黑果腺肋花楸果實的降血糖活性及其對脂代謝的影響

王麗紅，王天宇，楊 麗，周 彤，趙 稷，趙 宏，張 宇

（佳木斯大學藥學院，黑龍江佳木斯 154007）

黑果腺肋花楸Aronia melanocarpa（Michx.） Elliott（AM）為薔薇科腺肋花楸屬植物，原產(chǎn)于北美[1-2]。20世紀90年代引入中國，2018年黑果腺肋花楸果實被國家衛(wèi)生健康委員會批準為新食品原料[3-4]。黑果腺肋花楸果實（AMF）中富含多類活性成分，如黃酮類化合物、有機酸、酚類、多糖等，營養(yǎng)價值豐富，具有抗炎、抗菌、抗氧化及調節(jié)免疫等功效[5-9]。AMF含有的黃酮類化合物以槲皮素及衍生物為主[10]。黃酮類化合物可通過抗氧化作用，使胰島細胞功能恢復并且可改善Ⅱ型糖尿病（T2DM）的胰島素抵抗[11-12]。AMF果汁具有一定的降血糖作用[13-14]，但關于其所含的黃酮類化合物的降血糖作用研究尚無報道。

隨著我國社會經(jīng)濟發(fā)展，目前我國已成為世界上糖尿病發(fā)病率最高的國家，其中T2DM占糖尿病患者90%以上[15-16]。T2DM是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，主要病因為胰島素分泌能力減弱、氧化應激的發(fā)生等，會導致腎臟、肝臟、胰腺的損害及血脂代謝異常等多種癥狀?，F(xiàn)有的降糖西藥主要通過增加胰島素敏感性、促進胰島素分泌進行治療，但療效不佳且長期使用會產(chǎn)生胃腸道不良反應、尿路感染等副作用[17-19]。因此，開發(fā)安全性高、副作用少的新型輔助降血糖功能性食品對防治T2DM頗具意義。而AMF作為一種具有抗T2DM潛力的新食品原料[13]，開發(fā)前景良好。但目前對AMF降血糖作用的研究較少，且作用機制尚不明確，因此研究AMF改善T2DM的發(fā)展的作用及其機制，對進一步開發(fā)AMF和新型降糖食品十分有意義。

通過前期網(wǎng)絡藥理學的篩選，本實驗將探究AMF總黃酮的降血糖活性?？疾霻2DM小鼠經(jīng)灌胃給藥及果汁后，其生理指標、飲水量、采食量、臟器指數(shù)、空腹血糖值、血清中SOD活性、MDA含量、脂代謝指標，以及肝臟、胰腺組織的變化，探究AMF的降糖功效及其對脂代謝的影響，為開發(fā)新型降糖功能性食品提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑果腺肋花楸果實 采自黑龍江佳木斯，經(jīng)鑒定為正品；氯化鈉注射液 杭州民生藥業(yè)有限公司；鹽酸二甲雙胍緩釋片 山東司邦得制藥有限公司；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ） 索萊寶生物科技公司；甘油三酯（triglyceride，TG）測定試劑盒（A110-1-1）、總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒（A111-1-1）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）測定試劑盒（A113-1-1）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒（A112-1-1）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）測定試劑盒（A003-1-2）、超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒（A001-3-2）

南京建成生物工程研究所；SPF級昆明（KM）雄性小鼠SCXK（吉）-2018-0007 18～22 g，60只，購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司；正常飼料 北京科奧協(xié)力飼料有限公司；高糖高脂飼料 南京盛民科研動物養(yǎng)殖場。

TGL-20BRS高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；Synergy HT全自動多功能酶標儀 上海浦春計量儀器有限公司；FA2004c型電子天平 上海越平科學儀器制造有限公司；GA-3型血糖儀及血糖試紙 三諾生物傳感股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 AMF果汁：取AMF經(jīng)勻漿機5000 r/min勻漿10 min，于-4 ℃保存待用。

AMF總黃酮：取AMF 3318 g，用70%乙醇于95 ℃，料液比1:38（g/mL）的條件下回流提取93 min，合并提取液，減壓濃縮即得AMF總黃酮浸膏。選用D101型大孔樹脂，用10%乙醇溶解浸膏配制成60 μg/mL的供試品溶液，上樣吸附12 h，用70%乙醇進行洗脫，洗脫體積為3 BV，收集洗脫液，濃縮得到總黃酮粉末，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法[20]測定總黃酮含量為512.6 mg/g。

