1-MCP處理對西葫蘆果實線粒體抗氧化作用和能量代謝的影響

余曉玉，楊 源，吳玉珍，余海濤，劉 勇，郁志芳,

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095；2.江蘇康潤農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，江蘇南京 210095）

西葫蘆（Cucurbita pepoL.）為葫蘆科南瓜屬植物，是葫蘆科南瓜屬西葫蘆種[1]。西葫蘆果實質(zhì)地脆嫩，富含多種維生素、膳食纖維等物質(zhì)。西葫蘆果實采后生理代謝旺盛，表皮常出現(xiàn)褪色、組織變松軟，甚至腐敗變質(zhì)，失去商品價值。

目前保持西葫蘆果實品質(zhì)的物理方法有低溫、熱空氣、熱水、高相對濕度等，化學(xué)方法有水楊酸、1-MCP、殼聚糖涂膜等，也有通過復(fù)合的方式進(jìn)行處理，如冷激結(jié)合甜菜堿[2]。西葫蘆的保鮮方法有許多，然而，在采后貯藏過程中，這些方法通常由于成本高、不環(huán)保等因素難以應(yīng)用到實際生產(chǎn)中。1-MCP作為一種綠色、無污染、成本不高的化學(xué)保鮮劑，已經(jīng)廣泛應(yīng)用到生產(chǎn)實踐當(dāng)中，1-MCP是一種新型的乙烯抑制劑，具有與乙烯相似的性質(zhì)，能夠吸引乙烯受體中金屬離子的電子并配對，與乙烯受體牢固結(jié)合從而達(dá)到抑制內(nèi)外源乙烯的合成作用，降低果蔬采后呼吸和乙烯強度，延緩其成熟和衰老進(jìn)程，保持商品品質(zhì)[3]。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是生物體在正常有氧呼吸過程中產(chǎn)生的一類代謝產(chǎn)物，主要包括過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O2-·）、羥自由基（-OH）等，ROS與果蔬的成熟衰老有關(guān)，線粒體是ROS產(chǎn)生的主要來源，ROS也將線粒體作為靶部位[4]。機體內(nèi)過多的ROS會產(chǎn)生不利的影響，如破壞線粒體膜內(nèi)氧化還原平衡，而線粒體內(nèi)同時也存在著一些抗氧化物酶對ROS起清除作用[4]。如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）。大量研究結(jié)果表明，1-MCP可以通過提高抗氧化物酶的活性或抗氧化物質(zhì)的含量來清除ROS達(dá)到延長保質(zhì)期的作用[5-6]。Song等[7]研究發(fā)現(xiàn)，小白菜葉綠體中ROS積累會引起葉綠體細(xì)胞膜受損，而1-MCP可能通過提高抗氧化物酶SOD、APX的活性從而延緩了葉片衰老。線粒體是有氧呼吸的主要場所，呼吸過程會產(chǎn)生大量能量（ATP），而ATP的生成與能量代謝相關(guān)酶密不可分，琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）、細(xì)胞色素C氧化酶（cytochrome C oxidase，CCO）、H+-ATPase和Ca2+-ATPase是能量代謝水平的特征酶[8]。目前，已有研究表明‘金紅’蘋果采后果皮組織褐變與能量虧缺有密切關(guān)系[9]，張正敏等[10]研究‘白鳳’桃的桃腐病發(fā)現(xiàn)較高的能荷水平能抑制桃果實發(fā)病率的上升。綜上，目前研究1-MCP延緩果實成熟衰老機理的系統(tǒng)較完備，但在更深層次方面研究1-MCP對西葫蘆果實內(nèi)部線粒體的調(diào)控機理尚未明確，本文通過對1-MCP處理在常溫貯藏下西葫蘆果實品質(zhì)和生理生化的研究，探究1-MCP處理對西葫蘆果實線粒體抗氧化能力和能量代謝水平的調(diào)控機制，為1-MCP應(yīng)用于采后西葫蘆貯藏保鮮技術(shù)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西葫蘆 江蘇康潤農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司提供，品種為‘泰山綠’，露地栽培。選取大小均勻、無機械損傷、且與實驗所需成熟度相符（成熟期）的西葫蘆；1-MCP 咸陽西秦生物科技有限公司；三氯乙酸（Trichloroacetic acid，TCA）、四氯化鈦、α-萘胺、亞油酸鈉、沒食子酸、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone，PVP） 上海麥克林生物化學(xué)有限公司；乙酸鈉、30% H2O2（分析純）、愈創(chuàng)木酚（含量≥99%，化學(xué)純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；硫酸、鹽酸

