不同產(chǎn)地、不同提取方法對(duì)余甘子多酚含量及抗氧化活性的影響

李曉強(qiáng)，胡 坤，龔玉石，胡 勇，王 穎，郭 娟

（廣東藥科大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510006）

余甘子（Phyllanthus emblicaL.）是一種熱帶、亞熱帶落葉灌木或小喬木，屬大戟科（Euphorbiaceae）葉下球?qū)伲≒hyllanthus），果實(shí)呈球形，淺綠色，光滑而堅(jiān)硬，俗名滇橄欖、油甘子、庵摩勒、庵婆羅果、喉甘子等，主要生長(zhǎng)在熱帶、亞熱帶地區(qū)，印度和中國(guó)產(chǎn)量最高，是聯(lián)合國(guó)衛(wèi)生組織指定在全世界推廣種植的三種保健植物之一，也是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)林果[1]。余甘子果實(shí)可加工制作成營(yíng)養(yǎng)保健品、藥品、飲料、喉片等，具有清熱止咳、健胃消食等功效[2-4]，這是因?yàn)橛喔首庸麑?shí)中含有大量生物活性成分，例如多酚類、萜類、黃酮類物質(zhì)，其中多酚含量較高[5]，且具有廣泛的生理功效，例如抗氧化、抗腫瘤、降血脂、保肝、提高免疫力、抗衰老等[6-8]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)余甘子多酚的研究主要集中在提取方法的優(yōu)化、多酚成分分析、功能活性研究等方面[9-11]，對(duì)于不同產(chǎn)地和不同方法提取所得余甘子多酚在含量和抗氧化活性方面的比較研究相對(duì)較少，然而這正是研究開發(fā)余甘子多酚的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，不僅可為余甘子果實(shí)中多酚的提取提供產(chǎn)地和提取方法的參考，還有助于余甘子的進(jìn)一步研究，例如產(chǎn)地是如何影響余甘子果實(shí)中多酚含量及其抗氧化活性的，提取方法能否進(jìn)一步優(yōu)化，以及對(duì)多酚的其它生物活性有無影響等。

本文通過對(duì)不同產(chǎn)地和不同方法提取所得余甘子多酚的含量和抗氧化活性進(jìn)行研究，揭示不同產(chǎn)地和不同提取方法對(duì)余甘子多酚含量和抗氧化活性的影響，旨在為我國(guó)余甘子開發(fā)利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

余甘子粉 于2022年10月收取廣東、廣西、福建、云南、海南產(chǎn)的新鮮余甘子果，經(jīng)清洗、去核、榨汁、干燥、粉碎、過40目篩后制成粉末；沒食子酸

純度大于98%，Sigma公司；1,1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH） 純度大于96%，Aladdin Chemistry Co., Ltd；2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS） 純度大于98%，Tci；無水乙醇、福林酚試劑、碳酸鈉 分析純，廣州化學(xué)試劑廠；水楊酸分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；硫酸亞鐵分析純，天津市福晨化學(xué)試劑有限公司；過氧化氫分析純，天津市百世化工有限公司。

JYL-C012型組織搗碎機(jī) 山東九陽公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；721N紫外可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；EM7KCGW3-NR微波爐 廣東美的廚房電器制造公司；KQ-600DE超聲波提取器 昆山市超聲儀器有限公司；亞臨界水提取器 自制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同產(chǎn)地余甘子中多酚的提取 參考文獻(xiàn)[12]溶劑浸提法并稍加改動(dòng)：分別取5個(gè)不同產(chǎn)地的余甘子粉各5.0 g，分別加入150 mL 60%乙醇溶液，于60 ℃水浴中浸提80 min，過濾，復(fù)提一次，取濾液1 mL，蒸餾水稀釋100倍，作為樣品溶液。

1.2.2 不同提取方法提取余甘子中多酚 微波-熱水浸提法：稱取云南所產(chǎn)余甘子粉5.0 g，加入100 mL超純水，560 W微波處理3 min，再用50 ℃水浴浸提6 min后取出，抽濾后殘?jiān)瓷鲜鰲l件復(fù)提1次，合并濾液待用[13]。

溶劑浸提法：參考文獻(xiàn)[12]溶劑浸提法并稍加改動(dòng)。稱取云南所產(chǎn)余甘子粉5.0 g，加入150 mL 60%乙醇溶液，于60 ℃水浴中浸提80 min，過濾，復(fù)提一次，取濾液1 mL，蒸餾水稀釋100倍，作為樣品溶液。

超聲波提取法：稱取云南所產(chǎn)余甘子粉5.0 g，加入100 mL 70%乙醇溶液，于300 W超聲處理90 min，抽濾后濾渣復(fù)提1次，合并濾液待用[14]。

