與模型組比較，帕羅西汀組、酸棗仁-茯苓3:1組高架十字迷宮總穿臂次數(shù)、進(jìn)入開放臂次數(shù)比例、開放臂停留時間比例均極顯著提高（P＜0.01），酸棗仁-茯苓2:1組總穿臂次數(shù)、開放臂停留時間比例顯著提高（P＜0.05，P＜0.01），酸棗仁組、茯苓組及酸棗仁-茯苓1:1組開放臂停留時間比例顯著提高（P＜0.05，P＜0.01）。

與模型組比較，帕羅西汀組、酸棗仁-茯苓3:1組曠場水平運(yùn)動次數(shù)、垂直運(yùn)動次數(shù)均極顯著提高（P＜0.01），酸棗仁組及酸棗仁-茯苓2:1組水平運(yùn)動次數(shù)顯著提高（P＜0.05，P＜0.01）。

通過文獻(xiàn)回顧對近年來治療焦慮癥的中藥方劑進(jìn)行分析，酸棗仁、茯苓出現(xiàn)的頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超其它藥物[8-9]，推測酸棗仁、茯苓應(yīng)為抗焦慮方劑主要的活性成分來源，兩藥間可能具有協(xié)同增效的作用。而市售抗焦慮中藥方劑及保健品中，酸棗仁-茯苓比例并不完全一致，因此本研究基于酸棗仁-茯苓常見臨床配比，評價不同比例下酸棗仁-茯苓的抗焦慮作用。在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，開放臂幾乎無邊緣保護(hù)，類似于人類位于懸崖邊；而曠場實(shí)驗(yàn)，則是通過動物水平和垂直運(yùn)動次數(shù)，觀察進(jìn)入開闊環(huán)境后動物的探究行為和緊張度。在本研究中，所有藥物干預(yù)組大鼠在開放臂停留時間的比例均顯著提高（P＜0.05，P＜0.01），說明酸棗仁、茯苓均可有效減少動物恐懼和不安情緒。僅帕羅西汀和酸棗仁-茯苓3:1復(fù)配可同時極顯著提高大鼠高架十字迷宮總穿臂次數(shù)和進(jìn)入開放臂次數(shù)比例（P＜0.01）、曠場水平運(yùn)動次數(shù)和垂直運(yùn)動次數(shù)（P＜0.01），說明酸棗仁-茯苓3:1對提高動物探究特性和減少恐懼、焦慮心理效果最佳。

2.3 各組大鼠炎癥水平

與健康個體相比，焦慮癥患者炎性細(xì)胞因子水平顯著升高[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)的應(yīng)激狀態(tài)可激活免疫細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生，引發(fā)炎癥風(fēng)暴[22-24]。炎癥反應(yīng)又將介導(dǎo)細(xì)胞凋亡或焦亡，造成功能組織損傷并誘發(fā)疾病[25-27]。多項研究顯示炎癥因子參與調(diào)節(jié)動物情緒和行為，可在焦慮、躁狂、抑郁等多種精神類疾病發(fā)展中發(fā)揮重要作用[28-30]。海馬與杏仁核是腦內(nèi)獨(dú)立的兩個功能核團(tuán)，海馬負(fù)責(zé)記憶與學(xué)習(xí)、杏仁核負(fù)責(zé)情緒調(diào)節(jié)及加工，兩者共同參與情感、行為的產(chǎn)生和內(nèi)分泌整合調(diào)節(jié)過程并介導(dǎo)焦慮樣行為的發(fā)生[31-33]。因此本研究，分別檢測了酸棗仁-茯苓水提物對動物整體、海馬、杏仁核炎癥因子水平的影響。結(jié)果如圖2、圖3，焦慮模型組大鼠的血清中炎癥因子水平、海馬及杏仁核組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平及mRNA表達(dá)均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），確證炎癥因子參與了大鼠焦慮癥的形成發(fā)展過程。

圖2 各組大鼠血清及組織炎性因子水平 （pg/mL）Fig.2 Levels of inflammatory factors in serum and tissue of rats （pg/mL）

圖3 各組大鼠海馬及杏仁核組織炎性因子mRNA表達(dá)Fig.3 Expression of inflammatory factor mRNA in hippocampus and amygdala of rats