南京化學(xué)試劑股份有限公司；鹽酸羥胺、乙二胺四乙酸二鈉 西隴化工股份有限公司；琥珀酸鈉、5-甲基酚嗪硫酸甲酯（Phenazine methosulfate，PMS）、細(xì)胞色素C（含量≥95%，牛心）、牛血清白蛋白、N,N-二甲基對苯二胺 上海源葉生物科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Trimethylol aminomethane，Tris）、考馬斯亮藍(lán)G-250、甘露醇 北京索萊寶科技有限公司。

CR-400 CHROMA METER色差儀 日本柯尼卡美能達(dá)有限公司；PAL-1G電子數(shù)顯折光儀ATAGO公司；Alpha-1860A紫外可見分光光度計上海譜元儀器有限公司；H1750R臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；A11分析用研磨機 德國IKA；FE30實驗室電導(dǎo)率儀、FE20 Plus實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料及處理方法 挑選600個西葫蘆果實，隨機分為兩組置泡沫箱，分別進(jìn)行如下處理：a.采用20 μL·L-1的1-MCP熏蒸處理24 h，打開泡沫箱通風(fēng)1 h，將上述西葫蘆果實套塑料袋裝框后置于常溫（20±1 ℃）、相對濕度90%左右的環(huán)境中貯藏12 d；b.對照組（CK）：不用1-MCP處理但使用同樣操作。取樣點為-1（樣品當(dāng)天運回未做任何處理之前，作為初始參考）、0、3、6、9、12 d。每個采樣點取30個果實。在每個采樣時間點測定果實品質(zhì)和生理指標(biāo)后，將西葫蘆果實去皮、去籽，果肉切塊，立即放到液氮中速凍，并保存在-80 ℃冰箱中以供進(jìn)一步分析。試驗設(shè)置三個重復(fù)樣品。

1.2.2 失重率、總可溶性固形物的測定 果實失重率測定方法為取10個1-MCP處理過的西葫蘆果實，稱取每個貯藏時間點果實的重量，對照處理保持一致，重量記為M1，初始重量記為M0，單位以g計。計算公式為：

總可溶性固形物（TSS）測定方法為取新鮮西葫蘆果肉組織榨汁，使用ATAGO手持式折射儀測定，測定結(jié)果以%表示。

1.2.3 可溶性蛋白、總酚、VC含量的測定 可溶性蛋白含量的測定參考曹建康等[11]的方法略有改動。將新鮮西葫蘆果肉切碎并混合均勻，稱取1 g樣品，加入5 mL蒸餾水，渦旋混勻后在4 ℃、12000 g離心20 min，收集上清液4 ℃低溫保存。吸取1 mL上清（視蛋白質(zhì)含量適當(dāng)稀釋，計算時按照稀釋倍數(shù)計算即可），加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，混合均勻，2 min后在波長595 nm處比色，標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法為取六支試管依次按比例加入100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液和蒸餾水，共計1 mL，混勻后按照樣品測定方法進(jìn)行測定，重復(fù)測定三次。

總酚含量參考Qiu等[12]的方法略有改動。稱取2 g樣品，加入4 mL 1% HCl-乙醇溶液，4 ℃、12000 g離心20 min，收集上清液4 ℃低溫保存。取0.1 mL上清加入0.4 mL蒸餾水、2.5 mL福林酚、2 mL 7.5%碳酸鈉溶液，45 ℃水浴15 min，于765 nm下測定吸光值，重復(fù)測定三次。

VC含量的測定參考曹建康等[11]的方法，采用分光光度法，含量表示為mg·100 g-1，重復(fù)測定三次。

1.2.4 線粒體的提取 線粒體的提取參考Millar等[13]的方法略有改動，稱取6 g樣品，根據(jù)綠色植物組織的線粒體提取方法，按比例加入低溫預(yù)冷過的pH7.5 50 mmol·L-1Tris-HCl提取液（含1 mmol·L-1EDTA、0.25 mol·L-1蔗糖、0.3 mol·L-1甘露醇、0.1%半胱氨酸、0.1%BSA、0.5%PVP），渦旋混合均勻后經(jīng)四層紗布過濾，使用玻璃棒攪拌收集濾液于50 mL離心管中，于4 ℃ 6000 g離心5 min，棄去沉淀，取上清采用同樣的步驟再離心一次。離心后得到的濾液以14000 g在4 ℃離心20 min，棄上清，收集沉淀，用20 mL pH7.2 10 mmol·L-1Tris-HCl洗滌液（含1 mmol·L-1EDTA、0.25 mol·L-1蔗糖、0.3 mol·L-1甘露醇、0.1%BSA）洗滌，于4 ℃ 14000 g離心20 min，洗滌過程重復(fù)三次，得到沉淀即為線粒體。將線粒體沉淀保存在1.5 mL pH7.2 10 mmol·L-1Tris-HCl懸浮液（含1 mmol·L-1EDTA、0.25 mol·L-1蔗糖、0.3 mol·L-1甘露醇）中，用于線粒體相關(guān)酶活性的測定，線粒體制備需現(xiàn)提現(xiàn)用，否則會破壞線粒體完整性，使實驗結(jié)果不準(zhǔn)確。整個操作過程在冰浴條件下進(jìn)行。