微波提取法：稱取云南所產(chǎn)余甘子粉5.0 g，于100 mL，70%乙醇溶液中，設(shè)定微波功率210 W進(jìn)行100 s微波處理，真空抽濾后重復(fù)提取1次，合并濾液得到余甘子提取液[15]。

亞臨界水提取法：參考文獻(xiàn)[16]稱取云南所產(chǎn)余甘子粉5.0 g 于高壓反應(yīng)釜內(nèi)，加入80 mL蒸餾水，200 ℃、200 r/min萃取10 min，快速冷卻，抽濾，離心得余甘子提取液。

1.2.3 多酚含量的測(cè)定 多酚含量測(cè)定采用Folinciocalteu法[17-18]。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，取不同濃度沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10 mL比色管中，加入福林試劑1.0 mL，充分震蕩后靜置4 min，加入10%Na2CO3溶液1.0 mL，混勻，蒸餾水定容，30 ℃恒溫水浴避光反應(yīng)2 h，在765 nm 處測(cè)吸光值，同時(shí)做試劑空白，以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取樣品液0.1 mL于10 mL比色管中，按上述實(shí)驗(yàn)方法在765 nm處測(cè)樣品的吸光度值（A），計(jì)算樣品中的多酚含量，多酚含量用mg GAE/g余甘子粉來表示。計(jì)算公式如下：

式中：A為沒食子酸濃度（mg/mL）；V為定容后體積（mL）；m為原料樣品質(zhì)量（g）。

1.2.4 抗氧化活性分析

1.2.4.1 DPPH·清除率的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[19]的方法略作修改，取0.02 mL樣品液及0.5 mmol/L的DPPH溶液3 mL于同一具塞比色管中，搖勻，37 ℃恒溫水浴避光靜置15 min，以無水乙醇為空白在517 nm處測(cè)得吸光度Ai，以0.02 mL樣品液和3 mL乙醇在517 nm處測(cè)得吸光度Aj，以3 mL DPPH和0.02 mL乙醇在517 nm處測(cè)得吸光度A0。DPPH·清除率的計(jì)算公式如下：

式中：Ai為加入樣品之后的吸光度；Aj為同體積無水乙醇代替DPPH溶液所測(cè)的吸光度；A0為同體積無水乙醇代替樣品溶液的空白對(duì)照組的吸光度。

1.2.4.2 ABTS+自由基清除率的測(cè)定 參見文獻(xiàn)[20]的測(cè)定方法進(jìn)行，將7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L K2S2O8溶液等體積混合，室溫避光靜置一夜，使用前用pH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋，使其吸光度值在734 nm波長(zhǎng)達(dá)0.70±0.02，即為ABTS工作液。將樣品提取液經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶荻认♂尯?，精確吸取10 μL于10 mL比色管中，加入ABTS工作液3.0 mL，室溫下避光靜置6 min，于734 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值（Ai），以PBS緩沖液代替ABTS工作液測(cè)定對(duì)照吸光度（Aj），以超純水代替樣品測(cè)定空白吸光度值（A0），用PBS緩沖液調(diào)零。ABTS+自由基清除率的計(jì)算公式如下：

式中：Ai為加樣之后所測(cè)的吸光度；Aj為同體積PBS緩沖液代替ABTS工作液所測(cè)的吸光度；A0為同體積超純水代替樣品液的空白對(duì)照組的吸光度。

1.2.4.3 ·OH清除率的測(cè)定 采用水楊酸滴定法[21]，先向試管中加入9 mmol/L的水楊酸和9 mmol/L的FeSO4各1 mL，再加入2 mL樣品液，最后加入1 mL濃度為9.8 mmol/L的H2O2進(jìn)行顯色反應(yīng)，混合搖勻后于37 ℃水浴反應(yīng)30 min，在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定混合物的吸光值（Ai）。用超純水代替H2O2溶液測(cè)得對(duì)照吸光值（Aj）。用45%乙醇溶液代替樣品測(cè)得吸光值（A0）?！H清除率的計(jì)算公式如下：

式中：Ai為加樣之后所測(cè)的吸光度；Aj為同體積超純水代替H2O2溶液所測(cè)的吸光度；A0為同體積45%乙醇溶液代替樣品液所測(cè)的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示，采用Origin 2021軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，平均值的差異性用單因素方差分析法進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 余甘子多酚含量比較