與模型組比較，帕羅西汀、酸棗仁、茯苓及各比例酸棗仁-茯苓均能顯著改善大鼠血清、海馬及杏仁核組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平（P＜0.05，P＜0.01），提示酸棗仁、茯苓可能通過降低外周及中樞炎癥水平發(fā)揮抗焦慮作用。此外，雖各給藥組大鼠血清、海馬及杏仁核組織中炎癥因子水平較模型組大鼠均差異顯著（P＜0.05，P＜0.01），但仍能觀察到不同組別藥物的抗炎效果有較為明顯的區(qū)別（圖2）。這一作用區(qū)別，可以在海馬及杏仁核組織中炎癥因子mRNA表達(dá)變化（圖3）中得到印證。各組給藥均能降低海馬及杏仁核組織中炎癥因子mRNA表達(dá)，但僅帕羅西汀及酸棗仁-茯苓3:1組結(jié)果較模型組有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。研究顯示，在持續(xù)應(yīng)激狀態(tài)下，免疫細(xì)胞激活，誘導(dǎo)凋亡相關(guān)微粒蛋白移位至胞漿，活化Caspase-1，進(jìn)而將IL-1β前體剪切成活化狀態(tài)并釋放。IL-1β的釋放將進(jìn)一步激活炎癥相關(guān)通路，導(dǎo)致IL-6等更多炎癥因子的產(chǎn)生，引發(fā)炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)的發(fā)生又將激活免疫細(xì)胞，如此循環(huán)反復(fù)，造成炎癥風(fēng)暴并誘發(fā)疾病[23-24]。因此，相較于mRNA表達(dá)，組織中炎癥因子水平可更為靈敏地反映動物的免疫炎癥狀態(tài)。這可能是造成酸棗仁組、茯苓組、酸棗仁-茯苓1:1組和酸棗仁-茯苓2:1組動物海馬和杏仁核組織中炎癥因子mRNA表達(dá)較模型組無顯著性差異（P＞0.05），但血漿、海馬和杏仁核組織中炎癥因子水平較模型組有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）的原因之一。

劉佳星等[34]基于UPLC-TOF-MS/MS技術(shù)對抗焦慮經(jīng)典方劑-酸棗仁湯的化學(xué)成分進(jìn)行分析，共推斷和鑒別出134個化合物，其中41個化合物來源于酸棗仁、11個化合物來源于茯苓。已有研究表明黃酮類化合物是酸棗仁鎮(zhèn)靜安神、抗焦慮的主要活性成分[35]，而三萜酸類化合物則是茯苓抗驚厥、鎮(zhèn)靜催眠的主要活性成分[36]。王茜等[37]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對復(fù)方酸棗仁湯藥效物質(zhì)進(jìn)行篩選，針對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析，結(jié)果顯示酸棗仁湯中黃酮類化合物、三萜酸類化合物與TNF-α信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究較多，其機(jī)制涉及MAPK8、CASP3等多個靶點(diǎn)。這將為酸棗仁-茯苓抗炎機(jī)制的進(jìn)一步研究，提供理論依據(jù)和可能的方向。

3 結(jié)論

焦慮癥致病因素復(fù)雜且并發(fā)癥較多，其防治及發(fā)病機(jī)制一直是該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。本研究使用慢性束縛加孤養(yǎng)方法建立大鼠焦慮癥模型，酸棗仁-茯苓水提物能有效改善焦慮模型大鼠形態(tài)、體質(zhì)量及行為學(xué)表現(xiàn)，發(fā)揮抗焦慮作用。此外酸棗仁-茯苓水提物能有效降低血清、海馬及杏仁核組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β及IL-6水平，推測其抗焦慮作用可能與降低外周與中樞炎癥水平有關(guān)。酸棗仁-茯苓3:1復(fù)配使用可極顯著提高動物造模28 d后體質(zhì)量（P＜0.01），提高高架十字迷宮總穿臂次數(shù)、進(jìn)入開放臂次數(shù)比例、開放臂停留時間比例（P＜0.01），提高曠場水平運(yùn)動次數(shù)、垂直運(yùn)動次數(shù)（P＜0.01），降低大鼠血清、海馬及杏仁核組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平（P＜0.01）及mRNA表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），效果優(yōu)于酸棗仁-茯苓1:1或1:2復(fù)配及酸棗仁或茯苓單獨(dú)使用。

本研究從抗炎的角度初步探討了酸棗仁-茯苓抗焦慮的作用，為酸棗仁、茯苓抗焦慮功能食品的開發(fā)提供了新思路和理論依據(jù)。酸棗仁-茯苓復(fù)配抗焦慮的具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。