1.2.5 呼吸強度、線粒體MDA、H2O2、O2-·含量的測定

1.2.5.1 呼吸強度的測定 每個處理取1.2 kg左右（約3個）西葫蘆果實，放入密封的玻璃罐中1 h，采用CO2呼吸測定儀測呼吸速率，結(jié)果表示為CO2mg·kg-1·h-1。計算公式如下：

式中：1.96×103表示CO2密度，mg/L；V表示玻璃罐體積，L；A%為CO2測定儀數(shù)值；t為測定時間，h；m為樣品重量，kg。

1.2.5.2 線粒體MDA含量的測定 MDA含量的測定參考Li等[14]的方法略有改動。將以“1.2.4”方法制備的線粒體懸浮液渦旋攪拌30 s，使線粒體懸浮液混合均勻，取1 mL線粒體懸浮液加入2 mL 0.67% TBA，混勻后于置于水浴鍋中100 ℃煮沸30 min，待冷卻后4 ℃、12000 g下離心5 min，棄去沉淀，取線粒體上清液分別測定其在波長532nm和600 nm波長處的吸光值。

式中：V表示提取樣品液體積，mL；Vs表示測定液體積，mL；m表示樣品質(zhì)量，g。

1.2.5.3 線粒體H2O2含量的測定 H2O2含量的測定參考曹健康等[11]的方法略有改動。取1 mL線粒體懸浮液加入0.1 mL 20%硫酸鈦和0.2 mL濃氨水，混勻后25 ℃保溫10 min后加入2 mol·L-1的硫酸3 mL，搖動使沉淀完全溶解，取上清液在測定其在波長415 nm處的吸光值。按照同樣的方法制作H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終的H2O2含量表示為μmol·g-1FW。

式中：n表示標(biāo)準(zhǔn)曲線查得樣品中H2O2濃度，μmol；V表示提取樣品液體積，mL；Vs表示測定液體積，mL；m表示樣品質(zhì)量，g。

1.2.5.4 線粒體O2-.產(chǎn)生速率的測定 O2-.含量的測定參考賈樂等[15]的方法略有改動。取1 mL線粒體懸浮液加入1 mL磷酸鈉緩沖液（pH7.8，50 mmol/L）和1 mL 1 mmol·L-1鹽酸羥胺溶液，混合均勻后在25 ℃下保溫20 min。取出后依次加入1 mL 17 mmol·L-1對氨基苯磺酸和1 mL mmol·L-1α-萘胺溶液，在25 ℃下再保溫30 min后進(jìn)行顯色反應(yīng)，測定在波長530 nm處的吸光值。最終的O2-.含量表示為nmol·min-1·g-1FW。

式中：n表示標(biāo)準(zhǔn)曲線查得樣品中O2-.物質(zhì)的量，nmol；V表示提取樣品液體積，mL；Vs表示測定液體積，mL；m表示樣品質(zhì)量，g；t表示反應(yīng)時間，min。

1.2.6 線粒體SOD、APX、LOX活性的測定

1.2.6.1 線粒體SOD活性的測定 SOD活性測定的方法參考Zheng等[16]的方法略有改動。取7支規(guī)格一致的試管，測定管、光下對照管各三支，暗中對照管1支，每管按照順序加入試劑，依次加入50 mmol·L-1磷酸緩沖液1.7 mL，130 mmol·L-1甲硫氨酸溶液0.3 mL，1 mmol·L-1EDTA溶液0.3 mL，130 mmol·L-1氮藍(lán)四唑溶液0.3 mL，1 mmol·L-1核黃素溶液0.3 mL，最后加入0.1 mL線粒體懸浮液，混勻后立刻將6支試管置于4000 lx燈下顯色反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后立即用黑布遮蓋終止反應(yīng)。以暗中對照管作為空白參比調(diào)零，測定其它管在560 nm處的吸光度值。SOD活性以每分鐘每克樣品反應(yīng)體系對NBT光化還原的抑制為50%為1個酶活力單位，結(jié)果用U·g-1FW表示。

1.2.6.2 線粒體APX活性的測定 APX活性測定方法參考Sharma等[17]的方法略有改動，反應(yīng)體系包含APX反應(yīng)液2.5 mL、0.2 mL線粒體懸浮液和0.3 ml 2 mmol·L-1H2O2溶液。立即測定在290 nm處的吸光值，每30 s記錄一次數(shù)值，記錄3 min內(nèi)的吸光值變化。APX的活性以每分鐘每克樣品吸光度變化0.01為1個酶活力單位，結(jié)果用U·g-1FW表示。