1.2.2 模型的建立 所有KM小鼠（18～22 g）適應性喂養(yǎng)7 d，培養(yǎng)條件為相對濕度約55%，溫度22 ℃，12 h的光/暗循環(huán)。隨機抽8只為空白組，正常飼料喂養(yǎng)，其余小鼠分為6籠，每籠8只，高糖高脂飼料喂養(yǎng)。4周后，小鼠禁食不禁水12 h后腹腔注射70 mg/kg·bw STZ（用pH4.3檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液冰浴配制）誘導T2DM模型?？瞻捉M注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。3 d后，斷尾取血，測定空腹血糖值≥11.1 mmol/L，證明模型建立成功[20-22]。

1.2.3 動物分組 將造模成功的小鼠隨機分為6組（n=8），即T2DM模型組、陽性組（鹽酸二甲雙胍40 mg/kg·bw）、AMF總黃酮低、中、高劑量組（75、150、300 mg/kg·bw）以及AMF果汁組（10 mL/kg·bw）。模型組及空白組灌胃生理鹽水。每日早上9點灌胃給藥，給藥周期為28 d。實驗期間，除空白組外，其余各實驗組一直喂食高糖高脂飼料直至實驗結束，以排除小鼠飲食影響。末次給藥后，小鼠禁食不禁水24 h，眼球取血，脫頸椎處死。眼球血置于EP管中，離心，取上清，置于-80 ℃冰箱中冷凍保存[23]。實驗按照中國科學技術部動物管理條例，并經(jīng)佳木斯大學實驗動物倫理委員會批準（批號：SCXK-2018-0007）。

1.2.4 觀察小鼠生理指標 每日觀察小鼠生理狀態(tài)，并每周對小鼠的體重、空腹血糖值進行測定[24]。

1.2.5 小鼠飲水量及采食量測定 給藥第4周每日灌胃前測定前1 d的小鼠飲水量、采食量[25]。

1.2.6 小鼠臟器指數(shù)的測定 處死小鼠后測定其臟器指數(shù)[26]。臟器指數(shù)計算公式為：

式中：A：臟器指數(shù)；W：臟器重量（mg）；M：小鼠體重（g）。

1.2.7 血清中SOD活性、MDA含量及脂代謝指標的測定 血脂四項測定：TG、TC、HDL-C、LDLC均按試劑盒說明書進行檢測。

抗氧化指標測定：MDA和SOD均按試劑盒說明書測定。

1.2.8 小鼠肝臟和胰腺組織病理學觀察 小鼠處死后取肝臟、胰腺，放入0.9%生理鹽水中洗凈，用濾紙吸凈表面水分，再放入4%多聚甲醛固定，無水乙醇脫水處理，石蠟包埋和切片（厚度為5 μm），蘇木精-伊紅（hematoxylin- eosinstaining，HE）染色，于顯微鏡下觀察組織的病理變化[27]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

結果以平均數(shù)±標準差表示，使用SPSS 16.0分析數(shù)據(jù)，P＜0.05具有顯著性差異，P＜0.01具有極顯著差異，P＞0.05無統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 小鼠生理指標結果

造模后空白組小鼠表現(xiàn)正常，精神良好。模型組小鼠毛色暗淡，精神萎靡。給藥4周治療后，各組小鼠狀態(tài)都有所恢復。

AMF對T2DM小鼠體重的影響見圖1。模型組小鼠體重明顯減輕（P＜0.01），符合糖尿病“三多一少”的癥狀。給藥治療28 d后總黃酮低、中、高劑量組及果汁組的小鼠體重均較模型組顯著增加（P＜0.01），分別增加29.66%、37.83%、38.73%、19.46%。其中總黃酮各劑量組在28 d改善T2DM效果最好，以及果汁組體重呈先下降再上升的趨勢，可能均與AMF作為功能性食品作用緩慢、起效時間長相關；高劑量組改善小鼠體重能力與陽性藥無顯著差異（P＞0.05），優(yōu)于其他各實驗組。

