QuEChERS-UPLC-MS/MS檢測餐飲小龍蝦中5種生物堿

俞 靈，宋立華

（1.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海 200240；2.上海市食品藥品檢驗研究院，上海 201203）

罌粟殼為罌粟科植物罌粟（Papaver somniferum）采完阿片后干燥成熟的果殼，含有20多種生物堿，其中以嗎啡、那可丁、罌粟堿、可待因及蒂巴因等為主要生物堿成分[1]。食用添加罌粟殼的食品會使人產(chǎn)生某種程度的愜意和欣快感。一些不法商家和飯店為謀取暴利，在火鍋、麻辣燙、牛肉粉及烤禽類等的湯料和輔料中添加罌粟殼、罌粟籽及其水浸物等違禁原料，使食物味道鮮美，以吸引更多的食客。消費者長期食用含有罌粟殼等類似物質的食物不但容易成癮，還會對人體神經(jīng)系統(tǒng)造成損害，并可能造成慢性中毒[2]。鑒于其危害，中國衛(wèi)生部于2008年將罌粟殼列于《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》[3]中，國家多次明令禁止在食品中違法添加，有關部門也要求嚴厲查處，嚴格監(jiān)管。因此，針對不同種類的食品，建立準確檢測罌粟殼或其類似物中主要生物堿的分析方法，可為保證食品安全提供技術支持。

目前，關于生物堿的測定主要有分光光度法[4]、薄層色譜法[5]、氣相色譜法[6-7]、高效液相色譜法[8-9]，但這些方法靈敏度較低，檢測限高。生物堿分析常用的樣品前處理方法主要有氯仿萃取法[10]、甲醇超聲法[11]和固相萃取法等[12-14]，但是方法復雜繁瑣。近幾年有研究采用QuEChERS方法進行前處理[15]，利用氣相色譜-質譜[16-17]或液相色譜-質譜聯(lián)用法進行分析[18-22]，但多是圍繞經(jīng)常食用的火鍋底料或食品湯料中生物堿的檢測[23-27]。小龍蝦作為日常餐飲中較受大眾歡迎的食品，其季節(jié)性較強，小龍蝦富含蛋白質，且餐飲小龍蝦一般都含有較多油脂和辛香料，食品基質復雜，因此目前針對餐飲小龍蝦中罌粟堿等生物堿的檢測尚未引起關注，關于這類樣品中生物堿的含量檢測報道不多。食品基質、色譜分析條件及前處理方法等均會影響方法的檢出限及靈敏度。因此，本研究旨在建立可用于測定餐飲小龍蝦中嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因、那可丁5種生物堿含量的QuEChERS-UPLC-MS/MS分析方法，為富含蛋白質及油脂類等基質樣品中上述5種生物堿的檢測提供可參考的技術數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小龍蝦熟制品 購于川沙夜市攤，分別來自三個攤位，每個攤位三種口味（蒜蓉、麻辣、十三香），每種口味各500 g；嗎啡（純度99.1%）、可待因（純度99.6%）、罌粟堿（純度100%）、蒂巴因（純度100%）、那可?。兌?00%） 標準品，中國生物制品檢定研究院；嗎啡-D3（濃度1 mg/mL）、可待因-D3（濃度1 mg/mL） 美國Cerilliant公司；甲醇、乙腈、甲酸

均為色譜純，美國Merck公司；甲酸銨（色譜純）美國Sigma-Aldrich公司；氯仿、石油醚（60～90 ℃）、氨水、甲醇、鹽酸、氫氧化鈉 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；MCX柱 美國Waters公司；QuEChERS粉末（6 g無水硫酸鎂與1.5 g無水醋酸鈉的混合粉末） 北京艾杰爾科技有限公司；0.22 μm尼龍濾膜 天津津騰公司。