1.2.6.3 線粒體LOX活性的測定 LOX活性測定方法參考Mao等[18]的方法略有改動。3 mL反應(yīng)體系中包含2.75 mL乙酸鈉緩沖液（pH5.6，0.05 mol·L-1），0.15 mL亞油酸鈉底物和0.1 mL線粒體懸浮液。在234 nm處連續(xù)反應(yīng)3 min，每30 s計數(shù)一次，記錄3 min內(nèi)的吸光值變化。LOX的活性以每分鐘每克樣品吸光度變化0.01為一個酶活力單位，結(jié)果用U·g-1FW表示。

1.2.7 線粒體SDH、CCO、H+-ATPase和Ca2+-ATPase活性的測定

1.2.7.1 線粒體SDH活性的測定 SDH活性的測定參考Ackrell等[19]的方法稍作修改。取0.2 mL線粒體懸浮液，反應(yīng)體系包括2.6 mL磷酸鉀緩沖液（pH7.4，0.2 mol·L-1）、0.1 mL 0.9 mmol·L-12,6-二氯酚靛酚鈉（DCPIP）?；靹蚝笤?0 ℃條件下孵育5 min，測定前加0.1 mL 0.33% PMS混勻后，測定DCPIP在600 nm處的變化。

1.2.7.2 線粒體CCO活性的測定 CCO活性測定參照Errede等[20]的方法并稍作修改。反應(yīng)體系包括（2 mL蒸餾水、0.2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04%的細(xì)胞色素C、0.2 mL線粒體懸浮液），將混合液在經(jīng)過37 ℃、2 min的加熱之后，再加入0.4% N,N-二甲基對苯二胺溶液0.5 mL，混合均勻后再保溫3 min，在波長510 nm處測定吸光值的變化。CCO活性以每分鐘每克樣品吸光度變化0.01為一個酶活力單位，結(jié)果用U·g-1FW表示。

1.2.7.3 線粒體H+-ATPase和Ca2+-ATPase活性的測定 H+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性測定參考Jin等[21]的方法。H+-ATPase反應(yīng)體系中含有0.7 mL pH8.0 30 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液（含3 mmol·L-1MgSO4、50 mmol/LNaNO3、0.1 mmol·L-1Na3VO4、50 mmol·L-1KCl、0.1 mmol·L-1鉬酸銨）、0.1 mL線粒體懸浮液，待混勻后加入0.1 mL ATP-Tris（pH7.5，30 mmol·L-1）迅速啟動反應(yīng)，反應(yīng)在37 ℃保溫20 min，最后加入0.2 mL 55% TCA終止反應(yīng)。最終結(jié)果用無機磷含量表示，以每克樣品每小時釋放1 μmol無機磷所需要的酶量為1個酶活力單位。Ca2＋-ATPase活性測定方法類同H＋-ATPase。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)為三個生物學(xué)重復(fù)樣品的平均值。采用Excel 2021和SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析處理，并將P＜0.05定義為具有顯著性差異，采用Origin 2021軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 1-MCP處理對西葫蘆果實常溫貯藏中失重率、TSS、可溶性蛋白、總酚、VC含量的影響

1-MCP處理對西葫蘆果實失重率、TSS、可溶性蛋白、總酚和VC含量變化的影響見圖1。圖1A顯示，西葫蘆果實的失重率隨著貯藏時間持續(xù)上升，但1-MCP處理可顯著減少果實的失重（P＜0.05）。貯藏到第12 d時，對照西葫蘆果實的失重率為5.81%，處理僅為3.18%，對照組失重率是1-MCP處理組的1.83倍。因此，1-MCP處理對于降低西葫蘆果實的失重有效。

果實中的TSS可以在一定程度上反應(yīng)果實在貯藏期間品質(zhì)和成熟度的變化趨勢。由圖1B可知，西葫蘆果實TSS并不表現(xiàn)出持續(xù)下降的現(xiàn)象，而是呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，1-MCP處理果實在第3 d后與對照TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)產(chǎn)生顯著差異（P＜0.05），第9 d和第12 d 處理組TSS分別比對照組高了19.8%、16.5%，因此，1-MCP處理可延緩TSS的下降，保持果實品質(zhì)。

圖1 1-MCP處理對西葫蘆果實失重率（A）、TSS（B）、可溶性蛋白（C）、總酚（D）和VC（E）含量變化的影響Fig.1 Effects of 1-MCP treatment on weight loss rate (A), TSS (B), soluble protein (C), total phenol (D) and VC (E)contents of zucchini fruits

圖1C表明，對照組西葫蘆果實可溶性蛋白含量在0～3 d內(nèi)緩慢下降，在3 d后迅速下降，而1-MCP處理的果實可溶性蛋白含量下降趨勢較平緩，且在3～12 d內(nèi)的同一貯藏期內(nèi)，處理組含量顯著高于對照組（P＜0.05），在第3 d，對照可溶性蛋白含量2.32 mg·g-1，在12 d為1.03 mg·g-1，期間下降了55.58%，而處理可溶性蛋白含量僅下降了34.39%，因此，1-MCP處理抑制了西葫蘆果實可溶性蛋白的降解過程。