圖1 AMF對小鼠體重的影響Fig.1 Effect of AMF on body weight of diabetic mice

AMF對T2DM小鼠空腹血糖影響見圖2。與空白組相比，造模后各組小鼠血糖明顯上升（P＜0.01），高于正常水平（11.1 mmol/L），并長期維持該水平，表示模型穩(wěn)定。給藥28 d各組小鼠T2DM癥狀得到明顯改善，血糖值均顯著或極顯著下降（P＜0.05或P＜0.01），分別下降41.38%、48.36%、61.96%、63.26%、36.23%，其中高劑量組與陽性組血糖值差異不顯著（P＞0.05），表明AMF總黃酮具有良好的降血糖作用。結合Worsztynowicz等[28]的研究，AM果汁及總黃酮可能通過抑制α-glucosidase與α-Amylase活性改善血糖水平。Mu等[29]的研究也證明了AMF提取物具有一定的降血糖作用，將其結果與本研究進行比較，發(fā)現(xiàn)AMF總黃酮具有更好的降血糖作用。

圖2 AMF對小鼠空腹血糖值的影響Fig.2 Effect of AMF on fasting blood glucose in mice

2.2 實驗組對小鼠飲水量與采食量的影響

AMF對T2DM小鼠飲水量影響見圖3。空白組小鼠飲水量為185.35 mL/d/kg；模型組小鼠多飲現(xiàn)象明顯，較空白組增加了445.10%（P＜0.01）；與模型組相比，總黃酮各劑量組飲水量分別減少了4.32%、6.47%、14.63%（P＜0.05或P＜0.01）；果汁組與模型組相比飲水量無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），可能為AMF作為功能性食品需要更長的時間起效相關；高劑量組飲水量與陽性組無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明AMF總黃酮高劑量組改善T2DM小鼠飲水能力與陽性組效果相似，能有效緩解T2DM導致的煩渴，且優(yōu)于其他各組。

圖3 AMF對小鼠飲水量的影響Fig.3 Effect of AMF on water intake in mice

AMF對T2DM小鼠采食量影響見圖4?？瞻捉M小鼠采食量為167.08 g/d/kg；模型組小鼠多食現(xiàn)象明顯，與空白組相比增加了180.20%（P＜0.01）；與模型組相比，總黃酮各劑量組采食量分別減少了5.61%、9.94%、15.40%（P＜0.05或P＜0.01）；果汁組與模型組相比采食量無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），改善效果不佳，可能需要給藥更長時間觀察效果；高劑量組采食量與陽性組無顯著差異（P＞0.05），表明AMF總黃酮高劑量組改善T2DM小鼠采食能力與陽性藥相仿，能有效緩解T2DM導致的多食，且在各給藥組中效果最佳。

圖4 AMF對小鼠采食量的影響Fig.4 Effects of AMF on food intake in mice

2.3 AMF對小鼠臟器指數(shù)的影響

T2DM病情發(fā)展會導致一系列并發(fā)癥，而這些癥狀與體內器官病變密切相關，臟器指數(shù)可反應T2DM導致的臟器受損的程度。AMF對T2DM小鼠臟器指數(shù)的影響見圖5。模型組小鼠的各臟器指數(shù)較空白組均顯著增加（P＜0.05），表明T2DM會造成小鼠臟器損傷，導致其出現(xiàn)肝臟腫大、腎臟水腫、脾臟及胰臟紅腫，臟器指數(shù)上升。經(jīng)給藥后各組小鼠肝臟與腎臟指數(shù)均有恢復（P＜0.05），且中、高劑量組胰臟、脾臟指數(shù)有所恢復（P＜0.05）。表明AMF能在一定程度上治療T2DM造成的臟器損傷，能改善肝臟功能促進對葡萄糖的分解，恢復脾臟功能提高T2DM小鼠免疫力，并緩解作為糖尿病并發(fā)癥的腎臟、胰臟損傷。

圖5 AMF對小鼠臟器脂數(shù)的影響Fig.5 Effects of AMF on visceral fat count in mice

2.4 血清中SOD活性、MDA含量及脂代謝指標的變化

高脂血癥是糖尿病的常見并發(fā)癥，檢測血脂四項的含量可間接反應小鼠糖尿病的程度。各組小鼠血清血脂四項含量變化見圖6。由圖6可知，模型組小鼠TG、TC和LDL-C高于空白組，而HDL-C顯著下降（P＜0.05）。給藥各組血脂四項與模型組均有差異（P＜0.05），表明給藥組可改善血脂代謝，其中高劑量組在改善血脂代謝上接近陽性組（P＞0.05），優(yōu)于其余各組。

圖6 AMF對小鼠血脂四項的影響Fig.6 Effects of AMF on four kinds of items of blood lipid in mice