API4000質譜儀 美國AB SCIEX公司；Acquity UPLC超高效液相色譜儀、ACQUITY UPLCTM BEH HILIC色譜柱（1.7 μm，2.1×100 mm）、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（1.7 μm，2.1×100 mm）、MCX柱 美國Waters公司；MS3渦旋振蕩器 德國IKA公司；5810R離心機 德國Eppendorf公司；B9500S超聲處理器 上海Branson公司；超純水機 Millipore公司；電子天平 Sartorius公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的制備 標準儲備液：精密稱取罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡和可待因標準品適量，用0.5%甲酸-甲醇溶液配制成罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡和可待因濃度均為1.0 mg/mL的標準儲備液。

混合標準液A：精密吸取濃度為1.0 mg/mL的罌粟堿、那可丁、蒂巴因儲備液各0.1 mL和濃度為1.0 mg/mL的嗎啡、可待因儲備溶液各0.5 mL于20 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，即得含罌粟堿、那可丁、蒂巴因濃度為5 μg/mL和嗎啡、可待因濃度為25 μg/mL的混合標準溶液A。

混合標準液B：精密吸取混合標準溶液A 0.3 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，即得含鹽酸罌粟堿、那可丁、蒂巴因濃度為150 ng/mL和嗎啡、可待因濃度為750 ng/mL的混合標準溶液B。

同位素內標混合工作溶液（5.0 μg/mL）：分別精密吸取嗎啡-D3、可待因-D3內標物質（濃度均為1 mg/mL）各1 mL置于200 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到嗎啡-D3、可待因-D3的濃度均為5.0 μg/mL的混合內標溶液。

標準曲線溶液的制備：5種生物堿標準品分別用乙腈稀釋，其中罌粟堿、那可丁、蒂巴因濃度分別為1～50 ng/mL，以罌粟堿、蒂巴因和那可丁的色譜峰面積為縱坐標，罌粟堿、蒂巴因和那可丁的濃度為橫坐標繪制標準工作曲線；嗎啡、可待因采用內標定量法（注：由于基質效應的影響），二者濃度范圍為5～250 ng/mL（準確移取上述嗎啡-D3、可待因-D3同位素內標混合工作溶液，加入制作標準曲線的溶液中，內標的質量濃度均為50.0 ng/mL），以嗎啡和可待因的色譜峰與相應內標物面積的比值為縱坐標，嗎啡和可待因的濃度為橫坐標繪制標準工作曲線（見表1）。

表1 標準曲線線性范圍（ng/mL）Table 1 Linear range of standard curve concentration range(ng/mL)

1.2.2 樣品前處理 取小龍蝦樣品，去殼，攪碎，混勻，稱取2.0 g（精確到0.001 g），分別采用如下提取方法：

方法一（70%甲醇-氯仿提取法）[11]：于50 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，加入70%甲醇20 mL，超聲處理30 min，放入離心機中，以4000 r/min的轉速離心5 min，移取上清液，上清液蒸干，用0.1 mol/L的鹽酸20 mL溶解，轉移至分液漏斗中，加入石油醚（60～90 ℃）20 mL，振搖，棄去石油醚相，水相用氨水調節(jié)pH至9，用氯仿提取2次，每次20 mL，合并氯仿液，氯仿液蒸干，用甲醇溶解并定容至10 mL。0.22 μm濾膜過濾，取濾液待測。

方法二（0.1 mol/L的鹽酸-氯仿提取法）[10]：于50 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，加0.1 mol/L的鹽酸20 mL，超聲處理30 min，放入離心機中，以4000 r/min的轉速離心5 min，移取上清液，上清液轉移至分液漏斗中，加入石油醚（60～90 ℃）20 mL，振搖，棄去石油醚相，水相用氨水調節(jié)pH至9，用氯仿提取2次，每次20 mL，合并氯仿液，蒸干，用甲醇溶解并定容至10 mL。0.22 μm濾膜過濾，取濾液待測。