果蔬中酚類物質(zhì)的含量可以作為衡量抗氧化活性的指標(biāo)之一。圖1D表明，西葫蘆果實在貯藏期間總酚含量呈先上升后下降的趨勢。在貯藏第3 d和第9 d，對照組和處理組的總酚含量分別達(dá)到頂峰17.09、19.47 mg·100 g-1，而后開始下降，但在下降期間1-MCP處理的果實總酚含量依然顯著高于對照（P＜0.05），在貯藏12 d時處理組總酚含量是對照的1.44倍，故1-MCP處理延緩了西葫蘆果實總酚含量的下降。

VC作為重要的抗氧化物質(zhì)，在防止果實氧化方面起重要作用。如圖1E所示，VC含量隨著貯藏時間的延長不斷下降，且在貯藏期內(nèi)20 μL·L-11-MCP處理過的西葫蘆果實與對照組變化趨勢相同，在貯藏初期0～6 d緩慢下降，6～12 d下降速度明顯加快，在貯藏期間，1-MCP處理的西葫蘆果實VC含量顯著高于對照組西葫蘆，在貯藏的第9 d，處理果實VC含量分別為16.52 mg·100 g-1，比處理組高1.25 mg·100 g-1。因此，1-MCP處理減少了西葫蘆果實中VC的氧化。

2.2 1-MCP處理對西葫蘆果實常溫貯藏中呼吸強度、線粒體MDA、H2O2含量、O2-·產(chǎn)生速率的影響

呼吸是新陳代謝的主導(dǎo)過程，是采后最主要的生理活動，也是生命存在的重要標(biāo)志。貯藏期間1-MCP處理對西葫蘆果實呼吸影響見圖2A。由圖2A可知，貯藏期間西葫蘆果實的呼吸強度呈下降趨勢，且經(jīng)過1-MCP處理的西葫蘆果實其呼吸強度顯著低于對照果實（P＜0.05），且在每個取樣點對照組西葫蘆的呼吸強度均比處理組強10 mg·kg-1·h-1以上。如第3 d，處理組與對照組西葫蘆的呼吸強度分別為44.34、83.41 mg·kg-1·h-1，前者僅為后者的53.2%。這一結(jié)果表明，1-MCP對西葫蘆果實的呼吸作用影響巨大，抑制呼吸有利于減少呼吸消耗，進(jìn)而有利于果實品質(zhì)的保持。

圖2 1-MCP處理對西葫蘆果實呼吸強度（A）、線粒體MDA（B）、H2O2含量（C）、O2-·產(chǎn)生速率變化（D）的影響Fig.2 Effects of 1-MCP treatment on respiration intensity (A),mitochondrial MDA (B), H2O2 content (C) and O2-· (D)production rate of zucchini fruits

線粒體MDA積累是產(chǎn)生線粒體膜脂過氧化的主要原因，積累過多會影響果實生理代謝。1-MCP對西葫蘆果實線粒體MDA的影響如圖2B。由圖2B可知，貯藏期間西葫蘆果實線粒體MDA含量呈持續(xù)上升趨勢，在0～3 d內(nèi)上升速度較快，在貯藏3～12 d內(nèi)對照組果實的線粒體MDA含量顯著高于處理組（P＜0.05），如第6、9、12 d對照組的線粒體MDA含量分別是處理組的1.17、1.14、1.15倍，說明1-MCP處理能顯著抑制西葫蘆果實的線粒體MDA含量，減少膜脂過氧化程度，降低線粒體膜結(jié)構(gòu)損傷。

H2O2和O2-.是衡量ROS的重要指標(biāo)，由圖2C、圖2D可見，在同一貯藏期內(nèi)，線粒體H2O2和O2-.產(chǎn)生速率的變化趨勢都表現(xiàn)為先上升后下降，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，從第3 d開始，1-MCP處理的西葫蘆果實顯著抑制了線粒體內(nèi)H2O2和O2-.含量的升高，在貯藏第9 d，處理組線粒體H2O2的含量為1.21 μmol·g-1，比對照組低23.29%。對于O2-.來說，處理組O2-.的產(chǎn)生速率分別為12.65 nmol·g-1·min-1，低于對照西葫蘆果實10.51%。因此，1-MCP處理可以顯著抑制西葫蘆果實線粒體H2O2含量和O2-.產(chǎn)生速率，減少了果實組織內(nèi)ROS含量，對保持果蔬品質(zhì)具有重要作用。