小鼠血清MDA和SOD含量見圖7。與空白組相比，模型組小鼠MDA水平增高，SOD水平下降，證明小鼠產(chǎn)生氧化應激。給藥后各組小鼠MDA均顯著降低，SOD均顯著增加（P＜0.05），表明給藥組可改善小鼠氧化應激，且高劑量組效果與陽性組無明顯差異（P＞0.05），優(yōu)于其余各組。結合景怡等[30]的研究結果，可以推測AMF總黃酮可通過調節(jié)T2DM小鼠的血脂代謝和氧化應激水平來改善T2DM。

圖7 AMF對小鼠血清生化指標的影響Fig.7 Effects of AMF on serum biochemical indexes of mice

2.5 小鼠肝臟切片變化

各組小鼠肝臟HE染色后觀察，由圖8～圖9可以看出，正常組肝細胞、肝細胞索及肝竇結構正常，無病變現(xiàn)象。模型組肝細胞損傷嚴重，排列松散，肝竇窄，肝索結構消失，符合T2DM造成的肝損傷。經(jīng)給藥治療，中劑量組細胞損傷和局灶性壞死癥狀得到改善，肝竇較窄，高劑量及陽性組細胞形態(tài)較正常，排列緊密，肝竇清晰正常，肝索呈放射性排布，排列整齊，表明中、高劑量組均可改善T2DM導致的肝損傷，且高劑量組效果更佳。

圖8 小鼠肝組織形態(tài)學觀察（HE，100×）Fig.8 Morphological manifestations of liver tissue in mice of each group (HE, 100×)

圖9 小鼠肝組織形態(tài)學觀察（HE，400×）Fig.9 Morphological manifestations of liver tissue in mice of each group (HE, 400×)

2.6 小鼠胰臟切片變化

小鼠胰臟HE染色后，如圖10～圖11所示，正常組細胞成團，形狀正常；模型組細胞形狀明顯改變，排列松散，可見細胞破裂；陽性組細胞尚規(guī)則，形狀較正常；低劑量組、果汁組細胞無明顯變化，改善效果不佳；總黃酮中、高劑量組細胞形態(tài)有所恢復。表明AMF具有一定的修復小鼠胰腺損傷的功效，并呈劑量依賴。

圖10 小鼠胰腺組織形態(tài)學觀察（HE，100×）Fig.10 Histopathology of pancreas in mice of each group (HE, 100×)

圖11 小鼠胰腺組織形態(tài)學觀察（HE，400×）Fig.11 Histopathology of pancreas in mice of each group (HE, 400×)

3 討論與結論

本實驗考察了AMF總黃酮、果汁對T2DM小鼠的影響，并進行了對比分析。與模型組相比，總黃酮組小鼠精神狀態(tài)有所恢復，體重減輕狀態(tài)、進食量及飲水量有所改善，空腹血糖值明顯下降，有效控制TC、TG、LDL-C、MDA含量升高，且使HDL-C、SOD含量顯著升高（P＜0.05），說明AMF總黃酮可通過提高SOD，降低MDA的活性改善氧化應激，調節(jié)血脂代謝，進而改善胰島素抵抗，保護胰島β細胞，從而達到降血糖作用，且糖尿病小鼠血脂紊亂現(xiàn)象有所改善。通過臟器指數(shù)與肝臟和胰腺病理形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，與總黃酮中、低劑量組相比，高劑量組可以修復STZ誘導的T2DM小鼠的胰腺和肝臟，果汁組可在一定程度上改善STZ誘導T2DM小鼠癥狀，但效果弱于黃酮各劑量組（P＜0.05）。綜上，AMF可改善T2DM小鼠癥狀，AMF總黃酮高、中、低劑量組及果汁組相比，高劑量組效果最優(yōu)，且在28 d效果最佳，說明其降糖效果溫和；高劑量對T2DM小鼠起到良好的降糖效果。由于其是一種新食品，所以具有開發(fā)為降糖功能性食品與保健品的優(yōu)秀潛力。

綜上所述，AMF能通過調節(jié)氧化應激有效降低T2DM小鼠血糖，改善小鼠血脂紊亂，修復肝臟胰腺損傷，具有確切的降血糖作用，且降血糖作用與給藥劑量呈一定的依賴性。但本實驗未深入探究AMF總黃酮的降糖作用的通路，在后續(xù)實驗當中課題組會進一步進行研究，為天然藥物防治T2DM提供一定理論依據(jù)。