方法三（0.1 mol/L的鹽酸-固相萃取法）[28]：于50 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，加0.1 mol/L的鹽酸20 mL，超聲處理30 min，放入離心機中，以4000 r/min的轉速離心5 min，移取上清液，上清液轉移至分液漏斗中，加入石油醚（60～90 ℃）20 mL，振搖，棄去石油醚相，水相以3 mL/min通過MCX柱（先用3 mL甲醇，3 mL 0.1 mol/L的HCl活化），分別用10 mL 1 mol/L的HCl、20 mL 50%甲醇淋洗，再用含5%氨水的甲醇20 mL洗脫，蒸干，用甲醇溶解并定容至10 mL。0.22 μm濾膜過濾，取濾液待測。

方法四（QuEChERS法）[29]：于50 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，加入嗎啡-D3、可待因-D3混合內標溶液150 μL，再加入10 mL 0.1 mol/L的鹽酸，渦旋1 min，超聲處理30 min，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH呈中性，加入15 mL乙腈，劇烈震蕩渦旋1 min，再加入6 g無水硫酸鎂和1.5 g無水醋酸鈉的混合粉末，渦旋混合1 min，放入離心機中，以4000 r/min的轉速離心5 min，移取上清液，0.22 μm濾膜過濾，取濾液待測。

1.2.3 色譜條件 ACQUITY UPLCTM BEH HILIC色譜柱（1.7 μm，2.1×100 mm）；流動相：A為含0.1%甲酸的乙腈，B為含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨溶液；柱溫：室溫；進樣量：5 μL；流速：0.3 mL/min；梯度洗脫條件如表2所示。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure

1.2.4 質譜條件離子源 電噴霧離子（ESI）源；正離子掃描模式；霧化氣、氣簾氣、輔助氣、碰撞氣均為高純氮氣（大于99.999%）；霧化氣壓力：50 psi；氣簾氣壓力：22 psi；去溶劑氣壓力：45 psi；噴霧電壓：5500 V；去溶劑溫度：500 ℃；碰撞氣壓力：5 psi；離子駐留時間：均為50 ms；各化合物的檢測離子對、去簇電壓（DP值）、碰撞能量（CE值）等質譜參數(shù)如表3所示（為本實驗室前期建立的實驗條件）[15]；使用前應調節(jié)各參數(shù)使質譜靈敏度達到檢測要求，儀器條件的設置可參考文獻[15]。

表3 5種生物堿的保留時間、定性離子對、定量離子對和碰撞能量信息[15]Table 3 Retention time, qualitative ion pair, quantitative ion pair and collision energy information of five poppy shell alkaloids[15]

1.2.5 定性和定量分析 定性：在相同實驗條件下測定標準溶液和樣品溶液，若樣品溶液中檢出色譜峰的保留時間與相應標準溶液色譜峰的保留時間一致，且樣品溶液的質譜離子對相對豐度與濃度相當標準溶液的質譜離子對相對豐度相比較，參考其它食品檢測標準中相對離子豐度的最大允許偏差的數(shù)值，以及歐盟對農(nóng)藥殘留測定法中有關液相色譜-串聯(lián)質譜法定性判斷的標準，相對離子豐度（k）的相對偏差不超過表4規(guī)定的范圍，則可判定樣品中存在該組分。

表4 定性確定時相對離子豐度的最大允許偏差Table 4 Maximum allowable deviation of relative ion abundance in qualitative determination

定量：罌粟堿、那可丁和蒂巴因采用外標法定量；嗎啡和可待因采用內標法定量。

1.2.6 回收率實驗 對實驗用的9份小龍蝦樣品各稱取2 g，分別加入混合標準溶液A（罌粟堿、那可丁、蒂巴因濃度為5 μg/mL和嗎啡、可待因濃度為25 μg/mL）30 μL，按照1.2.2中的方法四（QuEChERS法）進行樣品前處理，以內標法計算嗎啡、可待因的回收率，外標法計算罌粟堿、那可丁和蒂巴因的回收率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

UPLC-MS/MS數(shù)據(jù)采集使用AB SCIEX Analyst software軟件，處理數(shù)據(jù)和繪圖采用g GraphPad Prism軟件（version 7，San Diego，CA）；所有實驗均重復三次，結果以平均值±SD表示。