2.3 1-MCP處理對西葫蘆果實常溫貯藏中線粒體SOD、APX、LOX活性的影響

SOD、APX是抗氧化物酶，是清除ROS自由基的主要酶，在保持ROS代謝平衡中發(fā)揮著重要作用。如圖3A所示，西葫蘆果實線粒體SOD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在貯藏中期（3～9 d），1-MCP處理的西葫蘆果實線粒體SOD活性顯著高于對照組（P＜0.05），而在前期和末期沒有顯著差異（P＜0.05），推測可能SOD在貯藏中期發(fā)揮的清除ROS的能力較大。貯藏至第3 d和第6 d，處理組線粒體SOD活性是對照組的1.23、1.15倍。1-MCP處理對西葫蘆果實線粒體APX的影響如圖3B所示，APX活性變化趨勢表現(xiàn)為先上升后下降，且處理組和對照組一致，在第3 d達(dá)到高峰，在貯藏中期（3～6 d）和末期第12d處理組與對照組呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05），第3 d、第6 d的處理組APX活性分別為3.1、2.44 U·g-1，比對照高了0.37、0.34 U·g-1。因此，1-MCP處理對采后西葫蘆果實線粒體SOD、APX活性的下降有延緩作用，增強系統(tǒng)抗氧化能力，減少氧化損傷。

圖3C表明，西葫蘆果實線粒體LOX活性在貯藏期間持續(xù)上升，在第9 d和第12 d，對照組果實線粒體LOX活性為43.2、44.27 U·g-1，較第3 d上升了13.6、14.67 U·g-1。1-MCP處理的西葫蘆果實線粒體LOX活性在貯藏期間始終低于對照組，且從第3 d開始，對照組線粒體LOX活性與處理組出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。因此，1-MCP處理抑制了西葫蘆果實線粒體LOX活性的上升。

圖3 1-MCP對西葫蘆果實線粒體SOD（A）、APX（B）和LOX（C）活性的影響Fig.3 Effects of 1-MCP on the SOD (A), APX (B) and LOX(C) activities in mitochondria of zucchini fruits

2.4 1-MCP處理對西葫蘆果實常溫貯藏中SDH、CCO、H+-ATPase和Ca2+-ATPase活性的影響

SDH是線粒體能量代謝的關(guān)鍵酶，是三羧酸循環(huán)（TCA）的關(guān)鍵酶。如圖4A所示，貯藏期間SDH活性呈波動狀態(tài)，且1-MCP處理西葫蘆果實的SDH活性始終顯著高于同時間的對照（P＜0.05）。SDH活性在第3 d達(dá)到最高峰，處理組和對照組分別為0.98、0.79 U·g-1，是貯藏末期（12 d）活性的2.36和4.33倍。CCO是電子傳遞鏈末端的氧化酶，也是能量代謝中的關(guān)鍵酶。如圖4B所示，其變化趨勢與SDH相似，其中對照組果實CCO活性下降較明顯，值得注意的是，處理組果實CCO活性在貯藏期間都顯著高于對照組（P＜0.05）。如在貯藏第6 d，對照組CCO活性為3.76 U·g-1，僅為處理組的21.45%。1-MCP處理能夠保持西葫蘆果實SDH、CCO活性在貯藏期間處于較高水平。

圖4 1-MCP處理對西葫蘆線粒體SDH（A）、CCO（B）、H+-ATPase（C）和Ca2+-ATPase（D）活性的影響Fig.4 Effects of 1-MCP on SDH (A), CCO (B), H+-ATPase (C)and Ca2+-ATPase (D) activity of zucchini fruits

1-MCP處理對西葫蘆果實的H+-ATPase和Ca2+-ATPase活性影響如圖4C、圖4D所示，在貯藏期間活性變化趨勢呈波動狀態(tài)，這與前面提到的SDH與CCO活性的變化趨勢是保持一致的，且與CCO活性變化趨勢相同，在貯藏的第6 d達(dá)到最高點。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，第6 d處理組果實的H+-ATPase和Ca2+-ATPase分別是對照組的1.05和1.22倍。H+-ATPase在貯藏期第3 d到貯藏末期（12 d），對照組活性變化顯著低于處理組（P＜0.05），而對照組Ca2+-ATPase活性在整個貯藏期內(nèi)都顯著低于處理組（P＜0.05）。

2.5 相關(guān)性分析

如表1相關(guān)性數(shù)據(jù)分析可知，采后西葫蘆果實的呼吸強度與總酚呈顯著性負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與SOD呈極顯著性負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；TSS與可溶性蛋白、VC、總酚、SOD、APX、SDH都呈現(xiàn)顯著性正相關(guān)（P＜0.05），與線粒體MDA、LOX呈極顯著性負(fù)相關(guān)（P＜0.01），VC與MDA、LOX呈極顯著性負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；MDA與LOX呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與APX、SDH呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；實驗結(jié)果表明，1-MCP處理西葫蘆果實采后品質(zhì)與線粒體抗氧化和能量代謝的關(guān)系極為密切。