2.1.1 不同產(chǎn)地余甘子提取所得多酚含量的比較由圖1可以看出，不同產(chǎn)地余甘子提取所得多酚在含量上有顯著（P＜0.05）差異，按含量由多到少排序?yàn)椋涸颇希靖＝ǎ緩V西＞海南＞廣東，其中云南所產(chǎn)余甘子提取所得多酚含量為345.24 mg GAE/g，廣西為242.86 mg GAE/g，福建為260.25 mg GAE/g，海南為212.73 mg GAE/g，廣東所產(chǎn)余甘子提取所得多酚含量最低，為198.83 mg GAE/g，云南所產(chǎn)余甘子提取所得多酚含量為廣東的1.7倍，這種差異的存在可能與余甘子本身的生長(zhǎng)環(huán)境、品種等因素有關(guān)，即便是同一產(chǎn)地，栽培方式不同，多酚含量也會(huì)不同，劉曉麗等[22]研究發(fā)現(xiàn)廣東栽培余甘子和野生余甘子提取所得多酚含量分別為185.13和204.15 mg GAE/g。Li等[23]比較了廣東（云浮、普寧、汕頭），廣西（南寧、梧州），福建（泉州、漳州），云南（楚雄、大理、保山）共10個(gè)不同產(chǎn)地所產(chǎn)余甘子提取所得多酚含量，并建立了簡(jiǎn)便、可靠的高效液相指紋圖譜分析方法，發(fā)現(xiàn)云南所產(chǎn)余甘子提取所得多酚含量較高，與本研究結(jié)論一致。

圖1 不同產(chǎn)地余甘子提取所得多酚含量的比較Fig.1 Comparison of polyphenols extracted from Phyllanthus emblica from different habitats

2.1.2 不同提取方法對(duì)余甘子多酚含量的比較 由圖2可以看出，不同方法提取所得余甘子多酚含量有所不同，按含量由多到少排序?yàn)椋簛喤R界水提取法＞溶劑浸提法＞超聲波提取法＞微波-熱水提取法＞微波提取法。其中亞臨界水提取所得多酚含量為387.33 mg GAE/g，溶劑浸提為321.34 mg GAE/g，超聲波為276.72 mg GAE/g，微波-熱水為274.56 mg GAE/g，微波為223.58 mg GAE/g，亞臨界水提取所得多酚含量顯著（P＜0.05）高于其它四種提取方法，是由于水在亞臨界狀態(tài)下具有高濃度的離子積，可以作為酸堿催化劑催化相關(guān)反應(yīng)，并且隨著水的粘度和表面張力降低，使提取過程中介質(zhì)的滲透能力增強(qiáng)，提高了基質(zhì)在溶劑中的擴(kuò)散系數(shù)和傳質(zhì)效果，這些因素使得亞臨界水提取極性和非極性多酚的能力大大增強(qiáng)，從而提高了多酚的提取率[24]。溶劑浸提法、微波提取法和超聲波提取法是用乙醇作為溶劑，可能會(huì)導(dǎo)致某些不溶于乙醇的多酚成分無法被提出，并且超聲波可能會(huì)破壞多酚成分；微波-熱水提取法用50 ℃熱水提取，可能會(huì)導(dǎo)致某些水溶性較差的多酚溶解度減小，從而導(dǎo)致提取所得多酚含量降低。大量研究表明，亞臨界水能提高多種植物中的多酚提取率，是一種高效的提取多酚的方法[25-26]。

圖2 不同方法提取所得余甘子多酚含量的比較Fig.2 Comparison of polyphenols content of Phyllanthus emblica extracted by different methods