按下式計算小龍蝦中的罌粟堿等的含量。

式中：X表示試樣中各待測物的含量（μg/kg）；c表示從標準曲線中讀出的供試品溶液中各待測物的濃度（μg/L）；V表示樣液的提取體積（L）；M表示試樣的質量（g）；f表示樣液稀釋因子。

2 結果與分析

2.1 液相色譜-串聯(lián)質譜條件的確定

2.1.1 色譜柱的選擇 分別采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（1.7 μm，2.1×100 mm）、ACQUITY UPLCTM BEH HILIC色譜柱（1.7 μm，2.1×100 mm）進行測定，結果在酸性流動相（以含0.1%甲酸為水相）的條件下，嗎啡、可待因在C18色譜柱上無保留，但在HILIC色譜柱上保留能力較強；在中性流動相（以10 mmol/L甲酸銨為水相）的條件下，嗎啡、可待因在C18色譜柱上峰形拖尾，但在HILIC色譜柱上峰形對稱。罌粟堿、那可丁、蒂巴因在兩種色譜柱上均有較好的保留能力和峰形。綜合上述結果，采用HILIC色譜柱進行分析。

2.1.2 流動相的選擇 經(jīng)預實驗發(fā)現(xiàn)，在HILIC色譜柱上，流動相中含甲酸銨時，可顯著改善各待測化合物的峰形，且甲酸銨的濃度變化對結果影響不大；流動相中的甲酸可延長罌粟堿、那可丁的保留時間，改善那可丁的峰形；流動相中乙腈的含量可顯著影響各待測物的保留時間，通過調節(jié)乙腈的濃度，可使嗎啡、可待因達到基線分離，有利于定性結果的判斷。最終確定流動相組成為：含0.1%甲酸的乙腈及含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨溶液進行梯度洗脫。

2.1.3 質譜條件的選擇 罌粟堿等5種生物堿的電噴霧離子化效果均較好，故采用電噴霧離子化源進行分析。將0.2 μg/mL的標準溶液（利用注射泵設置流速為5 μL/min）通過三通管與流動相（流速為0.3 mL/min）匯合后注入到離子源中，在正離子模式下掃描，結果得到各待測組分的準分子離子峰。然后對各準分子離子峰分別進行掃描，選擇響應最高時的DP值（去簇電壓）后再進行子離子掃描，得到碎片離子信息。在MRM模式下，對各個子離子進行掃描，選取響應最高的CE值（碰撞氣能量）后再分別對質譜中的離子噴霧電壓、霧化氣、干燥氣流速溫度等質譜參數(shù)進行優(yōu)化。

綜合上述結果，采用以含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨和含0.1%甲酸的乙腈為流動相，利用HILIC色譜柱進行分析。根據(jù)上述分析條件形成的標準溶液總離子流（TIC）圖譜如圖1所示，五種生物堿分離效果良好。

圖1 嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因總離子流（TIC）圖譜Fig.1 Total ion chromatograms of morphine, codeine,papaverine, noscapine and thebaine

2.2 樣品前處理方法的確定

針對本研究所采用的四種前處理方法，利用樣品加標實驗對比考察提取效果，結果如圖2所示：方法三（鹽酸-固相萃取法）回收率最低，方法一（甲醇-氯仿提取法）和方法二（鹽酸-氯仿提取法）雖回收率高于方法三，但操作較為繁瑣，且試劑氯仿毒性較大，整體上方法四（QuEChERS法）回收率及重復性均優(yōu)于其他三種方法，最終選用1.2.2中的方法四（QuEChERS法）作為樣品的前處理方法。

圖2 不同提取方法提取率比較Fig.2 Comparison of extraction rates of different extraction methods