表1 1-MCP處理西葫蘆果實采后各項生理指標(biāo)的相關(guān)性Table 1 Correlation of physiological indexes of postharvest zucchini fruits treated by 1-MCP

3 討論

3.1 1-MCP處理對西葫蘆果實采后生理品質(zhì)的影響

常溫貯藏期間，營養(yǎng)物質(zhì)會隨著貯藏時間的延長不斷損失，果實出現(xiàn)萎縮、組織松軟、內(nèi)容物流出等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響商品價值。本實驗研究表明，1-MCP處理可以降低西葫蘆果實呼吸強度，減少失水，這與前人的研究結(jié)果一致[22]。西葫蘆果實的TSS變化趨勢為先上升后下降，表明可能是西葫蘆果實在貯藏初期過程中呼吸作用強消耗能量，導(dǎo)致失水，可溶性固形物含量出現(xiàn)短暫上升趨勢?？扇苄缘鞍滓彩呛饬抗麑嵆墒焖ダ系闹匾笜?biāo)，是絕大多數(shù)果蔬主要的底物和能量物質(zhì)[23]，本實驗結(jié)果表明1-MCP處理保持了西葫蘆果實可溶性蛋白的含量，這與李君蘭等[24]的研究結(jié)果一致。許多研究結(jié)果表明[25-26]，酚類物質(zhì)和VC是果實中重要的抗氧化物質(zhì)，通過非酶促代謝參與著機體內(nèi)抗氧化過程，在清除ROS自由基方面具有重要作用。相關(guān)性分析的結(jié)果顯示：VC與MDA呈極顯著性負(fù)相關(guān)、與APX呈極顯著性正相關(guān)，總酚與SOD呈極顯著性正相關(guān)（P＜0.01），表明VC抑制MDA的積累，并且和總酚一同作為抗氧化物質(zhì)與SOD、APX協(xié)同作用參與機體內(nèi)抗氧化過程。本研究結(jié)果表明，1-MCP處理能夠保持西葫蘆較高的TSS、總酚和VC含量，減少貯藏期間的損失。綜上所述，1-MCP在貯藏期間降低了西葫蘆果實呼吸強度、失重率，維持了TSS、可溶性蛋白、總酚、VC的含量，保持了果實良好的品質(zhì)。

3.2 1-MCP處理對西葫蘆果實線粒體抗氧化作用的影響

ROS與果蔬成熟衰老密切相關(guān)，其一方面它協(xié)助細(xì)胞進(jìn)行正常的生理活動，另一方面它的積累會引起線粒體內(nèi)膜通透性、膜內(nèi)氧化還原電勢降低，引起膜脂過氧化，對細(xì)胞器造成嚴(yán)重的損傷，破壞線粒體的完整性；ROS還參與線粒體凋亡、細(xì)胞分化及基因表達(dá)的調(diào)控[27]。當(dāng)然，線粒體中也存在SOD、CAT、APX等去消除ROS產(chǎn)生的損傷，如SOD，其作為抗氧化的第一道防線，能催化超氧化物如O2-·分解生成水（H2O）和氧氣（O2）[28]，CAT的作用是分解過氧化氫H2O2生成H2O，APX可以催化分解抗壞血酸鹽[29]。線粒體內(nèi)多種抗氧化物酶相互協(xié)作，共同抵御ROS，保護(hù)線粒體膜結(jié)構(gòu)和功能，從而保持線粒體膜的氧化平衡和膜結(jié)構(gòu)完整性。前人研究表明，15 μmol·L-1一氧化氮（NO）處理可以減少冷藏桃果實線粒體ROS含量的累積，保持較高的SOD、CAT、POD的活性[30]。本研究中，在貯藏期間H2O2含量和O2-·產(chǎn)生速率均是對照組較處理組高，且1-MCP處理也保持了線粒體較高的SOD、APX的活性，推測是1-MCP通過提高果實線粒體SOD、APX的活性，抑制ROS的積累，維持ROS平衡。這一結(jié)果與胡珊等[31]的報道一致。LOX是引起膜脂過氧化作用的重要酶，根據(jù)相關(guān)性分析的結(jié)果顯示，MDA與APX呈極顯著性正相關(guān)、與LOX呈極顯著性正相關(guān)（P＜0.01），表明西葫蘆果實線粒體內(nèi)的抗氧化物酶APX參與抗氧化過程，抑制了MDA含量的上升，且線粒體MDA的含量會影響膜脂過氧化程度高低。本研究結(jié)果表明，1-MCP處理能有效抑制LOX活性的上升，延緩西葫蘆線粒體MDA含量的上升，表明1-MCP減輕西葫蘆膜脂過氧化作用明顯，這與Jing等[32]的研究結(jié)果一致。綜上所述，與對照組相比，1-MCP處理可以提高西葫蘆果實線粒體抗氧化酶SOD、APX的活性，降低LOX活性，清除線粒體過多的ROS、減少MDA的積累，降低膜結(jié)構(gòu)損傷，保持線粒體內(nèi)氧化還原平衡，保持線粒體正常功能。