2.2 余甘子多酚的抗氧化活性

2.2.1 余甘子多酚對(duì)DPPH·的清除能力 由圖3可以看出，不同產(chǎn)地余甘子提取所得多酚對(duì)DPPH·的清除率都較高，都在70%以上，但不同產(chǎn)地之間存在差異，其中福建所產(chǎn)余甘子提取所得多酚對(duì)DPPH·的清除率最高，達(dá)89.26%，廣西為83.63%，廣東為79.15%，海南為74.36%，云南所產(chǎn)余甘子提取所得多酚對(duì)DPPH·的清除率最低，為70.01%，這可能與不同產(chǎn)地余甘子提取所得多酚的組成成分有關(guān)，植物多酚是一類分子中具有多個(gè)羥基酚類的植物成分的總稱，其中多酚的結(jié)構(gòu)、組成不同其抗氧化活性也就不同。由圖4可以看出，不同方法提取所得余甘子多酚對(duì)DPPH·的清除率不同，其中亞臨界水法提取所得余甘子多酚對(duì)DPPH·的清除率最高（多酚濃度10～60 μg/mL，清除率從23.72%上升至95.05%），超聲波提取所得余甘子多酚對(duì)DPPH·的清除率最低（多酚濃度10～60 μg/mL，清除率從12.26%上升至70.32%）。這可能是由于不同方法的提取原理不同，導(dǎo)致所提取多酚成分不同，從而導(dǎo)致多酚對(duì)自由基清除能力不同。超聲波是利用聲空化作用將樣品擊碎，同時(shí)超聲波產(chǎn)生的振動(dòng)作用加強(qiáng)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散和溶解；亞臨界水提取是通過調(diào)節(jié)溫度和壓力改變水的性質(zhì)從而實(shí)現(xiàn)更高溫度條件下的選擇性提取，提取組分的純度更高。余甘子提取物中主要以酚類物質(zhì)為主，酚類物質(zhì)中的酚羥基提供的電子和DPPH·中的孤對(duì)電子有效結(jié)合，從而清除DPPH·。可以看出，隨多酚濃度的增大，其對(duì)DPPH·的清除能力明顯增強(qiáng)，濃度和清除率呈現(xiàn)較為明顯的量效關(guān)系。計(jì)算得到亞臨界水、微波-熱水、溶劑浸提、微波、超聲波5種方法所提的余甘子多酚對(duì)DPPH·清除率的IC50分別為24.47、33.58、36.15、39.12、40.54 μg/mL，可以看出亞臨界水提取所得多酚對(duì)DPPH·清除率明顯強(qiáng)于其他方法。

圖3 不同產(chǎn)地余甘子提取所得多酚對(duì)DPPH·的清除能力Fig.3 DPPH· scavenging ability of polyphenols extracted from Phyllanthus emblica from different habitats

圖4 不同方法提取所得余甘子多酚對(duì)DPPH·的清除能力Fig.4 DPPH· scavenging ability of Phyllanthus emblica polyphenols extracted by different methods

2.2.2 余甘子多酚對(duì)ABTS+自由基的清除能力 由圖5可以看出，不同產(chǎn)地余甘子提取所得多酚對(duì)ABTS+自由基的清除率均很高，在97%以上，但不同產(chǎn)地之間清除率的差異并不顯著，其中云南所產(chǎn)余甘子提取所得多酚對(duì)ABTS+自由基的清除率略高于其它地區(qū)，為98.66%。由圖6可知，不同方法提取所得的余甘子多酚對(duì)ABTS+自由基的清除率不同，其中亞臨界水提取所得余甘子多酚對(duì)ABTS+自由基的清除率最高（多酚濃度10～60 μg/mL，清除率從21.16%上升至97.44%），溶劑浸提法提取所得余甘子多酚對(duì)ABTS+自由基的清除率最低（多酚濃度10～60 μg/mL，清除率從13.20%上升至74.23%），這可能與不同方法所提多酚成分和含量不同有關(guān)，可以看出多酚濃度與ABTS+自由基清除率呈現(xiàn)較明顯的量效關(guān)系。計(jì)算得到亞臨界水、微波-熱水、溶劑浸提、微波、超聲波5種方法所提的余甘子多酚對(duì)ABTS+自由基清除率的IC50分別為26.89、39.32、47.33、34.24、35.66 μg/mL，可以看出亞臨界水提取所得多酚對(duì)ABTS+自由基的清除率明顯強(qiáng)于其他方法。

圖5 不同產(chǎn)地余甘子提取所得多酚對(duì)ABTS+自由基的清除能力Fig.5 Scavenging effect of polyphenols extracted from Phyllanthus emblica from different habitats on ABTS+ radical

圖6 不同方法提取所得余甘子多酚對(duì)ABTS+自由基的清除能力Fig.6 Scavenging effect of Phyllanthus emblica polyphenols extracted by different methods on ABTS+ radical

2.2.3 余甘子多酚對(duì)·OH的清除能力 由圖7可以看出，不同產(chǎn)地余甘子提取所得多酚對(duì)·OH的清除率有顯著差異，按清除率由高到低排序?yàn)椋涸颇希靖＝ǎ竞Ｄ希緩V西＞廣東，其中云南所產(chǎn)余甘子提取所得多酚對(duì)·OH的清除率最高，達(dá)85.89%，福建為73.39%，海南為67.73%，廣西為62.12%，廣東為50.3%。由圖8可知，不同方法提取所得的余甘子多酚對(duì)·OH的清除率存在差異，其中亞臨界水提取所得的余甘子多酚對(duì)·OH的清除率最高（多酚濃度50～350 μg/mL，清除率從29.12%上升至96.81%）。溶劑浸提法提取的余甘子多酚對(duì)·OH的清除率最低（多酚濃度50～350 μg/mL時(shí)，清除率從15.37%上升至80.22%），可以看出，隨著多酚濃度增大，不同方法提取所得余甘子多酚對(duì)·OH清除能力明顯增強(qiáng)，清除率與濃度呈較明顯量效關(guān)系。計(jì)算得到亞臨界水、微波-熱水、溶劑浸提、微波、超聲波5種方法所提的余甘子多酚對(duì)·OH的清除率的IC50分別為122.41、191.34、213.52、205.66、190.83 μg/mL，可以看出亞臨界水提取所得多酚對(duì)·OH的清除率明顯強(qiáng)于其他方法。