2.3 定量分析方法的選擇

為比較常用外標定量分析方法在5種生物堿中的應用效果，對實驗用的9份樣品各稱取2 g，分別加入混合標準溶液A（罌粟堿、那可丁、蒂巴因濃度為5 μg/mL和嗎啡、可待因濃度為25 μg/mL）30 μL，按照1.2.2中的方法四（QuEChERS法）進行樣品前處理，以外標法定量分析回收率。結果表明，嗎啡和可待因的回收率范圍為30%～80%，罌粟堿、那可丁和蒂巴因的回收率為80%～110%（圖3）。說明利用外標法定量分析嗎啡和可待因受樣品基質效應影響較明顯，而罌粟堿、那可丁和蒂巴因的基質效應較小。

圖3 5種生物堿成分外標法定量的回收率Fig.3 Recovery rate of five alkaloids by external standard method

由于餐飲小龍蝦為熟制品，富含油脂及各種調味料，且不同商家及口味其制作工藝也有區(qū)別，基質比較復雜，其中存在非揮發(fā)性組分與待測物質，在霧滴表面離子化的過程中產(chǎn)生競爭，影響電噴霧接口處的離子化效率，可能會增強或抑制被分析物離子的形成效率，產(chǎn)生基質增強或抑制效應，成為影響方法靈敏度和準確度的關鍵因素。為消除基質效應的影響，外標法一般可以通過稀釋樣品后進樣分析或采用標準加入法。但是稀釋樣品溶液會影響方法檢測的靈敏度；如采用標準加入法，基質的影響會使結果的重復性較差。嗎啡和可待因均可獲得到商品化的同位素內標。因此，本方法可采用內標法定量分析嗎啡和可待因，采用外標法定量分析罌粟堿、那可丁和蒂巴因，以同時兼顧檢測要求、實際可操作性及檢測成本。

按照1.2.2方法四（QuEChERS法）及1.2.6回收率測定方法進行樣品前處理，以內標法計算嗎啡、可待因的回收率，外標法計算罌粟堿、那可丁和蒂巴因的回收率，結果如圖4所示，五個化合物回收率范圍均在80%～110%之間。

2.4 方法學驗證

2.4.1 標準曲線線性范圍 標準曲線線性范圍如表5所示，本實驗方法嗎啡、可待因線性濃度范圍為5～250 ng/mL，罌粟堿、那可丁、蒂巴因線性濃度范圍為1～50 ng/mL，線性范圍內峰面積和進樣濃度（ng/mL）呈良好的線性關系，相關系數(shù)均大于0.995，說明各目標化合物在線性范圍內有很好的相關性。

表5 5種生物堿定量分析線性范圍Table 5 Linear range of quantitative analysis of five alkaloids

2.4.2 檢出限、定量限的確定 利用空白對照樣品添加5種罌粟殼生物堿確定檢出限、定量限，以3倍信噪比的檢測濃度為方法檢出限（LOD），以10倍信噪比的檢測濃度為定量限（LOQ），結果表明罌粟堿檢出限為0.6 μg/kg，定量限為2.0 μg/kg；那可丁檢出限為0.7 μg/kg，定量限為2.5 μg/kg；蒂巴因檢出限檢出限為0.8 μg/kg，定量限為2.7 μg/kg；嗎啡檢出限為3.7 μg/kg，定量限為12.4 μg/kg；可待因檢出限為2.7 μg/kg，定量限為9.3 μg/kg（表6）。

表6 五種生物堿檢出限及定量限Table 6 Detection limit and quantitative limit of five alkaloids

2.4.3 準確度和精密度分析 以準確度和精密度評價方法的有效性，稱取18份樣品（每份質量為2.0 g，n=6），分別設置了低、中、高3個濃度水平的回收實驗，每個濃度水平進行6次平行實驗?；厥章式Y果如表7所示，從表中數(shù)據(jù)可看出加標回收實驗回收率均在80%～110%之間，RSD在0.06%～8.20%之間，表明本方法具有較好的準確度和精密度。

表7 準確度與精密度結果（n=6）Table 7 Accuracy and precision results (n=6)