3.3 1-MCP處理對西葫蘆果實線粒體能量代謝的影響

線粒體是能量產(chǎn)生的主要場所，SDH、CCO都是線粒體內(nèi)膜上的標(biāo)志酶，其活性能反映線粒體能量狀態(tài)，SDH在TCA中將琥珀酸轉(zhuǎn)變?yōu)檠雍魉幔瑸楹粑溙峁╇娮舆M(jìn)行產(chǎn)能[33]。CCO作為電子傳遞鏈末端的酶，具有質(zhì)子泵的作用可將H+泵到膜間，同時能將電子從細(xì)胞色素C傳遞給O2，在電子傳遞過程中生成大量ATP，用于生物體內(nèi)各種生命活動[8]。ATP的生成與能量代謝相關(guān)酶密不可分，線粒體膜結(jié)構(gòu)和功能的損傷會使得這些酶的活性受到影響，使得果蔬在采后出現(xiàn)氧化脅迫、呼吸鏈?zhǔn)軗p，造成ATP合成速度減慢、細(xì)胞能量供應(yīng)不足、代謝紊亂，細(xì)胞出現(xiàn)死亡[28]。H+-ATPase是細(xì)胞膜質(zhì)子泵，泵出H+在膜內(nèi)外產(chǎn)生電化學(xué)梯度，產(chǎn)生跨膜電動勢，催化ATP的生成，Ca2+-ATPase是線粒體內(nèi)膜Ca2+泵，維持膜內(nèi)外Ca2+的平衡，若Ca2+平衡被打破，則會導(dǎo)致線粒體膜受損，引發(fā)線粒體功能障礙[34]。本研究結(jié)果表明，在貯藏前期，西葫蘆果實的SDH、CCO、H+-ATPase、Ca2+-ATPase有一個上升的過程，這可能是由于前期果實在面對逆境脅迫所表現(xiàn)出的為抵御脅迫刺激能量上升的應(yīng)激反應(yīng)，在貯藏后期，西葫蘆果實的SDH、CCO、H+-ATPase、Ca2+-ATPase活性隨貯藏時間都呈現(xiàn)下降的趨勢，這是由于線粒體ROS爆發(fā)，線粒體膜完整性被破壞，相關(guān)酶活性降低，線粒體功能受到損傷、果實組織逐漸衰老。1-MCP處理提高了SDH、CCO、H+-ATPase、Ca2+-ATPase活性，保持正常的能量供應(yīng)，保證機體正常生命活動。研究表明NO處理可以維持桃果實貯藏期間SDH、CCO的活性，且能量不足會產(chǎn)生更多的ROS攻擊細(xì)胞膜，因此，維持果實內(nèi)高能量水平對保持果實品質(zhì)具有重要的作用[35]。此外，能量代謝與抗氧化代謝還存在密切的關(guān)系，根據(jù)相關(guān)性分析的結(jié)果顯示，SDH與果實品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)TSS、可溶性蛋白、總酚、VC呈極顯著性正相關(guān)、與抗氧化物酶SOD、APX呈極顯著性正相關(guān)、與LOX呈極顯著性負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。這表明維持能量水平可以保持果實品質(zhì)，并可能從一定水平上調(diào)節(jié)誘導(dǎo)抗氧化物酶的活性，從而調(diào)控果實成熟衰老，這與前人的研究結(jié)果一致[36]。

4 結(jié)論

20 μL·L-11-MCP處理對西葫蘆果實的品質(zhì)和生理生化特性的影響主要表現(xiàn)在：1-MCP處理可以抑制西葫蘆果實生理活動，降低呼吸強度和失重率，減少TSS、可溶性蛋白含量的損失，維持較高的總酚、VC等抗氧化物質(zhì)含量，有利于保持果實良好的品質(zhì)，延緩衰老。更深入地分析發(fā)現(xiàn)，20 μL·L-1的1-MCP處理可以抑制果實線粒體ROS含量的上升，延緩MDA、LOX上升，保持線粒體抗氧化物酶SOD、APX的活性，減輕膜脂過氧化，保護(hù)線粒體膜免受損傷；在能量水平上，20 μL·L-11-MCP處理還能保持西葫蘆果實線粒體能量代謝酶SDH、CCO、H+-ATPase、Ca2+-ATPase的活性，維持果實組織的正常能量代謝。以上研究結(jié)果為1-MCP處理應(yīng)用于果蔬采后保鮮方面提供了理論依據(jù)，今后的努力方向應(yīng)從分子水平上對1-MCP調(diào)控成熟衰老機理進(jìn)行深入研究。