圖7 不同產(chǎn)地余甘子提取所得多酚對(duì)·OH的清除能力Fig.7 ·OH scavenging ability of polyphenols extracted from Phyllanthus emblica from different habitats

圖8 不同方法提取所得余甘子多酚對(duì)·OH的清除能力Fig.8 ·OH scavenging ability of Phyllanthus emblica polyphenols extracted by different methods

綜上所述，在所研究的5種提取方法中，亞臨界水提取所得多酚在含量和抗氧化活性上都優(yōu)于其他方法，唐仕榮等[27-28]采用溶劑回流、超聲波、微波、超聲波微波協(xié)同萃取和亞臨界水萃取多酚時(shí)也發(fā)現(xiàn)亞臨界水法所提多酚含量較高，且所提多酚抗氧化活性能力較強(qiáng)，和本文研究結(jié)論相符。

2.3 多酚含量與自由基清除能力的相關(guān)性分析

2.3.1 不同產(chǎn)地余甘子提取物多酚含量與自由基清除能力的相關(guān)性 本文分析了不同產(chǎn)地余甘子提取所得多酚含量與自由基清除能力的相關(guān)性，如表1所示，不同產(chǎn)地余甘子提取所得多酚含量與DPPH·、·OH和ABTS+自由基清除率顯著正相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)分別為0.953、0.992和0.841，表明多酚含量越高，對(duì)DPPH·、·OH和ABTS+自由基清除率越高，表明多酚類化合物是余甘子清除DPPH·、·OH和ABTS+自由基的重要功效成分，因產(chǎn)地不同，提取所得多酚含量就不同，因此對(duì)自由基清除能力也不同。

表1 不同產(chǎn)地余甘子提取所得多酚含量與自由基清除能力的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between polyphenol content and free radical scavenging ability of Phyllanthus emblica from different habitats

2.3.2 不同方法提取所得余甘子提取物多酚含量與自由基清除能力的相關(guān)性 如表2所示，不同方法提取所得余甘子多酚含量與DPPH·、·OH 和ABTS+自由基清除率呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)分別為0.995、0.998、0.992；由于不同方法提取所得多酚含量差異顯著，因此，當(dāng)選用不同的提取方法時(shí)，所得多酚含量會(huì)有所不同，從而導(dǎo)致自由基清除率不同，采用所得多酚含量越高的提取方法，得到多酚對(duì)DPPH·、·OH和ABTS+自由基清除率也會(huì)越高。

表2 不同方法提取所得余甘子多酚含量與自由基清除能力的相關(guān)性分析Table 2 Analysis of correlation between polyphenols content and free radical scavenging ability of Phyllanthus emblica extracted by different methods

3 結(jié)論

本文選取廣東、廣西、福建、云南、海南5個(gè)不同產(chǎn)地和微波-熱水浸提、溶劑浸提、超聲波、微波和亞臨界水5 種不同提取方法，比較不同產(chǎn)地和不同提取方法對(duì)余甘子多酚含量和抗氧化活性的影響。結(jié)果表明，產(chǎn)地不同和提取方法不同對(duì)多酚的提取效果也不同，按含量由高到低排序?yàn)椋涸颇希靖＝ǎ緩V西＞海南＞廣東，亞臨界水提取法＞溶劑浸提法＞超聲波提取法＞微波-熱水提取法＞微波提取法。DPPH·、·OH和ABTS+自由基清除試驗(yàn)表明，余甘子多酚具有良好的清除自由基作用，清除率與多酚濃度呈明顯的量效關(guān)系，其中亞臨界水提取所得多酚的自由基清除率最高。余甘子含有豐富的生物活性物質(zhì)以及諸多的生理功效，且我國(guó)余甘子資源豐富，本文僅對(duì)部分產(chǎn)地和不同方法提取所得余甘子多酚的含量和抗氧化活性進(jìn)行了研究，對(duì)于產(chǎn)地自然環(huán)境對(duì)余甘子多酚含量及生物活性的影響機(jī)制以及不同方法提取所得多酚的具體組成成分和各種成分的生理功效還有待進(jìn)一步研究。