2.5 實際樣品測定結果

為驗證QuEChERS-UPLC-MS/MS方法檢測餐飲小龍蝦中5種生物堿的可行性，從川沙夜市攤購買了9份小龍蝦熟制品，以本實驗建立的檢測方法進行分析，結果均未檢出罌粟堿等5種待測組分，說明當?shù)匾故袛傂↓埼r制品未有非法添加罌粟殼、罌粟籽及其水浸物等違禁原料。

3 討論

首先，在樣品前處理方面，蒂巴因、可待因、罌粟堿、那可丁均屬于堿性有機毒物，與酸作用能生成易溶于水的鹽，嗎啡屬于兩性有機毒物，在酸性或堿性水溶液中均易成為溶于水的鹽類，呈游離狀態(tài)時能溶于乙腈等有機溶劑。本方法比較了鹽酸-固相萃取法、甲醇-氯仿提取法、鹽酸-氯仿提取法及QuEChERS法對這五種生物堿的提取效果，結果表明鹽酸-固相萃取法（MCX柱）提取率最低，QuEChERS提取效果較好，這與胡爭艷等[30]利用QuEChERS法提取含油脂類較多的火鍋樣品的結果有所不同，表明相同的提取方法，當食品基質不同時，提取效果有所不同，因此對于不同類型基質的樣品，應選擇合適的快速提取方法。

其次，在色譜分離的固定相選擇方面，嗎啡、可待因均為強極性化合物，目前已有將BEH HILIC柱用于嗎啡、可待因、罌粟堿等物質的液-質聯(lián)用分析[30-31]，本研究進一步對比了常用色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（1.7 μm，2.1×100 mm）與HILIC色譜柱（1.7 μm，2.1×100 mm）對5種生物堿的分離效果，結果表明罌粟堿、那可丁、蒂巴因在兩種色譜柱上均有較好的保留行為，但嗎啡、可待因在C18色譜柱上無保留，因此，若同時檢測小龍蝦中5種生物堿成分，采用親水色譜柱（HILIC）效果較好。在流動相方面，目前對于檢測罌粟堿類化合物，大都選用10 mmol/L甲酸銨-乙腈體系的酸性流動相[30,32]。本試驗以0.1%甲酸為水相時，發(fā)現(xiàn)嗎啡、可待因在C18色譜柱上無保留，但在HILIC色譜柱上保留能力較強；以中性流動相甲酸銨（10 mmol/L）為水相時，嗎啡、可待因在C18色譜柱上峰形拖尾，而在HILIC色譜柱上峰形對稱。罌粟堿、那可丁、蒂巴因在兩種色譜柱上均有較好的保留能力和峰形，綜合五種生物堿的保留行為，本方法選用0.1%甲酸的乙腈和含0.1%甲酸的甲酸銨（10 mmol/L）溶液為流動相，采用HILIC色譜柱進行分析可獲得較好的分離效果。

本方法的檢出限可達到0.6～3.7 μg/kg之間，定量限為2.0～12.4 μg/kg，此外，采用內標法定量分析嗎啡、可待因的線性濃度范圍為5～250 ng/mL，外標法定量分析罌粟堿、那可丁、蒂巴因的線性濃度范圍為1～50 ng/mL，在線性范圍內峰面積與進樣濃度（ng/mL）間的相關系數(shù)均大于0.995。加標回收率為80%～110%，相對標準偏差小于10%，總體較已有部分方法有所改進[24,33]，可較好地滿足市場監(jiān)管的需要。

本方法的不足之處，為了消除基質的影響，采用內標法來對嗎啡和可待因進行測定，但一般來說內標難以獲得，且增加了分析費用，有待于進一步改進。

4 結論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質譜（UPLCMS/MS）聯(lián)用法檢測餐飲小龍蝦中嗎啡、可待因、那可丁、罌粟堿、蒂巴因5種生物堿的分析方法。利用QuEChERS前處理方法結合親水色譜柱（HILIC），操作簡單、迅速，方法的靈敏度高，準確度、重復性好，可以滿足市場監(jiān)管小龍蝦或其他蛋白質含量較高的樣品中罌粟殼生物堿殘留量的需要。